TR3受體激動劑6-mercaptopurine對糖尿病ApoE-/-小鼠NF-κB p65/CylinD1通路影響及其與抗動脈硬化關系

李晶晶，祖 磊，薛鵬程

血脂代謝異常在動脈粥樣硬化中的重要作用已被證實。研究[1]表明，血脂水平異常升高促進脂質(zhì)沉積，并在動脈粥樣硬化的形成及粥樣斑塊發(fā)展進程具有重要作用。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)缺陷小鼠是目前通過基因敲除手段研究血脂代謝紊亂形成動脈硬化動物模型，最新研究[2]發(fā)現(xiàn)糖尿病可進一步誘發(fā)ApoE-/-小鼠血脂代謝紊亂，加重動脈硬化發(fā)生。TR3受體作為孤核受體超家族的成員，介導了許多種激素、維生素和藥物細胞生物學效應[3]。有研究[4]顯示TR3受體激活后增加糖尿病病人對胰島素敏感性，加速血糖代謝，降低血糖水平，減輕糖尿病糖代謝性疾??；也有研究發(fā)現(xiàn)TR3受體可降低細胞增殖核轉錄因子-κB(NF-κB)/ 細胞周期蛋白D1(cylinD1)蛋白表達，抑制細胞增殖；在動脈粥樣硬化斑塊中發(fā)現(xiàn)斑塊組織NF-κB/cylinD1蛋白表達水平增高，同時動脈硬化斑塊周圍平滑肌層細胞增生明顯，降低NF-κB p65/CylinD1表達，斑塊周圍增生細胞明顯減少，減緩動脈粥樣斑塊的形成[5]。因此我們認為TR3受體對糖尿病ApoE-/-小鼠血脂代謝、細胞增殖調(diào)控NF-κB/CylinD1通路與動脈硬化斑塊形成與發(fā)展有密切相關，本研究將觀察TR3受體激動劑(6-mercaptopurine，6-MP)對糖尿病ApoE-/-小鼠糖脂代謝及NF-κB p65/CylinD1通路的影響，探討TR3受體激動劑改善糖尿病動脈粥樣硬化可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 ApoE-/-小鼠(SPF級)購于北京大學醫(yī)學部，鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、6-MP(Sigma公司)，β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體、NF-κB p65/CylinD1一抗(CST公司)，HRP標記二抗(北京中杉公司)，丙烯酰胺、Tris-base(Ameresco)，PVDF膜(millipore公司)，免疫印跡化學發(fā)光試劑(Santa Cruz公司)。

1.2 動物分組 8周齡SPF級雄性ApoE-/-小鼠，體質(zhì)量(23±2)g，飼養(yǎng)條件，室溫(22±2)℃，濕度(55±5)%，人工光照明暗各12 h/d，24 h自由取食飲水，飼料由上海斯萊克公司提供。隨機選取10只ApoE-/-小鼠為對照組(ApoE-/-組)，糖尿病小鼠30只，隨機抽樣法分為3組(每組10只)。實驗動物共分為4組：ApoE-/-組(n=10)，STZ+ApoE-/-組(n=10)，STZ+ApoE-/-+6-MP 2.5 mg·kg-1·d-1組(n=10)，STZ+ApoE-/-+6-MP 5 mg·kg-1·d-1(n=10)。將6-MP溶于0.9%氯化鈉溶液中，腹腔注射法給藥，1次/天，連續(xù)8周，其余各組動物均用等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，1次/天。

1.3 ApoE-/-小鼠腹腔注射STZ建立糖尿病動脈粥樣硬化模型 STZ配制：檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L，pH 4.4)10 mL加100 mg STZ充分溶解(STZ濃度：10 mg/mL)，所有動物禁食12 h，于腹腔注射STZ：檸檬酸溶液0.01 mL/g，給藥后立即給予飼料自由取食，3 d后測定小鼠空腹血糖，動物血糖水平于12～25 mmol/L用于本試驗。

1.4 HE染色 取小鼠胸主動脈弓下0.5 cm，PBS漂洗2～3次，10%甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色，中性樹脂封片，胸主動脈內(nèi)膜斑塊面積采用自動成像分析軟件系統(tǒng)(Olympus,Japan)分析，求斑塊面積平均值。

1.5 Western-blotting測小鼠胸主動脈NF-κB p65/CylinD1蛋白表達 小鼠胸主動脈總蛋白提?。喝⌒∈笮刂鲃用}弓約1 cm，去除血管外膜結締組織，0.9%氯化鈉溶液漂洗1～2次，加0.5 mL RIPA裂解緩沖液[含0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris.Cl pH7.6，0.001 mol/L EDTA，100 mmol/L DTT，1 μg/mL抑肽酶(1∶100)，100 μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)]勻漿，加入0.5 mL 2×SDS上樣緩沖液，劇烈震蕩15 s,-80 ℃冰箱凍融2次，100 ℃水浴10 min，12 000 g，4 ℃離心，取上清，凝膠電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影等步驟。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 TR3受體激動劑 6-MP對糖尿病ApoE-/-小鼠血糖的影響 與ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-組小鼠空腹血糖水平顯著升高(P<0.01)；TR3受體激動劑6-MP可呈劑量依賴性降低糖尿病ApoE-/-小鼠空腹血糖水平(P<0.01)，與STZ-ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-+6-MP5組小鼠空腹血糖水平顯著降低(P<0.01)，STZ-ApoE-/-+6-MP 10組空腹血糖水平進一步降低(P<0.01)(見表1)。

分組n血糖/(mmol/L)ApoE-/-組106.91±0.69STZ-ApoE-/-組1018.68±2.30??STZ-ApoE-/-+6-MP5組1015.42±2.68??#STZ-ApoE-/-+6-MP10組1013.64±1.95??##F—40.07P—<0.01MS組內(nèi)—3.090

q檢驗：與ApoE-/-組比較**P<0.01;與STZ-ApoE組比較#P<0.05,##P<0.01

2.2 TR3受體激動劑 6-MP對糖尿病ApoE-/-小鼠血脂代謝的影響 與ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-組小鼠空腹總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)顯著升高(P<0.01)，2組間高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和三酰甘油(TG)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，TR3受體激動劑 6-MP呈劑量依賴性降低糖尿病ApoE-/-組小鼠空腹TC、LDL-C、TG水平；與STZ-ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-+6-MP 5組小鼠空腹血脂TC、LDL-C、TG水平均顯著降低(P<0.01)，STZ-ApoE-/-+6-MP10組空腹血脂TC、LDL-C、TG進一步降低(P<0.01)；STZ-ApoE-/-組、STZ-ApoE-/-+6-MP5及STZ-ApoE-/-+6-MP10三組HDL-C差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2)。

2.3 TR3受體激動劑 6-MP對糖尿病ApoE-/-小鼠胸主動脈NF-κB p65、CylinD1蛋白表達的影響 與C57組相比，ApoE-/-組小鼠肝臟FGF21 mRNA及蛋白表達水平均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-組小鼠肝臟FGF21 mRNA、蛋白及血清FGF21水平均明顯增高(P<0.01)；FGF21 miRNA可顯著降低糖尿病ApoE-/-小鼠肝臟FGF21 mRNA、蛋白及血清FGF21水平(P<0.05)(見圖1、表3)。

2.4 TR3受體激動劑 6-MP對糖尿病ApoE-/-小鼠胸主動脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積的影響 ApoE-/-組胸主動脈血管內(nèi)膜有少量小團塊狀紅染脂質(zhì)，STZ-ApoE-/-組胸主動脈血管內(nèi)膜有片狀團塊狀紅染脂質(zhì)；STZ-ApoE-/-+6-MP5組或STZ-ApoE-/-+6-MP10組胸主動脈血管內(nèi)膜少量小片狀紅染脂質(zhì)(見圖2)。

2.5 TR3受體激動劑 6-MP對糖尿病ApoE-/-小鼠胸主動脈內(nèi)膜粥樣斑塊形成的影響 ApoE-/-組主動脈血管內(nèi)膜可見小硬化斑塊，斑塊底部血管增厚；STZ-ApoE-/-組胸主動脈內(nèi)膜可見巨大斑塊突起，斑塊中央有空洞形成，斑塊底部血管增厚且不規(guī)則，斑塊空腔周圍可見大量細胞增生；STZ-ApoE-/-+6-MP5組主動脈血管內(nèi)膜硬化斑塊斑塊較小，斑塊中央空洞較小，斑塊底部及周圍有少量增生組織；STZ-ApoE-/-+6-MP5組胸主動脈內(nèi)膜只見小硬化斑塊隆起，斑塊底部及周圍有少量增生組織(見圖3)。

表2 TR3受體激動劑 6-MP對糖尿病ApoE-/-小鼠血糖和血脂的影響

q檢驗：與ApoE-/-組比較*P<0.05，**P<0.01 ；與STZ-ApoE-/-組比較#P<0.05，##P<0.01

分組nNF-κB p65Cylin D1 ApoE-/-組100.053±0.0080.234±0.026STZ-ApoE-/-組100.358±0.046??0.617±0.107??STZ-ApoE-/-+6-MP5組100.213±0.025??##0.226±0.031##STZ-ApoE-/-+6-MP10 組100.022±0.003??##0.109±0.013??##F—343.51147.62P—<0.01<0.01MS組內(nèi)—0.0010.003

注：蛋白印跡電泳膠片條帶光密度(OD值)分析，NF-κB p65或CylinD1/β-actin光密度比值表示目的蛋白表達水平。q檢驗：與ApoE-/-組比較*P<0.05，**P<0.01；與STZ-ApoE-/-組比較#P<0.05，##P<0.01

斑塊面積分析：與ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-組胸主動脈血管內(nèi)膜斑塊面積明顯增加(P<0.05)；TR3受體激動劑 6-MP可呈劑量依賴的方式抑制STZ誘導的糖尿病ApoE-/-小鼠胸主動脈硬化斑塊增加，與STZ-ApoE-/-組相比STZ-ApoE-/-+6-MP 5組胸主動脈內(nèi)膜斑塊面積明顯降低(P<0.05)；STZ-ApoE-/-+6-MP10組與STZ-ApoE-/-+6-MP 5組之間斑塊面積差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表4)。

分組n斑塊面積/μm2ApoE-/-組10123.56±15.38STZ-ApoE-/-組10245.16±30.29??STZ-ApoE-/-+6-MP5組10172.43±20.55??##STZ-ApoE-/-+6-MP10 組10154.09±18.73??##F—55.40P—<0.01MS組內(nèi)—481.786

q檢驗：與ApoE-/-組比較*P<0.05，**P<0.01 ；STZ-ApoE-/-組比較#P<0.05，##P<0.01

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，鏈尿左菌素誘導ApoE-/-小鼠血糖水平升高，血脂代謝進一步異常，胸主動脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積與斑塊面積也顯著增加，說明糖尿病可導致血脂紊亂，加速ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進展。即往研究已證實糖尿病是冠心病重要危險因素，其對動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展及預后均起著至關重要的作用[6-7]；本研究又觀察到用TR3受體激動劑6-MP治療的STZ誘導糖尿病ApoE-/-小鼠可降低血糖水平，改善血脂代謝，減少胸主動脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積及斑塊面積，說明TR3受體激動劑6-MP可改善糖尿病ApoE-/-小鼠糖脂代謝，減緩糖尿病誘導動脈粥樣硬化發(fā)展。在TR3受體激動劑6-MP抑制平滑肌細胞增殖的研究中已證實6-MP可以激活TR3進而抑制靜脈平滑肌細胞的過度增殖[8]。最近有相關研究又發(fā)現(xiàn)TR3核受體可與肝核受體LXR結合，促進肝細胞對糖的攝取，降低血糖水平[9-10]。也有研究[11]認為TR3核受體激活血脂的改善是由于血糖水平降低引起的，更有研究[12]認為TR3核受體可直接促進肝及脂肪組織脂質(zhì)轉化，減少糖尿病引起脂肪代謝紊亂。因此TR3核受體激激動劑被認為治療高血糖性代謝疾病藥物。我們研究還發(fā)現(xiàn)糖尿病ApoE-/-小鼠胸主動脈細胞周期調(diào)控蛋白NF-κBp65及Cylin D1表達水平顯著增加，胸主動脈斑塊周圍大量增生組織，說明糖尿病不但可誘發(fā)脂質(zhì)斑塊形成，同時可促進斑塊周圍組織細胞增生，并與糖尿病ApoE-/-小鼠NF-κB p65，Cylin D1高表達有關。相關動脈硬化的研究也證實動脈斑塊周圍組織增生與NF-κB p65，Cylin D1水平密切相關，認為巨噬細胞侵入動脈中膜形成泡沫細胞過程增加平滑肌層細胞NF-κB p65，Cylin D1表達水平，促進平滑肌細胞增殖，加速斑塊形成[13]。有研究認為NF-κB p65，Cylin D1增加導致平滑細胞增生具有穩(wěn)定斑塊作用[14]；也有研究認為NF-κB p65，Cylin D1也可促進斑塊底部平滑肌層增生可增斑塊破裂的風險[15]。本研究用TR3受體激動劑6-MP治療后發(fā)現(xiàn)6-MP可呈劑量依賴性抑制糖尿病誘導胸主動脈NF-κB p65，Cylin D1水平增加，同時斑塊周圍細胞增生層變薄，斑塊底增生組織減少，斑塊面積降低，說明TR3受體激動后可降低糖尿病誘導胸主動脈NF-κB p65、Cylin D1，減少斑塊周圍細胞增生，且這種作用可能是TR3受體通過調(diào)控NF-κB p65、Cylin D1表達抑制動脈斑塊的形成，減少動脈硬化的發(fā)生。即往大量研究認為動脈硬化的發(fā)生發(fā)展與平滑肌層泡沫細胞形成過程平滑肌細胞增生起至關重要作用[16]。近年來，有學者通過相關研究認為在早期動脈粥樣硬化抑制平滑細胞增生可阻止或延緩冠心病的發(fā)展[17]。有研究體外細胞試驗也發(fā)現(xiàn)抑制平滑肌細胞NF-κB p65，Cylin D1可降低平滑肌細胞增殖遷移[18]。

綜上所述，本研究結果發(fā)現(xiàn)TR3受體激動劑6-MP抗動脈粥樣硬化作用可能是通過降低糖尿病ApoE-/-小鼠血糖水平，改善血脂代謝，降低胸主動脈NF-κB p65、Cylin D1表達。