非編碼RNA在乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的相關(guān)研究

閆 雷，陳昌杰，楊清玲

乳腺癌是女性中常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)治療是目前主要的治療手段，但乳腺癌具有轉(zhuǎn)移性和侵襲性，患者很容易再次復(fù)發(fā)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是由EMT激活轉(zhuǎn)錄因子執(zhí)行的，向腫瘤細胞提供侵襲力和運動特性的關(guān)鍵過程，是乳腺癌轉(zhuǎn)移和耐藥的主要原因。非編碼RNA (non-coding RNA,ncRNA)是指一類不具有指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成功能的RNA，包括長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)以及環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)等，這些非編碼RNA通常在轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后水平參與腫瘤基因的表觀遺傳調(diào)控[1]。研究[2]證實ncRNA可以作為腫瘤抑制因子調(diào)控腫瘤基因的表達水平，其通過對腫瘤基因的調(diào)控作用抑制EMT進展可能會成為治療乳腺癌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文對目前較受關(guān)注的三類ncRNA與乳腺癌EMT相關(guān)研究進行匯總，以期為乳腺癌的治療探尋新的靶標和思路。

1 miRNA與乳腺癌EMT

EMT的發(fā)生是腫瘤侵襲的重要途徑，是一個復(fù)雜的過程，涉及腫瘤細胞或基質(zhì)細胞表達的許多分子，其中一個重要的調(diào)控分子是miRNA[3]。miRNA是從較長RNA轉(zhuǎn)錄體的莖環(huán)區(qū)加工而來的長度在22 nt左右的內(nèi)源性非編碼RNA，在不同的真核生物系中直接對靶基因進行轉(zhuǎn)錄后抑制[4]。

研究[5]發(fā)現(xiàn)miRNA在乳腺癌EMT以及EMT相關(guān)耐藥機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 IMANI等[6]研究表明微小RNA-34a(miR-34a)能夠通過調(diào)控NOTCH家族相關(guān)蛋白(Notch homolog 1,NOTCH1)、TWIST相關(guān)蛋白(Twist-related protein 1,TWIST1)和E盒結(jié)合鋅指蛋白(zinc-finger E-box binding homeobox 1,ZEB1)等轉(zhuǎn)錄因子的3′非翻譯區(qū)使EMT信號通路失活。此外，過表達miR-34a能夠抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。KONG等[7]研究發(fā)現(xiàn)過表達miR-3178能夠抑制三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)細胞的增殖、遷移以及EMT形成。此外，雙熒光素酶報告實驗證實NOTCH1是miR-3178的直接靶基因，實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative real time poly-merase chain reaction,qRT-PCR)和免疫印跡實驗(Western blotting)表明miR-3178通過靶向調(diào)控NOTCH1表達，從而抑制乳腺癌EMT形成。XIANG等[8]研究表明，巨核母細胞白血病/肌鈣素樣1(megakaryoblastic leukemia/myocardin-like1,MKL-1)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT 3)通過啟動子CArG box促進波形蛋白的表達。體外實驗證明MKL-1和STAT 3的協(xié)同作用誘導(dǎo)MCF-7細胞系發(fā)生EMT。熒光素酶報告實驗表明miR-93-5p能夠作用于MKL-1和STAT 3的3′非翻譯區(qū)，從而抑制乳腺癌EMT的形成。CHEN等[9]應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽法、劃痕實驗等體外實驗發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-199a-5p能夠抑制乳腺癌細胞系MDA-MB-231的增殖和創(chuàng)傷愈合能力，并能下調(diào)EMT相關(guān)基因表達。裸鼠成瘤實驗進一步證明過表達miR-199a-5p能夠抑制移植腫瘤的生長。CAI等[10]報道了在表達miR-374a的轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞中，Wnt/β-catenin信號通路活性升高。Western blotting和熒光素酶報告實驗證明miR-374a直接靶向抑制Wnt/β-catenin信號級聯(lián)的多個負調(diào)控因子，包括WIF 1、PTEN和Wnt5A，表明miR-374a維持Wnt/β-catenin信號通路是促進乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要過程，miR-374a可能會成為早期乳腺癌的治療靶點。這些研究表明miRNA能夠調(diào)控如NOTCH1、TWIST1、ZEB1、MKL-1和STAT 3等轉(zhuǎn)錄因子的3′非翻譯區(qū)使EMT相關(guān)信號通路失活；也可作用于某些信號通路如Wnt/β-catenin或通路級聯(lián)的負調(diào)控因子如WIF 1、PTEN和Wnt5A等調(diào)控乳腺癌EMT。

以上研究表明,miRNA在乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲以及EMT機制中發(fā)揮重要調(diào)控作用。隨著科研工作者們對miRNA調(diào)控EMT機制的不斷探索，相信miRNA將會成為診斷乳腺癌的新的標志物和潛在治療靶點。

2 lncRNA與乳腺癌EMT

lncRNA是一類長度超過200 nt的ncRNA分子，分布于細胞核和細胞質(zhì)中，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮重要調(diào)控作用[11]。近年來，高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展使得越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)，且已成為研究的熱點。lncRNA在乳腺癌EMT及耐藥的研究中占據(jù)越來越重要的地位，但其與乳腺癌EMT的機制研究尚不明確。根據(jù)lncRNA在乳腺癌EMT中的作用，可將其分為致癌lncRNA和抑癌lncRNA兩大類。以下主要介紹幾種與乳腺癌EMT相關(guān)的lncRNA，通過探究其在乳腺癌EMT中的作用機制，為乳腺癌的治療探尋潛在的分子靶點。

2.1 致癌lncRNA與乳腺癌EMT 已有研究[12-13]證實lncRNA H19對腫瘤的生長調(diào)控發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是誘導(dǎo)腫瘤EMT的主要影響因子，研究[14]發(fā)現(xiàn)在TGF-β誘導(dǎo)的EMT多重耐藥模型中H19的表達會升高，并且高表達出現(xiàn)在常見轉(zhuǎn)移部位。RICHARDS等[15]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HIT(HOXA transcript induced by TGF-β)通過抑制TGF-β表達從而抑制腫瘤EMT，提示lncRNA HIT很有可能成為乳腺癌EMT的治療靶點。XIAO等[16]發(fā)現(xiàn)敲除乳腺癌細胞系MDA-MB-231中的lncRNA UCA1(urothelial carcinoma-associated 1)后，該細胞系上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)表達明顯增加，而β-鏈蛋白(β-catenin)表達下降，表明lncRNA UCA1能夠參與乳腺癌EMT的進展。

此外，lncRNA也可以通過競爭結(jié)合miRNA調(diào)控乳腺癌EMT。KONG等[17]發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG15在乳腺癌組織和細胞系中表達明顯升高。下調(diào)SNHG15的表達能夠抑制乳腺癌細胞系MCF-7和BT-20的遷移、侵襲以及EMT形成。熒光素酶報告實驗表明SNHG15能與miR-211-3p直接發(fā)生相互作用。證明SNHG15作為一種ceRNA能競爭結(jié)合miR-211-3p促進乳腺癌EMT的進展。已證實腫瘤轉(zhuǎn)移的病理生理過程是由癌細胞的動態(tài)可塑性所介導(dǎo)的，EMT和間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化的相互轉(zhuǎn)換使得腫瘤在上皮和間質(zhì)表型之間進行轉(zhuǎn)移[18]。ZHOU等[18]通過建立小鼠自發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌模型，發(fā)現(xiàn)lncRNA H19能夠調(diào)控miR-200b/c靶點Git 2和Cyth 3的表達，表達產(chǎn)物是一種鳥苷三磷酸酶，能夠促進乳腺癌EMT相關(guān)細胞遷移。LI等[19]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1與miR-211之間能夠相互抑制，并且miR-211的下游靶標HMGA2是EMT的誘導(dǎo)劑，證明lncRNA NEAT1通過調(diào)節(jié)miR-211/HMGA2軸誘導(dǎo)乳腺癌EMT。

近年來，隨著生物信息技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)參與乳腺癌EMT的形成，如PTAR等[20-21]，這些致癌lncRNA與乳腺癌EMT的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。此外，科學家們還發(fā)現(xiàn)許多在乳腺癌EMT進展中發(fā)揮抑制作用的lncRNA。

2.2 抑癌lncRNA與乳腺癌EMT 目前，抑癌lncRNA作為調(diào)控乳腺癌EMT的研究熱點，為今后乳腺癌治療探尋新的分子靶標提供方向。WANG等[22]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-CTD-2108O9.1在乳腺癌組織和細胞中表達下調(diào)，表明lncRNA-CTD-2108O9.1通過靶向白血病抑制因子受體抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示過表達lncRNA-CTD-2108O9.1也能直接抑制Vimentin、β-catenin表達，進而拮抗乳腺癌EMT形成。DING等[23]應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)對36例乳腺癌組織標本中l(wèi)ncRNA GAS5表達進行定量分析，相比癌旁組織GAS5在乳腺癌組織中表達下調(diào)，且低表達GAS5與乳腺癌TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，干擾GAS5表達能促進乳腺癌細胞發(fā)生EMT表型改變。EZH2是一種重要的表觀遺傳調(diào)控因子，它能夠催化組蛋白H3的lys-27三甲基化，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。LI等[24]研究發(fā)現(xiàn)EZH2在包括乳腺癌在內(nèi)的許多實體腫瘤中均有高表達，并且能誘導(dǎo)腫瘤EMT。lncRNA ANCR能夠增強CDK1-EZH2的相互作用，從而促進EZH2泛素化，導(dǎo)致EZH2降解，腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制。TGF-β1能夠通過增加ANCR啟動子區(qū)HDAC3的富集而下調(diào)ANCR的表達，降低ANCR啟動子的H3和H4乙酰化。通過Western blotting和Transwell檢測發(fā)現(xiàn)，ANCR通過下調(diào)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(the runt-related transcription factors 2，RUNX2)的表達抑制TGF-β1誘導(dǎo)EMT形成，證明ANCR參與調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)EMT中的一個重要過程[25]。以上研究結(jié)果，表明ANCR有望在乳腺癌的診斷和預(yù)后中成為新的標志物和治療靶點。

近年來，科研工作者們發(fā)現(xiàn)抑癌lncRNA也可以通過ceRNA機制抑制乳腺癌EMT。LI等[26]應(yīng)用qRT-PCR和熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)GAS5與miR-196A-5p存在結(jié)構(gòu)互補序列，過表達GAS5能夠部分削弱miR-196A-5p引起的乳腺癌細胞侵襲作用，證實GAS5能夠競爭結(jié)合miR-196A-5p抑制TNBC的進展。SHI等[27]研究發(fā)現(xiàn)過表達lncRNA PTENP1能抑制乳腺癌細胞的遷移、侵襲以及集落形成能力。熒光素酶報告實驗表明PTENP1能夠通過ceRNA機制作用于miR-19b的3′非翻譯區(qū)，并通過PTEN-PI3K/Akt信號通路參與乳腺癌細胞的遷移、侵襲以及EMT的形成。以上研究表明lncRNA能夠通過調(diào)控E-cadherin、Vimentin、Snail等EMT相關(guān)標志蛋白的表達參與乳腺癌EMT；也能通過ceRNA機制競爭結(jié)合miRNA參與調(diào)控PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等信號通路影響乳腺癌EMT的進展。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學的發(fā)展，越來越多的lncRNA相繼被發(fā)現(xiàn)，相信未來lncRNA能夠成為治療乳腺癌的新型分子靶標。

3 circRNA與乳腺癌EMT

circRNA存在于自然界各種生物細胞中，由幾百個至幾千個核苷酸組成。與一般線性RNA結(jié)構(gòu)不同，circRNA是共價閉合環(huán)路所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由3′和5′(頭對尾)末端共價結(jié)合形成，不受核酸酶降解的影響，因此具有很強的穩(wěn)定性[28]。早期認為circRNA是基因表達的副產(chǎn)物，沒有生物學功能，目前已有大量研究[29-30]證實，circRNA能通過與miRNA或其他分子結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)基因表達。近年來研究[31]發(fā)現(xiàn)，circRNA在乳腺癌進展中發(fā)揮重要調(diào)控功能，但其在乳腺癌EMT中的作用機制還在探索當中。

LIAO等[32]于2017年首次報告了circRNA在乳腺癌EMT進展中發(fā)生變化，對TGF-β誘導(dǎo)乳腺癌EMT模型中的circRNA進行全轉(zhuǎn)錄組特異性RNA測序分析，發(fā)現(xiàn)約570種circRNA在乳腺癌EMT進程中至少發(fā)生2倍變化，表明這些circRNA可能參與乳腺癌EMT的調(diào)控。盡管有大量circRNA被報道出在各種轉(zhuǎn)換細胞中均被表達，但對它們的功能和調(diào)控方式還不清楚。YAN等[33]研究發(fā)現(xiàn)circVRK 1能抑制乳腺癌干細胞的擴張和自我更新能力，通過利用生物信息學方法構(gòu)建circRNA/miRNA網(wǎng)絡(luò)，證實circVRK 1可能作為ceRNA競爭結(jié)合miRNA，對乳腺癌干細胞的生長進行調(diào)控。LIANG等[34]應(yīng)用功能喪失實驗敲除circ-ABCB10后發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞增殖能力受到抑制。生物信息學預(yù)測軟件和熒光素酶報告實驗證明circ-ABCB10和miR-1271之間存在互補序列。補救實驗發(fā)現(xiàn)miR-1271能夠恢復(fù)circ-ABCB10對乳腺癌細胞的生物學功能，證實circ-ABCB10可以作為ceRNA競爭結(jié)合miR-1271參與調(diào)控乳腺癌增殖、遷移以及EMT。ZHOU等[35]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)hsa_circ_0011946的表達能夠抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。生物信息學軟件分析預(yù)測hsa_circ_0011946能夠結(jié)合miR- 26a/b并直接作用于復(fù)制因子c亞基3(replication factor C subunit 3，RFC3)，證明hsa_circ_0011946能通過miR-26a/b-RFC3軸參與乳腺癌遷移、侵襲以及EMT形成。體外實驗證明miR-7能作用于PI3K/ATK和Raf/MEK/ERK信號通路抑制HER2介導(dǎo)的乳腺癌，并且能夠逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥。ZHAO等[36]研究發(fā)現(xiàn)miR-7的環(huán)狀RNA海綿(circular RNA sponge for miR-7，ciRS-7)不僅能通過“miRNA海綿”作用參與miR-7的表達調(diào)控誘導(dǎo)乳腺癌EMT，ciRS-7還可能具有潛在的RNA干擾(RNA interference,RNAi)功能，通過RNAi作用機制導(dǎo)致基因沉默從而誘導(dǎo)乳腺癌EMT形成。重建circRNA-miRNA之間的平衡可能會對乳腺癌EMT的治療提供新的思路。

以上研究表明，circRNA能夠通過ceRNA機制競爭結(jié)合miRNA參與調(diào)控乳腺癌EMT，也能發(fā)揮RNAi功能導(dǎo)致基因沉默誘導(dǎo)乳腺癌EMT形成。學者們對circRNA的研究為乳腺癌EMT的發(fā)病機制提供新的認識，相信隨著分子生物學的不斷發(fā)展，circRNA在乳腺癌中的作用機制會不斷被闡明，未來circRNA可能會成為診斷乳腺癌EMT新的標志物和分子治療靶點。

4 小結(jié)與展望

EMT是一個多基因參與的復(fù)雜生物學過程，在乳腺癌轉(zhuǎn)移和耐藥中發(fā)揮重要調(diào)控作用，ncRNA調(diào)控乳腺癌EMT研究成果令人矚目，但其具體機制亟待闡明。ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作為一種全新的基因表達調(diào)控模式，突顯出ncRNA的協(xié)同作用在調(diào)控EMT進展中的重要性，為科研工作者們提供一個全新視角進行EMT機制研究。目前對ncRNA的研究還處于初期階段，許多ncRNA結(jié)構(gòu)和功能還不完全清楚，作用機制尚未明確，設(shè)計出有效的靶向ncRNA分子抑制乳腺癌EMT是一個有挑戰(zhàn)性的難題。隨著生物信息學和基因測序技術(shù)逐漸成熟，越來越多的ncRNA被發(fā)現(xiàn)且被闡明其作用機制。盡管目前對乳腺癌EMT尚未研究出有效的治療方法，但是隨著科研工作者們對ncRNA調(diào)控乳腺癌EMT機制不斷探索，相信未來會研發(fā)出有效的靶向ncRNA分子，乳腺癌EMT的攻克將指日可待。