大孔樹脂分離純化柞樹葉總黃酮及其抗氧化活性研究

王林美 岳冬梅 孫永欣 馬淑慧 張波 李樹英

摘要 [目的]研究柞樹葉總黃酮的純化工藝及抗氧化活性。[方法]采用靜態(tài)吸附與解析的方法，通過比較6種大孔樹脂的吸附和解析性能，優(yōu)選適宜的大孔樹脂，并優(yōu)化適合分離柞樹葉總黃酮的解析條件。以VC為對照，對其還原力、DPPH 自由基（DPPH·）和超氧陰離子自由基（O2-·）的清除能力進(jìn)行研究。[結(jié)果]D101型大孔樹脂純化柞樹葉總黃酮吸附與洗脫效果最好，其純化最佳工藝條件為粗提液濃度0.55 mg/mL、上樣流速1.5 mL/min、洗脫劑40%乙醇（V/V）、洗脫流速1.5 mL/min，柞樹葉總黃酮純度可達(dá)65.5%;分離純化后柞樹葉總黃酮具有良好的總還原能力以及清除DPPH自由基和抗超氧陰離子自由基活性，其總還原力大于VC的還原力，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.03 mg/mL時，對DPPH自由基和抗超氧陰離子自由基的清除率分別為85.9%和65.9%。[結(jié)論]D101大孔樹脂可用于柞樹葉總黃酮的分離純化，柞樹葉總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 柞樹葉;總黃酮;大孔樹脂;分離純化;抗氧化活性

中圖分類號 R 285? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）23-0192-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.054

Study on Separation and Purification of Total Flavonoids from Tussah Leaves by Macroporous Resin and Its Antioxidant Activity

WANG Lin-mei，YUE Dong-mei，SUN Yong-xin et al

（Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute，Dalian，Liaoning 116023）

Abstract [Objective]To study the purification technology and antioxidant activity of total flavonoids from tussah leaves.[Method]The suitable macroporous resin and the suitable desorption conditions for total flavonoids separation from tussah leaves were optimized by comparing the adsorption and desorption properties of six kinds of macroporous resin through static test.The reducing power，the scavenging ability of DPPH radical （DPPH·） and superoxide anion radical （O2-·） were studied，as VC was control .[Result]The adsorption and elution effect of total flavonoids from tussah leaves by D101 macroporous resin was the best.The purity of total flavonoids in tussah leaves could reach 65.5% with the optimum purification conditions： crude extract concentration of 0.55 mg/mL，sample flow rate of 1.5 mL/min，elution agent of 40% ethanol （V/V），elution flow rate of 1.5 mL/min.After separation and purification，the total flavonoids of tussah leaves had good total reducing ability and scavenging DPPH free radical and anti-superoxide anion free radical activity，and its total reducing power was greater than that of VC.When the mass concentration was 0.03 mg/mL，the scavenging rates of DPPH free radical and anti-superoxide anion radical were 85.9% and 65.9%，respectively.[Conclusion] D101 macroporous resin can be used for the separation and purification of total flavonoids from tussah leaves，and the total flavonoids from tussah leaves have strong antioxidant activity.

Key words Tussah leaves;Total flavonoids;Macroporous resin;Separation and purification;Antioxidant activity

基金項(xiàng)目 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-18）。

作者簡介 王林美（1966—），女，遼寧大連人，副研究員，從事蠶桑資源綜合利用 研究。通信作者，研究員，從事柞蠶資源綜合利用研究。

收稿日期 2021-04-06

柞樹為殼斗科櫟屬植物的總稱，是多年生闊葉植物，我國主要分布在東北和華北地區(qū)，其中遼寧省柞樹林有182萬hm2，占林地面積的14.7%，資源廣泛，野外自然生長，產(chǎn)地天然無污染[1]。柞樹葉主要作為柞蠶飼料而被利用，研究發(fā)現(xiàn)柞樹葉除了含有粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、礦物質(zhì)元素、維生素等營養(yǎng)成分外，還富含黃酮類生物活性成分[2]，其中柞樹葉中黃酮類主要有山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-（6’-O-沒食子酰基）-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3-O-（6’-O-沒食子?；?β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黑麥草素、β-谷甾醇葡萄糖苷等[3]。藥理試驗(yàn)已證實(shí)柞樹葉具有清熱利濕、抗炎解毒[4]、保肝降血糖[5]等作用，醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有較高的生理及藥理活性，如抗氧化、調(diào)節(jié)血管滲透性、抗抑郁、抗焦慮、保護(hù)神經(jīng)、提高免疫力、抗腫瘤等功效[6]，這些生理和藥理特性使其廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

大孔吸附樹脂是一種有機(jī)高聚物吸附劑，具有吸附量大、選擇性強(qiáng)、容易脫附再生、操作簡便、成本低等特點(diǎn)[7-9]，被廣泛地用于黃酮類、皂苷類和生物堿類等天然產(chǎn)物化學(xué)成分的分離純化[10-13]。目前對于有效成分總黃酮的分離純化方法的研究鮮見報(bào)道。該研究首次以柞樹葉中總黃酮吸附和解析性能為指標(biāo)，考察不同大孔樹脂對其總黃酮的吸附解析性能，從柞樹葉中獲得較高純度的總黃酮，并考察其抗氧化活性，為柞樹葉資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材。柞樹葉來自蒙古櫟（Quercus mongolica）樹種，采自遼寧省鳳城市雞冠山鎮(zhèn)柞園，用清水清洗后25? ℃陰干，粉碎過60目篩，得柞樹葉粉，-20? ℃冰箱保存。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品為中國食品藥品檢定研究院生產(chǎn)（HPLC≥98%）;甲醇、乙腈為色譜純，國藥集團(tuán)生產(chǎn);硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇、鄰苯三酚、過氧化氫、鐵氰化鉀、維生素C、三氯乙酸，均為國藥集團(tuán)生產(chǎn)（分析純）;抗超氧陰離子自由基測定試劑盒購自南京建成公司;D101、X-5、D4020、AB-8、D1400、DA201大孔樹脂（天津市海光化工有限公司），其物理特性如表1所示。

1.1.2 儀器。U3010紫外/可見分光光度計(jì)（Hitachi，Japan）;SENCO 5 L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、98-1-B電熱套（上海申生科技有限公司）;DZF-6021 真空干燥箱、DHG-9070A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）;玻璃層析柱（6.0 cm×80.0 cm）（勇誠玻璃儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 柞樹葉總黃酮粗提物的制備。取柞樹葉粉10 g，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇200 mL浸泡90 min，提取物4層紗布過濾，5 000 r/min離心20 min，收集上清液，于60? ℃水浴下回流提取3次，每次30 min，合并提取液過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮提取液得到浸膏，加蒸餾水稀釋成試驗(yàn)所需濃度的柞樹葉總黃酮粗提液，備用。

1.2.2 柞樹葉總黃酮含量測定[14]。

1.2.2.1 波長選擇。參照婁曉晶等[14]的方法進(jìn)行總黃酮含量測定，分別取2.0 mL 0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和柞樹葉總黃酮粗提物的樣品溶液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%的亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以50%乙醇水溶液為空白對照，在450～800 nm 掃描，確定最大吸收波長。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別精密吸取0.2 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于10 mL試管中，加5% NaNO2溶液0.6 mL，搖勻，放置6 min，加10% Al（NO3）3 溶液0.6 mL，搖勻，放置6 min，加入1.0 mol/L NaOH溶液6 mL，搖勻，靜置15 min，再加60%乙醇溶液至10 mL，用紫外分光光度計(jì)在510 nm波長處測定其吸光值（A）。以蘆丁濃度（ρ，mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.3 柞樹葉總黃酮含量測定。準(zhǔn)確稱取柞樹葉粉10 g，按照“1.2.1”方法提取柞樹葉總黃酮，按“1.2.2.2”方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計(jì)算柞樹葉總黃酮含量。

1.2.2.4 總黃酮純度測定。按照賈紹千等[15]的方法測定總黃酮純度，將“1.2.1”方法制備的柞樹葉粗提物（即為純化前黃酮）和純化后的柞樹葉總黃酮溶液分別減壓濃縮、干燥，得到總黃酮干粉。準(zhǔn)確稱取純化前后的總黃酮干粉各100 mg，分別溶于60%乙醇溶液并定容至100 mL。各吸取2 mL于10 mL容量瓶中，按總黃酮含量測定方法進(jìn)行測定，再根據(jù)公式Y(jié)=XM×100%計(jì)算提取物中總黃酮純度（Y），其中，X為總黃酮含量（mg）;M為稱取總黃酮干粉的質(zhì)量（mg）。

1.2.3 大孔樹脂的預(yù)處理。

取D101、X-5、D4020、AB-8、D1400、DA201 這6種大孔樹脂，分別加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇浸泡24 h以上，不斷攪拌，大孔樹脂充分溶脹后，濕法裝柱;用3～4倍柱床體積的95%乙醇洗滌樹脂，洗至流出液無白色渾濁為止，再用去離子水洗至無醇味為止;然后用5倍柱床體積的2%氫氧化鈉和5%鹽酸洗脫，最后用蒸餾水洗至中性，備用。

1.2.4 不同大孔樹脂對柞樹葉總黃酮靜態(tài)吸附-解析性能。

1.2.4.1 大孔樹脂篩選試驗(yàn)。分別準(zhǔn)確稱取5 g已處理好的6種不同型號的大孔吸附樹脂（D101、X-5、D4020、AB-8、D1400、DA201），每個大孔吸附樹脂重復(fù)3份，裝于100 mL具塞錐形瓶中，分別加入0.55 mg/mL的樣品溶液50 mL，置于25? ℃恒溫?fù)u床中100 r/min吸附24 h，取出400 μL測其溶液的吸光度，按“1.2.2”方法計(jì)算相應(yīng)的總黃酮含量，按公式（1）計(jì)算各大孔樹脂的吸附率。

A=C0-C1C0×100%（1）

式中， A為大孔樹脂對柞樹葉總黃酮的吸附率（%）;C0為樣品總黃酮吸附前質(zhì)量濃度（mg/mL）;C1為大孔樹脂吸附后總黃酮的質(zhì)量濃度（mg/mL） 。

取上述吸附的大孔吸附樹脂用蒸餾水洗至洗脫液無色，濾紙吸干樹脂表面殘留的溶液，置于具塞錐形瓶中，加50 mL 40%乙醇溶液，置于25? ℃恒溫?fù)u床中100 r/min解析24 h，取出400 μL測其溶液的吸光度，按“1.2.2”方法計(jì)算相應(yīng)的總黃酮含量。按公式（2）計(jì)算大孔樹脂對柞樹葉總黃酮的解析率。

D=C2V3C0V1-C1V2×100%（2）

式中，D為大孔樹脂對柞樹葉總黃酮的解析率（%）;C0為樣品總黃酮吸附前質(zhì)量濃度（mg/mL）;C1為大孔樹脂吸附后總黃酮的質(zhì)量濃度（mg/mL）;C2為洗脫液中總黃酮的質(zhì)量濃度（mg/mL）;V1為樣品溶液的體積（mL）;V2為吸附溶液的體積（mL）;V3為洗脫液的體積（mL）。

1.2.4.2 靜態(tài)吸附解析動力學(xué)試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取2.0 g 預(yù)處理好的D101大孔樹脂置于100 mL具塞錐形瓶，加入濃度為0.55? mg/mL的柞樹葉總黃酮溶液50 mL，置于25? ℃恒溫?fù)u床中100 r/min條件下振蕩吸附12 h，每小時取出400 μL溶液測其吸光度，測定總黃酮含量，直至大孔樹脂吸附飽和，待測液中總黃酮含量變化趨于穩(wěn)定時，停止取樣，計(jì)算不同吸附時間大孔樹脂吸附量。將吸附飽和的樹脂用蒸餾水洗至洗脫液無色，濾紙吸干樹脂表面殘留的溶液，置于具塞錐形瓶中，加50 mL 40%乙醇溶液，置于25 ℃恒溫?fù)u床中100 r/min解析12 h，每小時取出400 μL溶液測其吸光度，按“1.2.2”方法計(jì)算相應(yīng)的總黃酮含量，直至解析液中總黃酮濃度變化趨于穩(wěn)定。

1.2.5 動態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)。

1.2.5.1 上樣濃度選擇試驗(yàn)。將預(yù)處理過的D101 樹脂濕法裝柱，樹脂柱體積100 mL，分別取總黃酮濃度為0.15、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65和0.75 mg/mL的樣液上樣200 mL，設(shè)定流速1.5 mL/min，利用自動部分收集器收集流出液4 mL/管，測定每管流出液總黃酮含量，當(dāng)流出液總黃酮濃度與初始上樣濃度接近時停止上樣，并計(jì)算其吸附率。

1.2.5.2 上樣液流速選擇試驗(yàn)。將預(yù)處理過的D101 樹脂濕法裝柱，樹脂柱體積100 mL，取濃度為0.55? mg/mL 的柞樹葉總黃酮樣品液上樣200 mL，上樣流速分別選取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mL/min，利用自動收集器進(jìn)行樣品流出液收集（4 mL/管），測定每管流出液總黃酮含量，當(dāng)流出液總黃酮濃度與初始上樣濃度接近時停止上樣，計(jì)算吸附率。

1.2.5.3 洗脫劑濃度選擇試驗(yàn)。取200 mL 濃度為0.55? mg/mL 的柞樹葉總黃酮溶液裝入預(yù)處理過的D101 樹脂柱。樹脂柱體積100 mL，用100 mL的乙醇洗脫，乙醇濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，流速1.5 mL/min，利用自動部分收集器進(jìn)行樣品流出液收集（4 mL/管），分別測定每管流出液的總黃酮含量，所有管相加之和即為該乙醇洗脫濃度下的總黃酮含量，計(jì)算解析率。

1.2.5.4 洗脫流速選擇試驗(yàn)。取200 mL 濃度為0.55 mg/mL 的柞樹葉總黃酮溶液裝入預(yù)處理過的D101 樹脂柱。樹脂柱體積100 mL，用100 mL 40%乙醇洗脫，分別選擇0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mL/min洗脫流速，利用自動部分收集器進(jìn)行樣品流出液收集（4 mL/管），分別測定每管流出液的總黃酮含量，所有管相加之和即為該流速下的總黃酮含量，計(jì)算解析率。

1.2.6 大孔樹脂純化總黃酮工藝驗(yàn)證。取篩選的最佳大孔樹脂D101進(jìn)行預(yù)處理后，分別濕法裝柱，參照篩選的最佳純化工藝，收集純化后總黃酮洗脫液，進(jìn)行減壓濃縮，冷凍干燥，按照“1.2.2”方法計(jì)算總黃酮含量。

1.2.7 柞樹葉總黃酮抗氧化能力研究。

1.2.7.1 柞樹葉總黃酮對DPPH自由基清除能力的測定[16-17]。將柞樹葉總黃酮和VC分別用蒸餾水配制成0.01、0.02、0.03、0.04和0.05 mg/mL 5個 濃度樣品待測液。分別取不同濃度的樣品待測液2 mL置于試管中，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液，混勻，室溫下避光靜置30 min，在波長517 nm處測其吸光度（Ai）;另取2 mL待測樣品于試管中，加入無水乙醇2 mL，混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測吸光度（Aj）;以2 mL濃度為0.1 mmoL/L DPPH無水乙醇溶液和2 mL無水乙醇反應(yīng)作為空白參比，在517 nm波長處測吸光度（A0）。按照公式（3）計(jì)算樣品對DPPH自由基的清除率。

清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%（3）

1.2.7.2 柞樹葉總黃酮還原力測定。

參考向志軍等[18]的方法，將柞樹葉總黃酮和VC用蒸餾水分別配制成0.005、0.010、0.020、0.050、0.100和0.200? mg/mL 6個濃度樣品待測液，分別取樣品待測液2.5 mL于試管中，加入2.5 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH=6.6）和2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液充分混勻，置于50 ℃水浴20 min，結(jié)束后迅速冰浴冷卻并加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸混勻，在3 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液5 mL置于另一試管內(nèi)依次加入4 mL蒸餾水和1 mL 濃度為1? mg/mL的三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10 min，于700 nm波長處測定反應(yīng)液吸光度，吸光度越大表明還原力越強(qiáng)。

1.2.7.3 超氧陰離子自由基（O2-·）清除活性的測定。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，配制不同質(zhì)量濃度（0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60和0.70 mg/mL）的柞樹葉總黃酮提取液和VC作為待測液，備用。用分光光度計(jì)選定550 nm波長測定其吸光度，利用公式（4）計(jì)算超氧陰離子清除率。

清除率=（1-對照OD值-測定OD值對照OD值）×100%（4）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

作圖軟件為Origin 9.0，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)結(jié)果的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和柞葉總黃酮粗提液在450～800 nm 掃描得到最大吸收峰波長均為500～510 nm。由于柞葉總黃酮粗提液成分較復(fù)雜，對其色譜圖有一定影響，故最大吸收波長較蘆丁略有偏差。所以確定510 nm 為樣品測定波長[19] 。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)“1.2.2.2”方法，在波長510 nm 處測定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（ρ）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2所示，用最小二乘法經(jīng)線性回歸，得回歸方程A=13.779ρ-0.000 5（R2=0.999 5）。結(jié)果表明，溶液濃度控制在8～48 μg/mL時，蘆丁對照品溶液濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 大孔樹脂的篩選

對6 種大孔樹脂的靜態(tài)吸附量、吸附率和解析性能的測試結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，6種大孔樹脂吸附柞樹葉中總黃酮化合物均有較高的吸附能力，DA201樹脂吸附能力相比之下表現(xiàn)較強(qiáng)，但其解析能力很差，不是理想的吸附樹脂。6種樹脂吸附能力差別不大，但是解析率差別較大，從大到小依次為D101> AB-8 > D4020>X-5>D1400>DA201，且D101、X-5、 D4020、AB-8、D1400組顯著高于DA201組（P<0.05）?？赡苁且?yàn)樽鯓淙~總黃酮類化合物中非極性和弱極性化合物含量較高，依據(jù)6種大孔樹脂對柞樹葉總黃酮靜態(tài)吸附和解析率大小，純化柞樹葉總黃酮優(yōu)選D101 型大孔樹脂。

2.4 D101大孔樹脂靜態(tài)吸附解析平衡時間的確定

2.4.1 D101大孔樹脂靜態(tài)吸附平衡時間。由圖4可知，D101大孔樹脂對柞樹葉總黃酮樣液的吸附量在1～5 h升高明顯，5 h吸附率達(dá)到最高（90.57%），5 h后趨于飽和，基本達(dá)到吸附平衡，因此可選擇5 h為最佳吸附時間。

2.4.2 D101大孔樹脂靜態(tài)解析平衡時間。從圖5可以看出，D101大孔樹脂對柞樹葉總黃酮樣液的解析率在5 h之前，解析率升高明顯，5 h后D101大孔樹脂基本達(dá)到解析平衡狀態(tài)，隨著解析時間延長，解析率變化不明顯， 5 h解析率可以達(dá)到79.37%。因此D101大孔樹脂的靜態(tài)解析時間可以選擇為5 h。

2.5 D101 樹脂對柞樹葉總黃酮動態(tài)吸附-洗脫單因素考察

2.5.1 上樣液濃度對D101大孔樹脂吸附率的影響。由圖6可見，隨著上樣濃度的增加，樹脂吸附率先升后降，當(dāng)上樣液濃度為0.55 mg/mL 時，樹脂吸附率最高（90.12%），總黃酮的吸附量明顯高于其他濃度，故最佳上樣濃度為0.55? mg/mL。

2.5.2 上樣速度對D101 大孔樹脂吸附率的影響。

從圖7 可以看出，隨著上樣速度的增加，樹脂吸附率小幅度上升后呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，當(dāng)上樣速度為1.5 mL/min時，D101大孔樹脂吸附率相對達(dá)到最高（89.96%） ，因此最佳上樣速度可選擇1.5 mL/min。

2.5.3 洗脫劑濃度對柞樹葉總黃酮解析率的影響。

由圖8 可知，隨著洗脫液乙醇濃度的增大，D101大孔樹脂對柞樹葉總黃酮解析率顯示逐漸上升，當(dāng)乙醇濃度升高至40%時，其解析率相對最高（79.37%），當(dāng)乙醇濃度高于40% 后，對總黃酮解析率開始降低，由此可選擇40%乙醇作為洗脫液。

2.5.4 洗脫流速對柞樹葉總黃酮解析率的影響。

從圖9 可以看出，隨著洗脫速度的增加，樹脂解析率逐漸增大，之后出現(xiàn)下降，當(dāng)洗脫速度為1.5 mL/min 時，D101大孔樹脂對柞樹葉總黃酮解析率達(dá)到最高（79.19%） ，隨著洗脫速度增加解析率開始出現(xiàn)平穩(wěn)下降，因此最佳洗脫速度可選擇1.5 mL/min。

2.6 純化前后總黃酮的純度

根據(jù)計(jì)算得出純化前、純化后的柞樹葉總黃酮純度分別為18.35%和65.50%，經(jīng)過純化后，總黃酮的純度提高2.57倍。

2.7 柞樹葉總黃酮抗氧化能力研究

2.7.1 DPPH 自由基清除試驗(yàn)。以VC作為對照，計(jì)算不同質(zhì)量濃度的柞樹葉總黃酮和VC對DPPH自由基的清除率，試驗(yàn)結(jié)果見圖10。在0.01～0.05 mg/L濃度范圍內(nèi)，柞樹葉總黃酮和VC對DPPH自由基的清除率都隨著濃度的增大而增強(qiáng)，并且在0.01～0.04 mg/L濃度下柞樹葉總黃酮對DPPH自由基的清除率大于VC，在濃度為0.03 mg/mL時，柞樹葉總黃酮對DPPH自由基清除率已達(dá)到85.9%。柞樹葉總黃酮和VC清除DPPH自由基半數(shù)抑制濃度IC50分別為0.019和0.023 mg/L。

2.7.2 柞樹葉黃酮總還原能力的測定。從圖11可以看出，柞樹葉總黃酮具有很強(qiáng)的還原能力，隨著濃度的增大其還原能力逐漸增強(qiáng)，柞樹葉總黃酮的總還原能力在測定濃度0.005～0.200 mg/mL明顯高于VC。

2.7.3 柞樹葉總黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力。從圖12可以看出，試驗(yàn)在0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，柞樹葉總黃酮對超氧陰離子的清除能力與其濃度呈正相關(guān)，隨著柞樹葉總黃酮濃度增加其清除能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)試驗(yàn)濃度為0.30 mg/mL 時，柞樹葉總黃酮對超氧陰離子的清除率為65.9%。

3 討論與結(jié)論

該研究利用靜態(tài)吸附與解析試驗(yàn)研究了大孔樹脂分離純化柞樹葉總黃酮的工藝，對6種大孔樹脂（D101、X-5、D4020、AB-8、D1400和DA201）吸附和解析單因素影響進(jìn)行篩選，確定D101大孔樹脂是分離純化柞樹葉總黃酮較理想的樹脂類型，靜態(tài)吸附率為90.82%，解析率為79.43%。初步確定其純化最佳條件為靜態(tài)吸附時間5 h、動態(tài)吸附最佳上樣流速1.5 mL/min、上樣液濃度0.55 mg/mL、洗脫劑40%（V/V）乙醇、洗脫流速1.5 mL/min，在此條件下純化柞樹葉總黃酮含量為65.50%，比純化前柞樹葉粗提物中總黃酮含量（18.35%）提高2.57倍，該方法能夠有效提高柞樹葉總黃酮含量，為進(jìn)一步開發(fā)柞樹葉藥理作用的活性成分奠定一定物質(zhì)基礎(chǔ)。

在柞樹葉總黃酮制備的基礎(chǔ)上，以VC作對照，對柞樹葉總黃酮對其總還原力及DPPH 自由基、超氧陰離子自由基清除能力進(jìn)行評價，結(jié)果表明，柞樹葉總黃酮的含量與抗氧化作用呈正相關(guān)。柞樹葉總黃酮還原力、DPPH 自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力都大于VC，作用也隨著濃度增大而增強(qiáng);且總黃酮對DPPH半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.019 mg/mL，濃度為0.03 mg/mL時對DPPH的清除率為85.9%，濃度為0.30 mg/mL時其對超氧陰離子自由基清除率為65.9%。這些結(jié)果表明純化后的柞樹葉總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

柞樹葉中黃酮類化合物提取工藝及其抗氧化能力的研究為柞樹葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。但要想獲得更高純度的柞樹葉總黃酮，對于大孔樹脂種類的選擇、純化條件等因素的確定有待于進(jìn)一步深入研究?？傊罂孜綐渲軌?yàn)樘烊划a(chǎn)物的分離純化及產(chǎn)品開發(fā)提供更多技術(shù)支持。

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