基于轉(zhuǎn)錄組學的川芎嗪改善增生性瘢痕機制研究

王婷 吳東芝 武雪

摘要 [目的]基于轉(zhuǎn)錄組學分析川芎嗪治療增生性瘢痕的分子機制。 [方法]獲取臨床手術(shù)的增生性瘢痕組織，利用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)分離瘢痕成纖維細胞，分為對照組和川芎嗪組（10 mg/mL）。采用轉(zhuǎn)錄組學測序技術(shù)及 GO、KEGG 通路富集分析，研究增生性瘢痕成纖維細胞各基因的表達。 [結(jié)果]轉(zhuǎn)錄組學分析結(jié)果得到川芎嗪參與調(diào)控2 783個差異基因，GO及 KEGG 通路富集分析顯示以上基因主要富集于DNA復制，細胞周期，類固醇生物合成錯配修復，p53信號通路，蛋白質(zhì)的消化吸收，不飽和脂肪酸的生物合成等通路。[結(jié)論]該研究揭示調(diào)控成纖維細胞的相關(guān)調(diào)控蛋白，對闡明川芎嗪防治增生性瘢痕的具體作用機制提供了重要信息。

關(guān)鍵詞 川芎嗪;轉(zhuǎn)錄組;高通量測序;增生性瘢痕

中圖分類號 R 285? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）23-0133-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.036

The Mechanism of Tetramethylpyrazine in Improving Hypertrophic Scar Based on Transcriptomics

WANG Ting1，WU Dong-zhi2，WU Xue2

（1.College of Pharmacy，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi 712000;2.Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi 712000）

Abstract [Objective]The molecular mechanism of tetramethylpyrazine in the treatment of hypertrophic scar was analyzed based on transcriptomics.[Method]Hypertrophic scar tissue from clinical operation was obtained，and scar fibroblasts were cultured and separated by tissue block culture method，and divided into control group and tetramethylpyrazine group （10 mg/mL）.Transcriptome sequencing technology and GO KEGG pathway enrichment analysis were used to study the gene expression of hypertrophic scar fibroblasts.[Result]Transcriptome analysis showed that tetramethylpyrazine was involved in the regulation of 2 783 differential genes，and enrichment analysis of GO and KEGG pathways showed that the above genes were mainly concentrated in DNA replication，cell cycle，steroid biosynthesis mismatch repair，p53 signaling pathway，protein digestion and absorption，unsaturated fatty acid biosynthesis and other pathways.[Conclusion]This study reveals the related regulatory proteins that regulate fibroblasts and provides important information for clarifying the specific mechanism of tetramethylpyrazine in preventing and treating hypertrophic scar.

Key words Tetramethylpyrazine;Transcriptomics;High-throughput sequencing;Hypertrophic scar

基金項目 教育廳專項科研計劃項目（18JK0212）。

作者簡介 王婷（1996—），女，重慶人，碩士研究生，研究方向：抗結(jié)腸癌藥物。通信作者，實驗師，碩士，從事增生性瘢痕的防治和發(fā)生機制研究。

收稿日期 2021-06-01

增生性瘢痕是皮膚燒傷、創(chuàng)傷、手術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一，每年新增患者達數(shù)百萬[1]。作為一種嚴重的皮膚纖維化疾病，不僅影響美觀，危害患者的生理和心理健康，甚至會引起嚴重的功能障礙，給家庭和社會帶來沉重的負擔[2]。盡管臨床上有多種治療方案，但因增生性瘢痕的發(fā)病率、復發(fā)率高及治療周期長等特點，加之目前缺乏預防瘢痕形成及改善瘢痕的特效藥物。因此，增生性瘢痕是臨床治療面臨的一大難題，成為國內(nèi)外學者研究的重點和難點。目前認為增生性瘢痕的形成主要與遺傳因素、創(chuàng)面炎癥反應、細胞因子的作用、膠原代謝失衡和成纖維細胞的功能失調(diào)密切相關(guān)[2]。其中，成纖維細胞的作用至關(guān)重要。成纖維細胞和由其表型轉(zhuǎn)化而來的肌成纖維細胞直接參與皮膚損傷后創(chuàng)面愈合，是多種細胞因子、炎性反應作用的靶細胞，更是導致膠原代謝失衡和瘢痕形成的關(guān)鍵效應細胞[2-3]。

川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）是從中藥川芎中提取得到的活性單體，研究表明川芎嗪可明顯改善心肌、肺和肝纖維化等纖維化疾病[4]。Wu等[5]已經(jīng)證實了川芎嗪通過調(diào)節(jié)膠原的表達和細胞的增殖與凋亡，從而抑制瘢痕成纖維細胞纖維化，拮抗瘢痕的增生。鑒于中藥復方成分多以及作用的復雜性，川芎嗪拮抗瘢痕成纖維細胞纖維化的其余機制研究尚不明確，有待深入研究。該研究采用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq） 技術(shù)分析川芎嗪干預瘢痕成纖維細胞的差異表達基因，從轉(zhuǎn)錄組學水平進一步揭示調(diào)控成纖維細胞的相關(guān)調(diào)控蛋白，以期闡明川芎嗪防治增生性瘢痕的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 樣本 增生性瘢痕組織均來自空軍軍醫(yī)大學燒傷與皮膚外科即將接受手術(shù)的成年患者（20 ～ 44歲）。在試驗前，所有患者均有知情同意書，所有方案均由空軍軍醫(yī)大學第一附屬西京醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 瘢痕成纖維細胞的分離與培養(yǎng)

組織塊經(jīng)消毒、清洗，置于0.25% Dispase中，4 ℃消化12 h，分離真皮層，洗滌后剪切成0.1～1.0 mm的組織塊，接種于培養(yǎng)瓶中，傳至2～4代的成纖維細胞凍存于液氮罐中保存，試驗用5～8代細胞。

1.3 分組及給藥

將體外培養(yǎng)的瘢痕成纖維細胞接種于培養(yǎng)皿，待細胞80%融合時用無血清培養(yǎng)基孵育12 h后，加入川芎嗪（40 μmol/L）處理24 h后收集細胞樣本用于后續(xù)檢測。

川芎嗪購自上海源業(yè)生物科技有限公司，純度98%。取10 mg TMP溶液稱重，溶解于1 mL DMSO中，制成10 mg/mL川芎嗪溶液。

1.4 轉(zhuǎn)錄組學檢測 收集瘢痕成纖維細胞和川芎嗪處理后的瘢痕成纖維細胞樣本，使用RNAprep試劑盒提取細胞中總RNA，用含有寡糖（dT）的小球從總RNA中分離poly mRNA，去除rRNA。采用illumina Hiseq測序平臺的雙端測序模式對多個樣本進行高通量測序，去除單細胞SMARTER建庫接頭，根據(jù)illumina測序數(shù)據(jù)的低質(zhì)量分數(shù)集中于末端的分布特點，利用Skewer軟件對測序數(shù)據(jù)從3′端動態(tài)去除和接頭序列片段和低質(zhì)量片段，利用FastQC軟件對預處理數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制分析，利用FastQC軟件對預處理數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制分析以及Q20、Q30堿基比例統(tǒng)計。

1.5 差異基因篩選及分析 利用DESeq2軟件對不同樣本組之間篩選差異表達的已知基因，滿足|log2FC|≥1和P≤0.05差異表達范圍，篩選2組之間的差異基因。

1.6 GO 和 KEGG 功能分析和富集分析

針對目的基因集采用TopGO軟件進行GO功能分析，GO功能富積分析的方法：將全部基因作為背景列表，目的基因列表作為從背景列表中篩選出來的候選列表，利用Fisher精確檢驗計算代表GO功能集在目的基因列表中是否顯著富積的P值，再對P值經(jīng)Benjamini & Hochberg多重檢驗糾正后得到FDR。KEGG pathway功能分析是針對這些基因進行KEGG數(shù)據(jù)庫中Pathway的功能注釋和歸類，KEGG pathway功能富積分析方法與GO功能富積分析類似。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因表達差異 將對照組與川芎嗪處理組的各基因表達情況進行對比，結(jié)果表明，川芎嗪組共致使2 783個基因表達水平存在顯著變化，其中使表達水平顯著上調(diào)的基因有1 285個，顯著下調(diào)的基因有 1 498 個（P<0.01）。

用 R 語言 ggplots2 軟件包繪制差異表達基因的火山圖，火山圖展示2分組之間基因表達倍數(shù)差異和顯著性程度（圖1），綠色是相對對照組顯著性下調(diào)的基因（即P≤0.05，foldchange≥2），紅色點則為上調(diào)基因。查閱相關(guān)文獻，得到川芎嗪處理后修復增生性瘢痕密切相關(guān)的基因，分別列舉了處理組與對照組高表達和低表達的5個基因（表1）。

2.2 GO 富集 Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫是用專業(yè)術(shù)語對基因產(chǎn)物的屬性進行定義。GO包括3個本體，用來描述細胞學組分、分子功能和參與的生物學過程（圖2）。差異表達基因的GO分析結(jié)果顯示，這些差異基因分別涉及20條生物學過程，主要影響細胞周期、染色體分離、有絲分裂、核分裂、細胞器裂變、DNA代謝過程、DNA復制等，20條細胞學組分為染色體分離，染色體著絲粒區(qū)域等相關(guān)組分，20 條分子功能主要涉及單鏈DNA依賴的ATP酶活性，DNA二級結(jié)構(gòu)結(jié)合以及細胞骨架的結(jié)構(gòu)組成成分等。

2.3 KEGG 富集 該研究通過 KEGG pathway 顯著性富集分析來篩選對照組和川芎嗪干預組間的差異基因參與的主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑，以 KEGG pathway 為單位，通過超幾何檢驗，篩選出與整個基因組相比后差異表達基因顯著富集的pathway，以Q<0.05 的pathway 定義為各組差異表達基因顯著富集的 pathway。從復雜調(diào)控網(wǎng)絡的角度，找出與增生性瘢痕相關(guān)的KEGG 通路，從而提取出相關(guān)KEGG 通路中的差異表達基因。KEGG 富集結(jié)果見圖3，這些差異基因被富集于DNA復制、細胞周期、類固醇生物合成錯配修復、p53信號通路、蛋白質(zhì)的消化吸收、不飽和脂肪酸的生物合成等通路上。

3 討論

增生性瘢痕是燒傷、創(chuàng)傷等皮膚損傷后的嚴重并發(fā)癥之一。瘢痕與正常皮膚相比，表面呈紅色，局部增厚變硬，嚴重影響患者外觀并引發(fā)功能性障礙，給患者心理、生理帶來巨大的困擾[6-7]。增生性瘢痕的主要病理特征包括成纖維細胞過度增殖、毛細血管增生以及細胞外基質(zhì)過度沉積。其發(fā)生的誘因主要有燙傷、燒傷及創(chuàng)傷等皮膚深度損傷，創(chuàng)面愈合時間延長，過度的炎癥反應及遺傳因素等。因此，抑制成纖維細胞的過度增殖、激活成纖維細胞凋亡、減少基于膠原的ECM沉積對增生性瘢痕治療至關(guān)重要。其中，成纖維細胞被賦予完整的機制，允許ECM的沉積和吸收，在穩(wěn)態(tài)條件下不斷更新[8]。

該研究通過轉(zhuǎn)錄組學測序技術(shù)分析了川芎嗪治療組與對照組瘢痕成纖維細胞的差異表達基因，隨后對差異表達基因進行了GO分析和富集分析。研究結(jié)果表明，川芎嗪治療后增生性瘢痕成纖維細胞的基因發(fā)生了明顯改變，統(tǒng)計分析有2 783個基因發(fā)生明顯變化，其中顯著上調(diào)的基因有1 285個，顯著下調(diào)的基因有1 498個。研究表明[9]，在疤痕中角蛋白16（keratin 16）數(shù)量極少或不存在，該研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，川芎嗪處理組中的keratin 16表達明顯上調(diào)。當keratin 16的表達異常時，病變部位的皮膚屏障功能會受到不同程度的破壞，未受累皮膚的屏障功能也會受到影響，不僅皮膚滲透屏障功能受到影響，還會引起皮膚炎癥反應和免疫反應，導致機體受到進一步損害[10]。Meyer等[11]研究表明，角質(zhì)形成細胞中的成纖維細胞生長因子3型受體（FGFR3）對于小鼠皮膚發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和傷口修復不可或缺，經(jīng)川芎嗪處理后的瘢痕成纖維細胞與對照組相比FGFR3表達量上調(diào)2.39倍（P≤0.05）。進一步發(fā)現(xiàn)FGFR1、FGFR2和FGFR3共同作用，能維持表皮完整性和皮膚穩(wěn)態(tài)。Joannes等[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF18可抑制成纖維細胞的細胞生長，結(jié)果顯示川芎嗪處理組瘢痕成纖維細胞中FGF18與對照組相比上調(diào)了1.52倍（P≤0.05）。白細胞介素15（IL-15）為一種細胞生長因子，也可以作為一種化學引誘因子，并具有促炎特性。Teich-Alasia等[13]研究證明，從活躍期增生性瘢痕到緩解期增生性瘢痕的進展是由IL-15的減少而引起的活化浸潤性T細胞的活性或被動細胞凋亡的結(jié)果。IL-15可富集、激活和防止活躍期增生性瘢痕中激活的T淋巴細胞凋亡，因此抑制IL-15的表達可緩解疤痕角質(zhì)層增厚。臨床前試驗證明，抗IL-20RA單克隆抗體[14]具有抑制化學藥物（四氯化碳）或機械膽管結(jié)扎誘導的小鼠模型中TGF-β產(chǎn)生或ECM成分過度積累的效果，故下調(diào)IL-20RA表達可減少ECM積累。

該研究從整體上揭示了差異基因的功能、代謝途徑和信號通路，闡明了川芎嗪通過調(diào)控成纖維細胞增殖的相關(guān)基因表達水平來改善增生性瘢痕，為臨床治療增生性瘢痕提供了新思路。

參考文獻

[1]SINGER A J，CLARK R A.Cutaneous wound healing[J].N Engl J Med，1999，341（10）：738-746.

[2] VAN DER VEER W M，BLOEMEN M C T，ULRICH M M W.Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar[J].Burns，2009，35（1）：15-29.

[3] SARRAZY V，BILLET F，MICALLEF L，et al.Mechanisms of pathological scarring：Role of myofibroblasts and current developments[J].Wound Repair Regen，2011，19：s10-s15.

[4] 鮑永霞，王晶，孫冰，等.川芎嗪對肺間質(zhì)纖維化患者運動心肺功能改善的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2011，21（27）：3410-3412.

[5] WU X，WANG Z，WU G F，et al.Tetramethylpyrazine induces apoptosis and inhibits proliferation of hypertrophic scar-derived fibroblasts via inhibiting the phosphorylation of AKT[J].Front Pharmacol，2020，11：1-8.

[6] GAUGLITZ G G，KORTING H C，PAVICIC T，et al.Hypertrophic scarring and keloids：Pathomechanisms and current and emerging treatment strategies[J].Mol Med，2011，17（1/2）：113-125.

[7] BLOEMEN M C T，VAN DER VEER W M，ULRICH M M W，et al.Prevention and curative management of hypertrophic scar formation[J].Burns，2009，35（4）：463-475.

[8] DISTLER J H W，GYRFI A H，RAMANUJAM M，et al.Shared and distinct mechanisms of fibrosis[J].Nat Rev Rheumatol，2019，15（12）：705-730.

[9] LIMANDJAJA G C，VAN DEN BROEK L J，WAAIJMAN T，et al.Increased epidermal thickness and abnormal epidermal differentiation in keloid scars[J].Br J Dermatol，2017，176（1）：116-126.

[10] 李帥，張建忠，栗玉珍.角蛋白16在皮膚屏障功能中的作用[J].國際皮膚性病學雜志，2016，42（1）：50-53.

[11] MEYER M，BEN-YEHUDA GREENWALD M，RAUSCHENDORFER T，et al.Mouse genetics identifies unique and overlapping functions of fibroblast growth factor receptors in keratinocytes[J].J Cell Mol Med，2020，24（2）：1774-1785.

[12] JOANNES A，BRAYER S，BESNARD V，et al.FGF9 and FGF18 in idiopathic pulmonary fibrosis promote survival and migration and inhibit myofibroblast differentiation of human lung fibroblasts in vitro[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2016，310（7）：L615-L629.

[13] TEICH-ALASIA S，CASTAGNOLI C，TROMBOTTO C，et al.Expression and role of IL-15 in post-burn hypertrophic scars[J].J Invest Dermatol，1999，113（2）：238-245.

[14] CHIU Y S，WEI C C，LIN Y J，et al.IL-20 and IL-20R1 antibodies protect against liver fibrosis[J].Hepatology，2014，60（3）：1003-1014.