玉米穗腐病菌的拮抗菌篩選、鑒定及降解DON毒素能力測定

周紅姿，周方園，段成鼎，吳曉青，趙曉燕，謝雪迎，張廣志，范素素，張新建*

（1. 齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）生態(tài)研究所/山東省應用微生物重點實驗室，濟南 250103；2. 濟寧市農(nóng)業(yè)科學研究院，濟寧 272031）

玉米作為主要糧食作物之一在世界上廣泛種植，玉米穗腐病是玉米生長后期的重要病害[1-3]。引起該病的病原菌已有很多研究，目前報道較多的是禾谷鐮孢菌F. graminearum和輪枝鐮孢菌F. verticillioides等[4-6]。穗腐病主要發(fā)生在玉米生長后期，該病可以通過種子傳播，也可由玉米螟、桃蛀螟和棉鈴蟲等通過蛀食傳播[7]，目前防治方法主要有選育玉米抗性品種，采用化學防治和生物防治，輔以控制害蟲侵害等手段。由于引起玉米穗腐病的病原復雜[2,8-10]，給選育兼抗多種病原菌的抗病品種帶來一定困難，短期較難實現(xiàn)。連續(xù)化學防治容易使致病菌產(chǎn)生抗藥性，且會對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不良影響。而生物防治具有環(huán)境友好、不容易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，越來越受到人們的關注。

玉米穗腐病不僅導致玉米減產(chǎn)，其病原菌產(chǎn)生的伏馬毒素（fumonisins）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）和黃曲霉毒素（aflatoxin, AFT）等嚴重影響玉米質(zhì)量，引發(fā)人畜的多種嚴重疾病，嚴重者甚至導致死亡[11,12]。廣泛存在于污染的小麥、玉米等谷物和飼料中的是DON毒素，由于其穩(wěn)定的化學性質(zhì)、較強的熱抵抗力、耐壓、耐酸性，在加工過程中很難被除去，一直成為糧食生產(chǎn)加工過程中的隱患[13,14]。目前，國內(nèi)外針對DON的脫毒處理方法主要有化學法、物理法及微生物法[15]，和其他方法相比，微生物降解法不會對環(huán)境造成二次污染，去除毒素更溫和，對谷物的品質(zhì)和營養(yǎng)影響更小，因此利用微生物降解毒素已成為研究的熱點。已有研究報道假單胞桿菌Pseudomonassp.、德沃斯氏菌Devosiasp.、綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa、陰溝腸桿菌Enterobacter cloacae、塔賓曲霉Aspergillus tubingensis能不同程度地降解DON毒素[16-20]。

如上所述，病害防治和毒素的降解都可以利用微生物技術實現(xiàn)。如果能發(fā)現(xiàn)同時具有拮抗玉米穗腐病病原菌和降解病原菌產(chǎn)生毒素功能的微生物，則可以實現(xiàn)病害生防和降解毒素相結(jié)合。為此開展了本研究，以近年來玉米穗腐病的重要病原菌禾谷鐮孢為防治對象，從大田的玉米穗腐病病穗上分離到一株對該病原菌具有高效拮抗活性的細菌，并通過HPLC檢測了高活性拮抗菌對DON毒素的降解活性，為防治玉米穗腐病及降解DON毒素提供有益微生物資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試病原菌為禾谷鐮孢菌F. graminearumF18，從濟南歷城區(qū)彩石鎮(zhèn)西小龍?zhí)么逵衩滋锊∷肷戏蛛x、鑒定并保存；試驗用的生防和毒素降解菌株分離自從全國各地采集的玉米穗腐病病穗，保存于-80 ℃冰箱。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，去離子水定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min。綠豆湯產(chǎn)孢培養(yǎng)基：綠豆30 g，去離子水定容至1000 mL，煮沸去渣，121 ℃滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基：NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，瓊脂15 g，去離子水定容至1000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。LB液體培養(yǎng)基：NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，去離子水定容至1000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌 20 min。無機鹽培養(yǎng)液：NH4NO31 g，K2HPO4·3H2O 1.5 g，KH2PO40.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，去離子水定容至1000 mL，pH7.0。121 ℃滅菌20 min。NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖2.5 g，瓊脂18 g，去離子水定容至1000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

主要試劑：25%氰烯菌酯懸浮劑（江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司），引物、Bacterial DNA Kit均購自上海生工生物有限公司，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON，純度99%）購自百靈威公司。

儀器設備：上海精宏電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9082型）、哈東聯(lián)全溫振蕩器（HZQ-Q）、Millipore超純水儀（Q10）、Bio-Rad核酸凝膠成像儀（Universal Hood Ⅲ）、Eppendorf PCR儀（Flexlid）、Eppendorf臺式離心機（Centrifuge 5418）、HITACHI低溫高速離心機（CR22GⅢ）、上海精宏電熱恒溫水浴鍋（XMTD-8222）、Bio-Rad瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（Sub-Cell GT）、北京東林昌盛渦旋震蕩儀（Mini Vortex）、1260型高效液相色譜儀（Agilent）。

1.2 拮抗菌株的分離與篩選

1.2.1 拮抗菌株的分離 在超凈工作臺中，選取玉米病穗上病健交界處的病粒，放在100 mL無菌水中振蕩沖洗30 min，充分懸浮，制成菌懸液。將菌懸液用無菌水梯度稀釋至10-6濃度后，分別從10-4、10-5、10-6濃度的菌懸液中取100 μL涂布到LB培養(yǎng)基平板上，倒置于（28±0.5）℃恒溫避光培養(yǎng)48 h，然后挑取平板上形態(tài)、大小、顏色不同的單菌落到LB平板上劃線純化，編號，保存。

取保存于-80 ℃超低溫冰箱中的禾谷鐮孢F18菌塊接種到PDA平板上，于（28±0.5）℃恒溫避光培養(yǎng)。72 h后，轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。用直徑2.5 mm的打孔器打成菌片，備用。

1.2.2 對峙培養(yǎng)法檢測分離菌株對禾谷鐮孢F18的拮抗作用 從-80 ℃冰箱中取出分離菌株，在LB上活化培養(yǎng)24 h后，挑取拮抗菌株的單菌落，接種于PDA平板距中心2.5 cm處的十字對稱4點。PDA平板中央接種F18菌片，每個培養(yǎng)皿作為1次重復，設3次重復，以中心只接種F18菌片的PDA平板為對照。培養(yǎng)皿放于（28±0.5）℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)5～7 d，當對照病原菌菌絲長滿整個培養(yǎng)皿時，測定各處理中F18的菌落直徑，計算各細菌對F18菌絲生長的抑制率，抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

1.2.3 復篩檢測分離菌株對禾谷鐮孢F18的拮抗作用 方法參考文獻[21]：從-80 ℃冰箱中取出分離菌株，在LB上活化培養(yǎng)24 h后，取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h后，分別取2 mL培養(yǎng)液混合到15 mL PDA培養(yǎng)基中，倒平板，凝固后在平板的中心位置接種F18，置于（28±0.5）℃避光條件下進行培養(yǎng)，以中心只接種F18菌片的PDA平板為對照，每處理設3次重復。當對照病原菌菌絲長滿整個培養(yǎng)皿時，測定各處理中F18的菌落直徑，計算各細菌對F18菌絲生長的抑制率。

1.3 菌株TP的鑒定

1.3.1 菌株TP的形態(tài)學鑒定 把菌株TP接種到NA培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24和96 h，分別觀察單菌落形狀和大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落及培養(yǎng)基的顏色等。用革蘭氏染色法對菌體進行染色觀察[22]。

1.3.2 菌株TP 16S rDNA、gyrB基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將篩選出的降解DON活性好的菌株TP單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)16 h，用細菌基因組提取試劑盒提取DNA，以此DNA為模板進行16S rDNA的 PCR擴增，采用的通用引物為： 27 F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和 1492 R（5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′）。擴增條件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，34個循環(huán)；72 ℃ 10 min[23]。擴增產(chǎn)物由上海生工生物公司進行測定。

將篩選出的降解DON活性好的菌株TP單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)16 h，用細菌基因組提取試劑盒提取 DNA，以此 DNA為模板進行gyrB基因的 PCR擴增，采用的引物為：UP-1（5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′）和 UP-2r（5′-AGCAGGGTACG GATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′）。擴增條件：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 8 min[24]。擴增產(chǎn)物由上海生工生物公司進行測定。

將測定的16S rDNA和gyrB基因序列，分別與GenBank和EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中的已知16S rDNA和和gyrB基因序列進行同源性比較，選取屬內(nèi)同源性較高的細菌基因序列進行遺傳距離計算，使用MEGA 7中的ClustalW方法進行比對，并采用Neighbor Joining法[25]分別繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 拮抗菌株TP對DON的降解效果檢測

1.4.1 拮抗菌株TP的培養(yǎng)與樣品處理 將拮抗菌株TP接種到LB培養(yǎng)液中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，得到種子液，4 ℃、4000 r/min離心獲得菌體，菌體用無機鹽培養(yǎng)液洗滌兩次，以清除殘留的LB培養(yǎng)液，最后用無機鹽培養(yǎng)液重懸菌體，使得菌體濃度約為1011cfu/mL；在無菌試管中加入3 mL無機鹽培養(yǎng)液，加入10000 μg/mL的DON溶液6 μL，制成DON終濃度為20 mg/L，加入3 μL拮抗菌懸液，使其菌體濃度約為108cfu/mL，同時以按同比例加入DON毒素的無機鹽培養(yǎng)液作為對照，每處理設3次重復，分別在30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)4、6、8、10 d，取0.5 mL培養(yǎng)液，離心后取上清液，過0.22 μm微孔濾膜后與等體積色譜純乙腈混勻，作為樣品上樣液（樣品濃度被稀釋2倍），放于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 DON標準曲線的建立 準確稱取1.00 mg DON標準品，用乙腈溶解并定容至5 mL，配成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的標準儲備液。用乙腈-水（20:80，V/V）稀釋標準儲備液，配制成10、20、30、40和50 μg/mL的標準工作液。各取500 μL的標準系列濃度工作液過0.22 μm微孔濾膜后，用帶有紫外檢測器的高效液相色譜儀檢測其中DON含量，檢測條件：安捷倫C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：乙腈—水（20:80，V/V）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min，紫外檢測波長：220 nm；進樣量10 μL。以各濃度DON色譜峰面積為縱坐標，DON質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程。

1.4.3 拮抗菌株TP對DON降解效果檢測 取500 μL 1.4.1中制備的樣品上樣液，用帶有紫外檢測器的高效液相色譜儀檢測其中DON含量，檢測條件同1.4.2。降解率（%）=（對照DON含量－處理DON含量）/對照DON含量×100。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

在Microsoft Excel 2010中對平板抑菌率、DON降解率進行數(shù)據(jù)處理，用軟件SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，并用單因素方差分析的Duncan氏新復極差法進行多重檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離與篩選

2.1.1 拮抗菌株的分離 采用稀釋涂布平板法對全國 14個不同采樣點采集的玉米穗腐病病穗樣品進行分離，挑選不同形態(tài)、大小、顏色的細菌單菌落經(jīng)過純化后，共分離到385株細菌，分別編號，保存。

2.1.2 對峙培養(yǎng)法檢測分離菌株對禾谷鐮孢F18的拮抗作用 經(jīng)過初篩，共檢測到165株細菌菌株對禾谷鐮孢F18有不同程度的抑制作用，有55株的抑制率超過70%，其中有1株細菌菌株對F18具有很強的抑制作用，將其編號為TP。結(jié)果顯示，相比F18菌絲（圖1a），與TP對峙培養(yǎng)的F18菌絲生長緊湊，菌絲致密，貼著培養(yǎng)基表面生長，氣生菌絲很少，且菌落顏色呈白色，還未產(chǎn)生色素，TP對 F18的抑制率為70.63%（圖1b）。

圖1 TP菌株對禾谷鐮孢F18的拮抗作用Fig. 1 Antifungal activity of bacteria TP against F. graminearum F18

2.1.3 復篩檢測分離菌株對禾谷鐮孢F18的拮抗作用 初篩選出的55株拮抗菌株與病原菌F18進行共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，TP菌株對F18具有明顯抑制作用，與F18共培養(yǎng)6 d后，對F18菌絲的抑制率能達到99.50%，病原菌只在接種菌片周圍生長出少量氣生菌絲，說明TP菌株基本抑制了病原菌的生長（圖1c）。

2.2 菌株TP的鑒定

2.2.1 菌株TP的形態(tài)學鑒定 菌株TP在LB培養(yǎng)基平板上30 ℃培養(yǎng)48 h，單菌落基本呈圓形或橢圓形，乳白色不透明，菌落中間突起明顯，表面有褶皺，菌落較粘稠，菌體經(jīng)革蘭氏染色呈陽性，菌體桿狀，生長后期產(chǎn)生芽胞（圖2）。

圖2 拮抗菌TP的菌落、菌體和芽胞形態(tài)Fig. 2 Colony and microscopic morphology of antagonistic bacteria TP

2.2.2 菌株TP 16S rDNA、gyrB基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 由菌株TP的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹可知，TP（GenBank登錄號為 MW055629）與芽胞桿菌屬Bacillus處于同一分支，且與貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis聚類在一起，與其親緣關系最近，相似性為99%（圖3A）；對菌株TP（GenBank登錄號為MW091030）的gyrB基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，該菌株與貝萊斯芽胞桿菌親緣關系最近，相似性100%（圖3B）。結(jié)合形態(tài)學特征，將其鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。

圖3 基于16S rDNA（A）和gyrB基因（B）序列構(gòu)建的TP菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic trees of bacteria TP based on 16S rDNA (A) and gene gyrB (B) sequences

2.3 拮抗菌株對DON的降解效果檢測

2.3.1 DON標準曲線的建立 為了確立HPLC的檢測方法，根據(jù)不同質(zhì)量濃度的DON標準品溶液色譜峰面積繪制出DON的標準曲線，在DON為10～50 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，HPLC檢測的DON峰面積和DON的質(zhì)量濃度呈良好的線性關系，線性回歸方程為y＝5.3393x+1.351（R2＝0.9991）（圖4、5a）。

圖4 HPLC檢測DON的標準曲線Fig. 4 Standard curve for DON detection by HPLC

圖5 DON標準品和TP處理10 d后樣品的色譜圖Fig. 5 Chromatogram of DON standard and TP control for 10 d

2.3.2 拮抗菌株對DON降解效果檢測 HPLC檢測結(jié)果顯示，以只含DON的無機鹽培養(yǎng)液作為對照，該色譜條件下，DON的出峰時間約為3.771 min（圖5b）。TP在含有DON的無機鹽培養(yǎng)液里隨著培養(yǎng)時間的延長，DON的濃度呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，而對照中的DON濃度未發(fā)生明顯變化，表明TP對DON有降解能力（表1）。在培養(yǎng)4 d時，降解率為23.90%，此后降解速度較快，10 d時降解率就達到98.97%（圖5c）。

表1 菌株TP在不同培養(yǎng)時間對DON的降解Table 1 Degradation of DON by strain TP at different culture time

3 討論

玉米穗腐病在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，危害嚴重，被稱為玉米生產(chǎn)上的頭號病害[26]，在我國引起該病害的主要病原菌為禾谷鐮孢菌，它產(chǎn)生的DON毒素普遍存在于玉米及相關玉米制品中。2012年對中國飼料和原料調(diào)查發(fā)現(xiàn)，DON陽性率高達93%[27]；Binder等[28]對亞太地區(qū)采集的1291份代表性樣品分析發(fā)現(xiàn)，DON的檢出率達71%，其中毒素含量最高達18.991 mg/kg，超標近18倍。因此，DON已嚴重威脅食品安全和人畜健康。本研究從玉米穗腐病病粒上分離到一株貝萊斯芽胞桿菌 TP，該菌株對禾谷鐮孢菌具有較高的抑制活性，抑制率達到99.5%。該菌株對禾谷鐮孢菌產(chǎn)生的一種主要毒素DON具有很好的降解效果，其對DON的降解率為98.97%。以上研究結(jié)果表明，貝萊斯芽胞桿菌TP在防治禾谷鐮孢菌引起的玉米穗腐病以及降低其毒素危害的應用中具有廣闊的前景。

目前DON的降解途徑主要包括3C-OH氧化作用、開環(huán)氧化作用、糖苷化作用和結(jié)合與吸收作用、水合作用和3C-異構(gòu)化作用等[29-37]。據(jù)報道，微生物對DON生物降解主要有兩大途徑：一是瘤胃或腸道厭氧菌將DON降解成為去環(huán)氧化合物DOM-1，二是好氧菌將DON氧化成3-酮-DON，它的免疫毒性僅為DON的十分之一[34,35]。這些研究報道均為研究貝萊斯芽胞桿菌TP對DON的生物降解機理提供了理論依據(jù)和指導方向，我們也將進一步分析菌株降解DON后的分解產(chǎn)物，探討其生物降解機理，同時進行菌株的毒性試驗，為其實際應用提供可靠的理論依據(jù)。