生防多粘類芽胞桿菌P1懸浮劑的研制

于穩(wěn)欠，李宏玉，陳 晨，吳紫燕，宋曉雨，毛偉力*

（1. 上海萬力華生物科技有限公司，上海 201203；2. 大理州植保植檢站，大理 671000）

多粘類芽胞桿菌P. polymyxa是廣泛分布在植物體表和根際土壤的一種革蘭氏陽性細(xì)菌[1]。它不僅產(chǎn)生抗逆性芽胞，還能產(chǎn)生多種功能性次級代謝產(chǎn)物，已被廣泛地應(yīng)用在植物病害的生物防治、農(nóng)田施用的生物肥料、鹽堿地修復(fù)等農(nóng)業(yè)綠色防控、“雙增雙減”和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域[2-4]。美國環(huán)保署（EPA）已將多粘類芽胞桿菌作為一種可商用的微生物，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為免做安全鑒定的一級菌種[4]。芽胞桿菌所形成的芽胞對外界的不良環(huán)境條件有較強(qiáng)的抗逆性，便于菌劑的生產(chǎn)和加工，有利于儲(chǔ)存、運(yùn)輸，以及在不同環(huán)境中的存活、定殖和傳播[5-7]。目前，我國以多粘類芽胞桿菌作為活性成分登記的生物農(nóng)藥制劑已有10多個(gè)，主要用于防治番茄、煙草、辣椒、茄子的青枯病，黃瓜細(xì)菌性角斑病，西瓜枯萎病、炭疽病和小麥赤霉病等[8]。

懸浮劑（suspension concentrates，SC）是以水作為稀釋劑或分散介質(zhì)的一種環(huán)保型農(nóng)藥劑型，將難溶于水的固體原藥經(jīng)砂磨和各種助劑的作用，使之均勻地分散，形成一種能流動(dòng)、高懸浮、細(xì)小且較穩(wěn)定的液固相分散體系[9,10]。與可濕性粉劑（WP）相比，SC在生產(chǎn)制作和使用時(shí)無粉塵漂移，對人畜及環(huán)境安全，同時(shí)具有優(yōu)良的分散性、展著性和流動(dòng)性等優(yōu)點(diǎn)；與乳油（EC）相比，SC可避免使用大量的有機(jī)溶劑，不易燃、不易爆、低毒、低藥害，安全性高[11]。SC是目前最受市場青睞的一種劑型，也是聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）推薦的環(huán)保劑型之一[12]。武漢科諾生物科技股份有限公司開發(fā)的5億CFU/g多粘類芽胞桿菌KN-03懸浮劑，其登記的作物和防治對象分別為：番茄青枯病、黃瓜細(xì)菌性角斑病、西瓜枯萎病、小麥赤霉?。唤K省蘇科農(nóng)化有限責(zé)任公司登記的60億芽胞/mL解淀粉芽胞桿菌LX-11懸浮劑，可防治水稻白葉枯病和水稻細(xì)菌性條斑病；江蘇常隆農(nóng)化有限公司登記的80億CFU/ml 枯草芽胞桿菌懸浮劑，可防治黃瓜白粉病[8]。

在研制開發(fā)微生物農(nóng)藥制劑過程中，由于受到微生物自身對外界物理、化學(xué)等因素要求的限制，從而在對各種功能助劑進(jìn)行篩選時(shí)，以及在加工設(shè)備和制作工藝的選用上，都必須考慮這些限制因素。例如各種助劑對制劑的潤濕性、分散性、懸浮率等理化性質(zhì)上，不僅要達(dá)到國家制定的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)在使用這些助劑時(shí)還必須盡可能地保持微生物的活性、活性成分的功能釋放和較長的貨架期。為了開發(fā)安全、環(huán)保、高效的多粘類芽胞桿菌P1懸浮劑（P1-SC），本研究在充分考慮了以上各限制因素的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了多種合理的篩選，為P1-SC的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了可參考的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌：多粘類芽胞桿菌P1 由上海萬力華生物科技有限公司（上海萬力華）分離、鑒定和保存。該菌株現(xiàn)保藏在中國微生物菌種保藏管理中心（保藏編號CGMCC No.13554）。P1菌粉：含菌量≥10.18 lg cfu/g；P1發(fā)酵液：含菌量≥9.18 lg cfu/mL（均由上海萬力華提供）；潤濕分散劑：500#（十二烷基苯磺酸鈣）（江蘇茂亨化工有限公司）、MOA-7（脂肪醇與環(huán)氧乙烷縮合物）（江蘇省海安石油化工廠）、K12（十二烷基硫酸鈉）（蘇州源泰潤化工有限公司）、木鈉、NNO（2-萘磺酸甲醛聚合物鈉鹽）、Morwet D-425萘磺酸鹽縮聚物（均采自南京捷潤科技有限公司）、tween-80、OP-10（上海潤捷化學(xué)試劑有限公司提供）；防腐劑：山梨酸鉀（河南旗諾食品配料有限公司）、萬立凈 C25、BIT20（均采自上海萬厚生物科技有限公司）；增稠劑：硅酸鎂鋁（杭州品贏新材料有限公司）、黃原膠（內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司）；防凍劑：丙三醇、乙二醇（均采自南京古田化工有限公司）；紫外（UV）保護(hù)劑：黃原膠、VC（河南旗諾食品配料有限公司）、淀粉（趙縣裕豐淀粉制品有限公司）、CMC（羧甲基纖維素鈉）（上海潤捷化學(xué)試劑有限公司）；消泡劑（江蘇賽歐信越消泡劑有限公司）。

1.2 儀器

電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；立式砂磨機(jī)（萊州市科達(dá)化工機(jī)械有限公司）；剪切乳化機(jī)（齊威儀器）；冰箱（青島海爾股份有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；pH計(jì)（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；NDJ-1旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 助劑的篩選

1.3.1 潤濕分散劑的篩選 對材料中提供的8種潤濕分散劑進(jìn)行初篩，采用流點(diǎn)測試法[13]，試驗(yàn)重復(fù)5次。選用流點(diǎn)較小的潤濕分散劑，通過粘度曲線法來確定潤濕分散劑的最佳用量。以粘度值為縱坐標(biāo)，潤濕分散劑用量為橫坐標(biāo)，繪制粘度曲線。粘度最低值所對應(yīng)的潤濕分散劑用量為最佳用量，并結(jié)合懸浮率、活菌數(shù)進(jìn)行指標(biāo)測試。

生物相容性：分別取上述潤濕分散劑1 mL或1 g，加入到49 mL的P1發(fā)酵液中，混合均勻，以不加潤濕分散劑發(fā)酵液為對照，每個(gè)處理3個(gè)平行，36 ℃培養(yǎng)2 d，比較不同的潤濕分散劑對P1菌含量的影響。

1.3.2 增稠劑的篩選 在已篩選出的潤濕分散劑的基礎(chǔ)上，分別添加0.10%、0.15%、0.2%黃原膠，0.5%、0.75%、1.0%硅酸鎂鋁，以及 0.15%＋0.5%、0.15%＋0.75%、0.15%＋1.0%黃原膠與硅酸鎂鋁的復(fù)合，有效成分和其他助劑百分比相同。將P1-SC樣品在（54±2）℃熱貯14 d后，測試各樣品的流動(dòng)性、析水率以及分層狀況、活菌數(shù)。

1.3.3 UV保護(hù)劑的篩選 將黃原膠、VC、淀粉、CMC按0.1%的比例加工成不同的P1-SC樣品，攪拌均勻后稀釋涂布在PDA平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次，以不加UV保護(hù)劑為對照，并放置在距離紫外燈60 cm處，照射時(shí)間分別為0.5、1和2 h，置于36 ℃恒溫培養(yǎng)，2 d后統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)。

1.3.4 防腐劑的篩選 選擇與P1生物相容性較好的山梨酸鉀、萬立凈C25和BIT20，用量分別為0.1%、0.2%、0.3%，其他成分保持不變，加工成不同的P1-SC樣品，取100 mL樣品放置在250 mL的三角瓶中常溫貯存7、14 d后，觀察樣品有無霉變和異味，根據(jù)霉層大小（霉層占三角瓶內(nèi)樣品液面的面積）和變質(zhì)情況篩選最優(yōu)防腐劑和用量。

1.3.5 防凍劑的篩選 將上述篩選出的潤濕分散劑、防腐劑、增稠劑以及紫外保護(hù)劑與 P1混合，配制成P1-SC樣品后，分別將1%、2%、3%的乙二醇、丙三醇加入制劑中，放置在（-4±2）℃ 貯存7 d，測定樣品懸浮率、流動(dòng)性、菌含量以及析水率。

1.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)上述結(jié)果對關(guān)鍵因素500#、MOA-7、硅酸鎂鋁、丙三醇的用量進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，其他成分保持不變。試驗(yàn)共設(shè)上述4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表（表1）。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal test of factor and level

1.5 懸浮劑的制備及質(zhì)量檢測

按照流程圖1進(jìn)行懸浮劑的制備，將稱量好的0.15%黃原膠中加入3%的丙三醇，攪拌均勻，讓黃原膠充分溶脹，至完全溶解，備用。將2.5% 500#、2.5% MOA-7、0.75%硅酸鎂鋁、0.15%黃原膠、3%丙三醇、0.2%萬立凈C25、0.3%消泡劑，軟水補(bǔ)足至100%，經(jīng)剪切乳化機(jī)高速攪拌均勻后經(jīng)砂磨機(jī)砂磨2～3 h，再加入10% P1菌粉剪切攪拌均勻后經(jīng)過濾（100目）獲得P1-SC。

圖1 P1-SC制備工藝流程圖Fig. 1 Flowchart of the process for preparation of P1-SC

對菌劑的質(zhì)量指標(biāo)測定方法如下：參照GB/T 1601—1993方法[14]測定pH；參照GB/T 14825—2006方法[15]測定懸浮率；參照GB/T 19136—2003方法[16]測定熱貯穩(wěn)定性；參照GB/T 19137—2003方法[17]測定冷貯穩(wěn)定性；參照GB/T 31737—2015方法[18]測定傾倒后殘余物和洗滌后殘余物；參照GB/T 28137—2011方法[19]測定持久起泡性；參照GB/T 16150-1995方法[20]中的“濕篩法”進(jìn)行濕篩試驗(yàn)；析水率的測定即取5 mL的待測液置于離心機(jī)中，以3000 r/min離心30 min后取出，觀察析水的體積，其中析水體積＜5%時(shí)為合格，析水體積＜1%或無析水時(shí)為最佳，當(dāng)析水體積＞5%為不合格[21]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2007進(jìn)行圖表繪制，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與顯著性差異分析采用SPSS Statistics 17.0和單因素ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 潤濕分散劑的篩選

8種潤濕分散劑進(jìn)行流點(diǎn)和生物相容性測試結(jié)果表明，流點(diǎn)在1.0以下的潤濕分散劑可用于菌劑P1-SC的制備。500#、MOA-7以及K12、木鈉可作為本制劑的潤濕分散劑，但木鈉對P1的活性影響較大，而500#、MOA-7、K12對P1生長活性影響較?。ū?）。因此，選擇500#、MOA-7、K12 作為最佳用量篩選對象。

表2 潤濕分散劑的篩選結(jié)果Table 2 Results of the screening test for wetting dispersants

添加了不同比例的500#（A）、MOA-7（B）、K12（C）粘度曲線圖2可以看出，粘度均隨著潤濕分散劑用量的增加，表現(xiàn)出先降低后增大的趨勢；而懸浮率則正好相反，表現(xiàn)出先增大后下降的趨勢；當(dāng)500#的用量為 2%～3%時(shí)，粘度最低為 225～281 mPa·s，懸浮率最高為 97.5%～98.6%；當(dāng) MOA-7的用量為2.5%～3.5%時(shí)，體系粘度最低為246～322 mPa·s，懸浮率最高為97.6%～98.4%；當(dāng) K12的用量為1%時(shí)，體系粘度最低為287 mPa·s，懸浮率最高為97.8%。由于K12在砂磨過程中出現(xiàn)大量泡沫，故選擇500#、MOA-7進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 不同含量的潤濕分散劑500#、MOA-7、K12對P1-SC黏度的影響Fig. 2 Effects of different contents of wetting dispersants 500#, MOA-7 and K12 on the viscosity of P1-SC

2.2 增稠劑的篩選

增稠劑的篩選結(jié)果見表3，P1-SC在分層狀況、流動(dòng)性及析水率方面，黃原膠表現(xiàn)出較好的效果，優(yōu)于硅酸鎂鋁，但二者復(fù)配效果優(yōu)于二者單一使用。二者復(fù)配得到的產(chǎn)品出現(xiàn)分層現(xiàn)象概率較低，且流動(dòng)性和析水率均最佳，最終選用黃原膠復(fù)配硅酸鎂鋁作為P1-SC的增稠劑。

表3 增稠劑的篩選結(jié)果Table 3 Result of the screening test for thickeners

2.3 紫外保護(hù)劑的篩選

UV保護(hù)劑的篩選結(jié)果見表4，UV輻射30s后，經(jīng)黃原膠、CMC、淀粉以及VC處理的P1-SC、P1芽胞數(shù)均保持在9.18 lg cfu/mL以上，其中，經(jīng)黃原膠處理的P1的芽胞數(shù)（9.26 lg cfu/mL）顯著高于CK處理（9.15 lg cfu/mL）；UV輻射1 h后，經(jīng)CMC、淀粉以及VC處理的P1芽胞數(shù)急劇下降到9.10 lg cfu/mL及以下，顯著低于經(jīng)黃原膠處理的P1的芽胞數(shù)（9.21 lg cfu/mL）；UV輻射2 h后，經(jīng)黃原膠、CMC和淀粉處理的P1的芽胞數(shù)（≥9 lg cfu/mL），顯著高于CK處理（8.83 lg cfu/mL）。篩選結(jié)果表明，黃原膠不僅能降低UV對P1活性的影響，還能在SC中作為增稠劑，故選擇黃原膠作為P1-SC的UV保護(hù)劑。

表4 UV保護(hù)劑篩選結(jié)果Table 4 Result of the screening test for UV protectants

2.4 防腐劑的篩選

篩選結(jié)果表明，與山梨酸鉀、BIT20相比較，加入0.2%～0.3%萬立凈C25防腐效果更好，P1-SC中無霉層、無異味；而加入0.20%山梨酸鉀處理14 d后，P1-SC中有少許異味，霉層面積達(dá)1/6，加入BIT20對P1-SC沒有起到防腐效果（表5）。

表5 防腐劑的篩選結(jié)果Table 5 Result of the screening test for preservatives

2.5 防凍劑的篩選

篩選結(jié)果表明，加入2.0%～3.0% 的乙二醇或丙三醇，P1-SC在-4 ℃沒有出現(xiàn)冰水混合現(xiàn)象，而丙三醇在懸浮率、流動(dòng)性等方面的效果好于乙二醇，且樣品中無析水現(xiàn)象（表6）。

表6 防凍劑的篩選結(jié)果Table 6 Results of the screening test for antifreeze

2.6 消泡劑用量的選擇

本試驗(yàn)中，只對有機(jī)硅消泡劑的用量進(jìn)行測試結(jié)果表明，有機(jī)硅消泡劑的最佳使用量為0.3%，對P1-SC的消泡效果較好，熱貯測試后合格。

2.7 正交試驗(yàn)優(yōu)化配方

通過正交設(shè)計(jì)方案，產(chǎn)品經(jīng)（54±2）℃熱貯14 d的懸浮率≥90%，活菌數(shù)≥9.18 lg cfu/mL。得到正交試驗(yàn)最優(yōu)方案為A2B1C2D3，即最優(yōu)添加助劑組合為2.5% 500#、2.5% MOA-7、0.5%硅酸鎂鋁、3%丙三醇（表7）。該組合經(jīng)熱、冷貯后未出現(xiàn)析水、分層以及凝固等現(xiàn)象。

表7 潤濕分散劑正交試驗(yàn)方案及各項(xiàng)指標(biāo)測定結(jié)果Table 7 Orthogonal test of wetting and dispersing agents

2.8 P1-SC制劑質(zhì)量及貨架期檢測結(jié)果

P1-SC外觀為棕色液體，貯存過程中性狀良好，P1-SC的芽胞含量 9.29 lg cfu/mL；pH 6.2，雜菌率為1.03%，細(xì)度（≤75 μm）通過率98.5%，持久泡沫量（1 min 后）為3 mL，懸浮率為98.0%，傾倒后殘余物質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.64%，洗滌后殘余物質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%（表8）。冷熱及常溫條件下6個(gè)月后，活菌數(shù)在9.18 lg cfu/mL以上（圖3）。

表8 P1-SC產(chǎn)品質(zhì)量檢測結(jié)果Table 8 Result of quality control test for P1-SC

圖3 P1-SC在不同溫度儲(chǔ)存條件下6個(gè)月后的有效活菌數(shù)Fig. 3 The viable spores of P1-SC stored under different temperatures for 6 months

3 討論

我國從20世紀(jì)70年代開始研制懸浮劑，到21世紀(jì)初，已在制劑配方、加工工藝和產(chǎn)品種類、數(shù)量等方面，都獲得了較大的發(fā)展[9]。但與發(fā)達(dá)國家如：美國、英國等所開發(fā)和應(yīng)用的 SC產(chǎn)品相比，我國生產(chǎn)的 SC，還存在著與物理穩(wěn)定性相關(guān)的一些問題，如在貯存過程中易發(fā)生分層、沉淀，有效成分分布不均勻，以及易結(jié)塊等現(xiàn)象，影響了SC類產(chǎn)品在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的推廣和應(yīng)用[22]。近10多年來，隨著砂磨工藝技術(shù)和設(shè)備的不斷完善，配合先進(jìn)的檢測儀器，以及高品質(zhì)分散劑、潤濕劑等新型高效添加劑的應(yīng)用，SC已成為含有多種類農(nóng)藥活性成分[23]，深受廣大用戶喜愛的劑型之一。將本研究開發(fā)的P1-SC用于對廣東菜心根腫病防治的室內(nèi)藥效試驗(yàn)結(jié)果表明（已錄用，未發(fā)表），P1-SC對菜心根腫病的防治效果與用藥濃度呈正相關(guān)。當(dāng)施用P1-SC 稀釋到6.0 lg cfu/mL時(shí)，對菜心根腫病的防治效果為83.0%，與化學(xué)農(nóng)藥500 mg/L氟啶胺SC的防治效果（100.0%）沒有顯著性差異，但顯著性高于（P≤0.05）一種商用枯草芽孢桿（7.3 lg cfu/mL）的防治效果（29.8%）。

SC劑型通常是由制劑中的活性成分與添加的各種助劑混合后，通過濕法研磨并攪拌，使之均勻分散懸浮在水中，形成穩(wěn)定的懸浮液體，平均粒徑為：＜5 μm[10]。謝蘭芬等[24]在研究解淀粉芽胞桿菌B9601-Y2懸浮劑的工藝時(shí)均使用了砂磨機(jī)，而多粘類芽胞桿菌的芽胞大小為（2～5 μm）×（0.6～0.8μm）[25]，本研究試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在砂磨過程中會(huì)造成P1-SC部分芽胞的損傷，因此將制作工藝調(diào)整為只對所用的助劑進(jìn)行砂磨后，再加入P1菌粉進(jìn)行剪切攪拌，以獲得無損傷P1芽胞的SC產(chǎn)品。UV輻射對活體微生物有一定的殺傷作用，是影響生防制劑田間應(yīng)用效果的重要因素之一，在生防制劑中加入一定量的UV保護(hù)劑來提高活體微生物在應(yīng)用環(huán)境中的存活率，是一種常用手段[26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，黃原膠能較好地防護(hù)P1芽胞免于來自UV的影響，與張俊祥等[27]在解淀粉芽胞桿菌GB1水懸浮劑的研究結(jié)果一致，當(dāng)紫外燈照射1 h后，加入了黃原膠的P1-SC，其活菌數(shù)仍保持在9.18 lg cfu/mL以上。SC是一種水分散體系，當(dāng) SC產(chǎn)品中所加入的助劑含有一定的營養(yǎng)成分，容易被外界多種雜菌或生防菌自身所利用，導(dǎo)致制劑的平衡體系被破壞[24]。為防止此現(xiàn)象的出現(xiàn)，制劑中需加入合適的防腐劑。易敏等[28]研制的斜紋夜蛾多角體病毒懸浮劑的pH 6～8，并篩選出酸性的苯甲酸鈉作為該制劑的防腐劑。本研究結(jié)果顯示，在P1-SC制劑中添加0.10%～0.30%的BIT20沒有起到防腐效果，而將酸性的萬立凈C25作為P1-SC的防腐劑，能明顯抑制雜菌污染。