類芽胞桿菌W51菌劑制備及對番茄青枯病的防效研究

蔡傅紅 ，袁志香 ，史雨琪，朱晶鳳，韋 歡，丁志鵬，張彎彎，顏歆雯，劉紅霞，王曉莉，王云鵬

（1．淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院/江蘇省益生菌制劑重點實驗室，淮安 223003；2．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，南京 210095）

番茄是我國重要的蔬菜作物，近年來生產(chǎn)規(guī)模不斷擴大。由青枯勞爾氏菌R.solanacearum引起的細(xì)菌性土傳病害，導(dǎo)致番茄產(chǎn)量急劇下降，造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。青枯病原菌可通過雨水、灌溉、地下蟲害或操作工具等方式從番茄的根部、莖基部皮孔或傷口侵入并潛伏，條件適宜時在維管束內(nèi)迅速繁殖，堵塞導(dǎo)管使植株得不到應(yīng)有的水分和營養(yǎng)而萎蔫死亡[2]。該病害一旦發(fā)病便難以控制，常造成番茄植株的大面積枯萎死亡，嚴(yán)重制約了番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3,4]。

目前，對番茄青枯病的防治已有諸多報道，比如藥劑灌根、作物輪種、抗性育種等，但尚無穩(wěn)定有效的防治措施[5,6]。近年來，生物防治已成為一種安全可靠的病害防治方法[7,8]。利用生防菌株如無致病力青枯菌[9]、假單胞菌[10,11]、芽胞桿菌[12,13]等對番茄青枯病進行生物防治的方法已引起廣大科研人員和農(nóng)藥公司的研究興趣，其中芽胞桿菌是多種病原菌的拮抗菌，能預(yù)防和控制多種作物病害，被普遍認(rèn)為是一種環(huán)境友好、經(jīng)濟有效的病害防治途徑[14,15]。目前，國內(nèi)外利用生防菌株防治番茄青枯病取得了一定的研究進展，但仍然缺少高效、低毒、安全的微生物制劑產(chǎn)品[16]。

伊利石是一種常見的黏土礦物，含有大量金屬陽離子如 Fe2+、Mg2+、Si2+等[17]可以與細(xì)菌細(xì)胞壁表面的肽聚糖相結(jié)合。此外，伊利石晶體所具有的大比表面積的特征也使得其具備良好的靜電吸附性能，這些特征使得伊利石在水中能夠聚集細(xì)菌菌體[17,18]。但有關(guān)以粘土礦物吸附劑為載體制備的微生物制劑對番茄青枯病防治研究鮮有報道。本研究以伊利石為載體吸附生防菌從而制得微生物制劑，并用于番茄青枯病的防治，為番茄青枯病的防治提供有效措施。

1 材料與方法

1.1 伊利石

伊利石購自河南舒山伊利石礦業(yè)開發(fā)有限公司，粒度＜2 μm，Al2O3＞32%，K2O＞6%，SiO2＜54%，TiO2＋Fe2O3＜1%，自然白度＞85%。

1.2 菌株與培養(yǎng)條件

病原菌選用青枯勞爾氏菌ZJ3721，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院提供；類芽胞桿菌W51分離自江蘇省淮安市馬頭鎮(zhèn)番茄種植園土壤。培養(yǎng)青枯勞爾氏菌ZJ3721的固體培養(yǎng)基為YGPA培養(yǎng)基[19]（葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，瓊脂18 g，用蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0）；類芽胞桿菌W51的固體培養(yǎng)基為LB瓊脂培養(yǎng)基（NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，瓊脂18 g，用蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0）。培養(yǎng)青枯勞爾氏菌ZJ3721和類芽胞桿菌W51的種子液培養(yǎng)基為YGPB培養(yǎng)基（葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，用蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0），青枯勞爾氏菌ZJ3721擴繁培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基（NaCl 5 g，蛋白胨10 g，牛肉浸粉5 g，用蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0），類芽胞桿菌W51擴繁培養(yǎng)基為PDB液體培養(yǎng)基（馬鈴薯浸出粉8 g，葡萄糖20 g，用蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0）。

1.3 類芽胞桿菌W51對青枯勞爾氏菌ZJ3721的抑菌試驗

將保存在甘油管中的類芽胞桿菌W51于LB平板上活化，32 ℃培養(yǎng)48 h后接種至YGPB液體培養(yǎng)基中，32 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，用無菌PDB液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至1×108CFU/mL；將保存在甘油管中的青枯勞爾氏菌ZJ3721于YGPA平板上活化，35 ℃培養(yǎng)24 h后接種至YGPB液體培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，用無菌NB液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至1×108CFU/mL。采用平板對峙法測定拮抗菌類芽胞桿菌W51對青枯勞爾氏菌ZJ3721的抑制能力[20,21]，取100 μL青枯勞爾氏菌ZJ3721菌懸液均勻涂布在LB平板中，在LB平板上放置無菌濾紙片，加入類芽胞桿菌W51菌懸液，空白用無菌PDB液體培養(yǎng)基做對照，試驗重復(fù)3次，35 ℃培養(yǎng)24 h后觀察統(tǒng)計抑菌圈直徑。

1.4 類芽胞桿菌W51的鑒定

將待測菌株接種在NB培養(yǎng)基中32 ℃培養(yǎng)24 h，以10000 g/min離心15 min收集菌體。用細(xì)菌DNA提取試劑盒（Promega，美國）提取所分離類芽胞桿菌W51的全基因組，以其為模板進行16S rDNA基因的PCR 擴增，擴增引物為細(xì)菌16S rDNA基因通用引27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')[22-24]。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：反應(yīng)體系混合液25 μL，上、下游引物各2 μL，樣品DNA提取液1 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃復(fù)性90 s，重復(fù)25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序，將16S rDNA測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對，再用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 吸附條件篩選

1.5.1 最佳吸附配比篩選 將振蕩培養(yǎng)24 h的類芽胞桿菌W51培養(yǎng)液以1:500接種至PDB液體培養(yǎng)基中，32 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，3500 g/min離心30 min，棄上清，沉淀用無菌水重懸至OD600＝0.8，此時菌懸液的濃度約為1×109CFU/mL。選取質(zhì)量比為1%、2%、3%、4%、5%、6%的伊利石（根據(jù)前期試驗結(jié)果表明所選濃度對菌體生長無影響）進行最佳吸附配比的篩選試驗，使用蔗糖密度梯度法[25]測定不同比例的伊利石粉對類芽胞桿菌菌體的吸附效果。

向濃度為1×109CFU/mL的類芽胞桿菌W51菌懸液中加入上述配比的無菌伊利石，于搖床中32 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，取混合液于試管中，向其底部緩慢加入等體積的60%質(zhì)量濃度的無菌蔗糖溶液，靜置2 h。吸附在伊利石上的菌體會下沉至蔗糖溶液的底部，而未被吸附的菌體則繼續(xù)停留在蔗糖溶液的上層，吸取上層混合液稀釋涂平板，32 ℃培養(yǎng)12 h后計單菌落數(shù)，計算吸附率C，選取最佳吸附率的伊利石粉添加配比進行后續(xù)試驗。C（%）＝（1－m/M）×100，其中m表示加入吸附劑后的混合液在蔗糖溶液上層的單菌落數(shù)，M表示未加入吸附劑的菌懸液在蔗糖溶液上層的單菌落數(shù)。

1.5.2 最佳吸附時間篩選 選取10、20、30、40、50、60 min進行最佳吸附時間的篩選試驗，使用蔗糖密度梯度法測定不同比例的伊利石粉對類芽胞桿菌W51菌體的吸附效果。

向類芽胞桿菌W51菌懸液中加入已篩選出的最佳配比的無菌伊利石粉，分別于搖床中32 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)上述吸附時間，取混合液于試管中，向其底部緩慢加入等體積的60%質(zhì)量濃度的無菌蔗糖溶液，靜置2 h后吸取上層液體稀釋涂平板，32 ℃培養(yǎng)12 h后計數(shù)單菌落數(shù)并按公式計算吸附率。

1.6 伊利石吸附W51菌劑的制備

將保存在甘油管中的類芽胞桿菌W51于LB平板上活化，32 ℃培養(yǎng)48 h后接種至YGPB液體培養(yǎng)基中，32 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，將類芽胞桿菌W51培養(yǎng)液以1:500接種至PDB液體培養(yǎng)基中，32 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后3500 g/min離心30 min，棄上清，沉淀用無菌水重懸至OD600＝0.8，此時菌懸液的濃度約為1×109CFU/mL，向菌懸液中加入4%的滅菌后的伊利石粉（121 ℃高壓滅菌20 min），于搖床中32 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，即為所需的伊利石吸附W51菌劑。

1.7 溫室防效試驗

將番茄種子（品種為上海合作903）先用無菌水沖洗兩遍，后用75%酒精浸泡2 min，再用無菌水沖洗3遍，消毒后的番茄種子在培養(yǎng)皿中催芽。72 h后選取發(fā)芽種子播種至穴盆中，當(dāng)番茄苗生長至5～6片真葉時選取長勢一致的苗轉(zhuǎn)移至盆缽（11 cm×10 cm×8 cm）中，每盆種植1株番茄，45 d后進行試驗處理。試驗設(shè)3個處理：（1）空白對照組，向每盆的番茄根部灌入20 mL無菌水；（2）類芽胞桿菌W51菌懸液處理組，向每盆的番茄根部灌入20 mL類芽胞桿菌W51（濃度為1×109CFU/mL）菌懸液；（3）伊利石吸附W51菌劑處理組，向每盆的番茄根部灌入20 mL伊利石吸附W51菌劑（濃度為1×109CFU/mL）；7 d后向每盆的番茄苗灌入20 mL青枯勞爾氏菌ZJ3721（濃度為1×107CFU/mL），每個處理組有24棵番茄苗，試驗重復(fù)3次。溫室試驗條件為35 ℃、自然光照。在10～14 d對番茄青枯病的發(fā)病情況進行統(tǒng)計，按照李茹等[27]、Hai等[28]報道的方法，記錄分析病情指數(shù)和防效：0級，無癥狀；1級，1片葉枯萎；2級，2～3片葉枯萎；3級，除底部2～3片葉外，其他葉片均枯萎；4級，整株葉片枯萎；病情指數(shù)＝∑（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）/（最高病級數(shù)×總植株數(shù)）×100，防效（%）＝（對照組病害病情指數(shù)－處理組病害病情指數(shù)）/對照組病害病情指數(shù)×100。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計并計算吸附率、不同處理組的病情指數(shù)和防效，利用IBM SPSS Statistics 23數(shù)據(jù)分析軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。數(shù)據(jù)繪圖工作利用Origin 8.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 類芽胞桿菌W51對青枯勞爾氏菌ZJ3721的抑菌效果

類芽胞桿菌W51對青枯菌ZJ3721有較好的抑制效果（圖1），抑菌圈直徑達(dá)到3.79 cm。

圖1 類芽胞桿菌W51對青枯菌ZJ3721的抑制作用Fig. 1 Inhibition of Paenibacillus sp. W51 on R. solanacearum ZJ3721

2.2 類芽胞桿菌W51的基因測序分析

測序獲得菌株 W51的 16S rDNA序列長度為 1436 bp，該序列在 NCBI上進行序列同源性比對（GenBank登錄號：SUB9552020EDF300401MZ049605），選擇同屬的模式菌株利用MEGA 7.0構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，菌株W51與GenBank中報道的類芽胞桿菌Paenibacillussp.KCTC13919的相似性最高為99.65%（圖2），初步判斷菌株W51為類芽胞桿菌。

圖2 類芽胞桿菌W51基于16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic relationships between Paenibacillus sp. W51based on the 16S rDNA

2.3 吸附條件優(yōu)化

未加伊利石的菌體由于其密度低于蔗糖溶液而始終懸浮在蔗糖溶液的上層，在添加伊利石后菌體吸附在伊利石上，由于伊利石密度大，吸附在伊利石上的菌體而下沉（圖3）。吸附顯微觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未加入伊利石吸附前類芽胞桿菌W51菌體呈分散狀態(tài)（圖3C），而加入伊利石吸附后，絕大多數(shù)類芽胞桿菌W51菌體在伊利石的附近出現(xiàn)聚集現(xiàn)象（圖3D），表明伊利石具有良好吸附菌體的能力。

圖3 伊利石對類芽胞桿菌W51的吸附效果Fig. 3 The adsorption effect of illite on Paenibacillus sp. W51

吸附配比篩選試驗結(jié)果表明，在1%～4%的吸附劑比例下，伊利石對類芽胞桿菌W51的吸附效率顯著增加，分別為（58.05±0.62）%、（78.29±1.60）%、（85.92±0.44%）和（90.39±1.29）%。當(dāng)伊利石比例超過4%時，吸附率曲線趨于平穩(wěn)，5%時吸附率為（90.76±1.06）%，6%時吸附率為（91.36±0.40）%，這可以解釋為伊利石對類芽胞桿菌W51的吸附逐漸達(dá)到飽和（圖4A）。因此，選取4%作為最佳吸附比例。

圖4 最佳吸附條件篩選結(jié)果Fig. 4 Optimal adsorption conditions screening results

吸附時間篩選試驗結(jié)果顯示，隨著吸附時間的延長，吸附率不斷上升，在吸附時間為30 min 時吸附率達(dá)到峰值，為（90.78±1.36）%。隨著吸附時間的延長，吸附率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，在40、50和60 min時分別為（90.42±1.54）%、（90.06±1.12）%和（89.18±1.56）%（圖4B）。因此，選取30 min作為最佳吸附時間。

2.4 溫室防效試驗

空白對照組番茄植株在青枯勞爾氏菌ZJ3721處理第9 d開始發(fā)病，至第14 d空白對照組發(fā)病最嚴(yán)重。接種病原菌后，試驗組的番茄病情指數(shù)始終顯著低于同一時期空白對照組的病情指數(shù)（P＜0.05），這表明類芽胞桿菌W51菌懸液以及伊利石吸附W51菌劑均對番茄青枯病有顯著的防治效果；且伊利石吸附W51菌劑處理組的番茄病情指數(shù)始終顯著低于同一時期類芽胞桿菌W51菌懸液處理組的病情指數(shù)（P＜0.05）；10～14 d時伊利石吸附W51菌劑處理組的生防效果高于類芽胞桿菌W51菌懸液處理（P＜0.05），通過伊利石吸附后的類芽胞桿菌W51菌體相較于單一類芽胞桿菌W51菌體則具有較高的生物防治效果。此外，伊利石吸附W51菌劑處理組番茄植株前期（0～9 d）無發(fā)病現(xiàn)象，比空白對照組延遲發(fā)病2 d，比類芽胞桿菌W51菌懸液處理組延遲發(fā)病1 d，且該處理10～14 d內(nèi)對番茄青枯病的防效始終穩(wěn)定在69.23%以上，顯著優(yōu)于類芽胞桿菌W51菌懸液處理組的42.91%（P＜0.05）（表1）。

表1 類芽胞桿菌W51和伊利石吸附W51菌劑對番茄青枯病的防治效果Table 1 The control effects of Paenibacillus sp. W51 and illite adsorption W51 agents against tomato bacterial wilt

3 討論

番茄青枯病是番茄維管束系統(tǒng)性病害之一，發(fā)病嚴(yán)重時造成植物青枯死亡，導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收[29]。目前國內(nèi)外已有許多利用生防菌株防治番茄青枯病，從而降低青枯病侵染番茄而造成的影響，如喬俊卿等[30]篩選出的枯草芽胞桿菌Bs916對番茄進行灌根處理，可有效減輕番茄的青枯病，防效達(dá)到55.60%；王麗麗等[30]施用拮抗菌株處理3次，番茄青枯病的田間防治效果達(dá)到43%；Frey等[32]利用無致病力青枯菌進行番茄青枯病的防治，也有較好的防效。本研究主要是利用伊利石吸附類芽胞桿菌W51制得的伊利石吸附W51菌劑對番茄青枯病的防治，其防治效果達(dá)到69.23%，相對于其他單一生防菌對番茄青枯病有較高的防治效果。

許多生防菌在實際應(yīng)用時顯現(xiàn)出受環(huán)境因素影響大、防效不佳、防效時間短等問題，郭堅華等[33]認(rèn)為抑菌能力強的菌株，如果在生防應(yīng)用受到外界壞境條件的影響，防治效果就會不理想。近年來，隨著材料科學(xué)的發(fā)展，粘土類礦物表面的物化性質(zhì)不斷被闡明，利用粘土礦物為載體富集菌體可以使得生防菌免受外界不良環(huán)境的影響，進而更好地發(fā)揮出生防菌株的防治潛力。伊利石是一種常見的粘土礦物，其表面帶有大量的陽離子，可以與細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖相結(jié)合，吸附大量的芽胞桿菌[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，將單一的類芽胞桿菌W51用于防治番茄青枯病，其生防效果為42.91%，但用伊利石吸附類芽胞桿菌W51制得的伊利石吸附W51菌劑用于番茄青枯病防治，其生防效果達(dá)到69.23%。為了保證伊利石吸附W51菌劑能夠更好地發(fā)揮生防作用，還需要在今后的工作中進行防治番茄青枯病的田間試驗，并進一步研究伊利石吸附W51菌劑對土壤生態(tài)壞境和田間微生物種群結(jié)構(gòu)及數(shù)量的變化。本研究開發(fā)的伊利石吸附 W51菌劑可以為以后的研究工作提供參考。