鷹嘴豆多肽的免疫活性研究

王亞非，于淼淼，于 悅，陳 卓，丁 越，黃 珊，沈明浩

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春130000；2長春海關(guān)技術(shù)中心，吉林 長春 130031)

鷹嘴豆(CiceraretinumL.)別名雞心豆，屬豆科鷹嘴豆屬植物，其播種面積大，資源豐富，營養(yǎng)價(jià)值極高，是天然的植物蛋白資源[1]。因此，以鷹嘴豆為原料加工的鷹嘴豆餅、鷹嘴豆罐頭等相關(guān)食品，具有成為主流豆類食品的潛質(zhì)。鷹嘴豆中蛋白質(zhì)含量約占籽粒干質(zhì)量的30%，且其蛋白類成分在增強(qiáng)免疫力[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、降低膽固醇[5]等方面的生理活性遠(yuǎn)高于大豆及豌豆等豆類作物，因而受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

有研究表明，從豆科作物中分離出的多肽類物質(zhì)可以有效提高生物體對疾病的抵御能力，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，激發(fā)非特異性免疫防御系統(tǒng)，從而使生物體免受侵害。這些多肽類物質(zhì)的分子質(zhì)量主要介于50～1 000 u[6-7]。張健等[8]研究發(fā)現(xiàn)，大豆肽能顯著提高小鼠血清中IgM、IgG及IgA的含量，從而顯著增強(qiáng)體液免疫功能。楊健等[9]研究發(fā)現(xiàn)，綠豆肽具有免疫調(diào)節(jié)功能，可通過抑制巨噬細(xì)胞自噬、改變其分泌的細(xì)胞因子水平而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性。

近年來，對鷹嘴豆多肽(chickpea peptides，CP)的免疫調(diào)節(jié)作用研究還處于初級階段。高捷等[10]研究發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆多肽對荷瘤小鼠的特異性和非特異性免疫功能具有明顯的促進(jìn)作用；劉艷等[11]研究表明，鷹嘴豆多肽中谷氨酸和天冬氨酸占比最高，且其分子質(zhì)量主要集中在1 000 u以下；李?，B等[12]研究認(rèn)為，富含谷氨酸、天冬氨酸等疏水性氨基酸的鷹嘴豆多肽對免疫功能低下小鼠具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性。本研究從鷹嘴豆多肽對環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠和RAW264.7細(xì)胞的影響,來探究其免疫調(diào)節(jié)功能和作用機(jī)制，以期為我國西北地區(qū)鷹嘴豆的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動物 SPF級BALB/C雌鼠，體質(zhì)量(21±2) g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK(遼)2020-0001。

1.1.2 主要試劑 鷹嘴豆，購自新疆木壘縣；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶及免疫球蛋白G(IgG)、IgA、IgM、干擾素-γ(IFN-γ)、NO、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β檢測試劑盒，購自福建泉州市九邦生物科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)，購自上海源葉生物科技有限公司；RAW264.7細(xì)胞，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院安全實(shí)驗(yàn)室保存；環(huán)磷酰胺和脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀，江蘇常州德社精密儀器有限公司產(chǎn)品；低溫自動平衡離心機(jī)，遼寧遼陽弘揚(yáng)分離設(shè)備有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀和氨基酸自動分析儀，日本島津公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱，美國NUAIRE公司產(chǎn)品。

1.2 鷹嘴豆多肽的制備及其分子質(zhì)量分布與氨基酸組成測定

參考葉健明等[13]的復(fù)合酶解方法制備鷹嘴豆多肽。以鷹嘴豆豆粉為原料，用堿溶酸沉法制得鷹嘴豆蛋白質(zhì)，采用堿性蛋白酶進(jìn)行初步酶解，再用質(zhì)量比1∶1混合的中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解，酶解條件(經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得到)為：加酶量5 300 U/g，pH 7，酶解時(shí)間3.5 h，酶解溫度55 ℃，在此工藝下多肽得率為63.94%。酶解樣品采用葡聚糖凝膠柱純化。

采用高效液相色譜(HPLC)對鷹嘴豆多肽的分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，色譜柱為TSK G2000SW(300×7.5 mm)，洗脫溶劑為50 mmol/L、pH 5.0的磷酸鹽緩沖液，其中含有1 g/L三氟乙酸和350 mL/L甲醇。流動相流速為0.75 mL/min，洗脫組分采用波長220 nm紫外波檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白的分子質(zhì)量曲線確定多肽的分子質(zhì)量。

依據(jù)《食品中氨基酸的測定》(GB 5009.124-2016)，用氨基酸自動分析儀測定鷹嘴豆多肽的氨基酸組成及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 鷹嘴豆多肽免疫活性的測定

1.3.1 試驗(yàn)動物分組與處理 取60只小鼠，連續(xù)3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺(80 mg/kg)建立免疫功能低下的動物模型。建模成功后，取50只免疫功能低下小鼠隨機(jī)均分為5組，即模型組(灌胃生理鹽水)及陽性對照組(灌胃匹多莫德25 mg/kg)和鷹嘴豆多肽低劑量組(灌胃鷹嘴豆多肽50 mg/kg)、中劑量組(灌胃鷹嘴豆多肽100 mg/kg)、高劑量組(灌胃鷹嘴豆多肽200 mg/kg)，另取10只健康小鼠作為空白組(灌胃生理鹽水)。各組小鼠每日灌胃1次相應(yīng)物質(zhì)，連續(xù)灌胃21 d。

1.3.2 胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的測算 21 d的灌胃試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取6只小鼠稱體質(zhì)量，眶靜脈采血后斷頸處死，分離胸腺和脾臟并稱其質(zhì)量，按下述公式計(jì)算胸腺和脾臟的器官指數(shù)：器官指數(shù)=器官質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.3.3 脾臟組織和胸腺組織形態(tài)的觀察 采用常規(guī)方法將脾臟和胸腺固定、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色(hematoxylin eosin staining，HE染色)后，分別觀察形態(tài)變化。

1.3.4 脾淋巴細(xì)胞增殖情況測定 稱取相同質(zhì)量1.3.2中所用6只小鼠的脾臟，無菌條件下制備脾淋巴細(xì)胞懸液[14]，臺盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)，要求細(xì)胞活率>95%。取 96 孔細(xì)胞板，對照孔加100 μL脾淋巴細(xì)胞懸液(3×106mL-1)，刺激孔加100 μL同濃度脾淋巴細(xì)胞懸液和終質(zhì)量濃度為5 μg/mL的刀豆蛋白(ConA)，各5個重復(fù)。培養(yǎng)20 h后加20 μL MTT(5 mg/mL)再培養(yǎng)4 h，然后加150 μL DMSO，于10 min后測定490 nm處吸光度值(OD490)。用刺激指數(shù)(SI)來反映各組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率，SI =刺激孔OD490/對照孔OD490。

1.3.5 血清中免疫球蛋白和細(xì)胞因子水平的測定 將小鼠血樣2 000 r/min離心15 min后取血清，用試劑盒檢測血清中IgG、IgA、IgM及IFN-γ、IL-6、IL-2的質(zhì)量濃度。

1.3.6 RAW264.7細(xì)胞增殖率、吞噬能力和細(xì)胞因子水平的測定 (1)增殖率。向96孔細(xì)胞板中加入RAW264.7細(xì)胞懸液(1.6×105mL-1) 180 μL/孔，于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為空白對照組、陽性對照組和鷹嘴豆多肽試驗(yàn)組，空白組僅加入10 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，陽性對照組加入10 μL LPS(終質(zhì)量濃度為2 μg/mL)，鷹嘴豆多肽試驗(yàn)組加入10 μL不同質(zhì)量濃度(50，100，200和400 μg/mL)的鷹嘴豆多肽溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后加入20 μL MTT(5 mg/mL)培養(yǎng)4 h后棄上清，加200 μL DMSO，于490 nm處測定吸光度值，計(jì)算SI。

(2)吞噬能力。細(xì)胞培養(yǎng)和處理方法同1.3.6(1)中，結(jié)束后吸取培養(yǎng)液，空白對照組僅加入150 μL紅細(xì)胞裂解液，其余各組加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.075%中性紅溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后吸棄中性紅溶液，用PBS清洗2次，加入150 μL紅細(xì)胞裂解液，在540 nm波長處檢測各孔吸光度值(OD540)。計(jì)算相對吞噬率:吞噬率=(試驗(yàn)組OD540/空白組OD540)×100%。

(3)細(xì)胞因子水平。 細(xì)胞培養(yǎng)與處理方法同1.3.6(1)中，培養(yǎng)結(jié)束后吸取培養(yǎng)液，采用ELISA試劑盒測定NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理和差異顯著性分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)值”表示，用Origin 8.5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鷹嘴豆多肽的分子質(zhì)量分布與氨基酸組成

鷹嘴豆多肽分子質(zhì)量分布HPLC分析結(jié)果如圖1所示。

圖1 鷹嘴豆多肽分子質(zhì)量的分布Fig.1 Molecular mass distribution of chickpea peptides

圖1顯示，樣品出峰時(shí)間主要集中在14.0～25.0 min，保留時(shí)間16.8 min所出峰的分子質(zhì)量為1 476 u；18.2 min所出峰的分子質(zhì)量為673 u；20.4 min所出峰的分子質(zhì)量為411 u；22.3 min所出峰的分子質(zhì)量為118 u，該多肽組分峰面積占總面積的2.6%，為游離氨基酸，可知葡聚糖凝膠柱純化后多肽純度為97.4%。鷹嘴豆多肽分子質(zhì)量主要集中在1 500 u以下，在1 500～120 u的多肽組分占87.1%，其中分子質(zhì)量在1 000 u以下的多肽組分占74.9%。有文獻(xiàn)報(bào)道，分子質(zhì)量介于1 000～50 u的多肽類物質(zhì)具有良好的免疫活性[6-7]，據(jù)此可知本研究制備的鷹嘴豆多肽免疫活性良好。

表1顯示，鷹嘴豆多肽富含谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、亮氨酸、絲氨酸等氨基酸，其中谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(18.412%)，其次是天冬氨酸及精氨酸,分別占9.592%和7.088%。

表1 鷹嘴豆多肽的氨基酸組成及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Amino acid composition and mass fraction of chickpea peptides

2.2 鷹嘴豆多肽對小鼠體質(zhì)量和免疫器官的影響

如表2所示，各組小鼠初始體質(zhì)量無明顯差異，21 d后，模型組小鼠體質(zhì)量及免疫器官指數(shù)極顯著低于空白組(P<0.01)，表明脾臟和胸腺組織明顯受損，顯示造模成功。鷹嘴豆多肽高劑量組小鼠體質(zhì)量較模型組顯著增加(P<0.05)，表明其具有增加小鼠體質(zhì)量的功效；鷹嘴豆多肽低、中劑量組免疫臟器指數(shù)顯著或極顯著提高(P<0.05)，高劑量組極顯著提高(P<0.01)，表現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系，說明其具有改善免疫器官損傷的作用。

表2 鷹嘴豆多肽對小鼠體質(zhì)量和免疫器官指數(shù)的影響Table 2 Effect of chickpea polypeptides on mouse body weight and immune organ indexes

2.3 鷹嘴豆多肽對小鼠脾臟和胸腺組織結(jié)構(gòu)的影響

脾臟組織切片染色結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，空白組小鼠的脾臟紅、白髓界線清楚，視野中無可見病變，白髓中存在較多結(jié)構(gòu)完整的脾小體，紅髓中脾索整體相連，脾竇明顯。模型組小鼠脾臟紅髓與白髓邊界消失，各視野組織幾乎變成單細(xì)胞，組織結(jié)構(gòu)明顯破損。與模型組相比，鷹嘴豆多肽中、高劑量組和陽性對照組的紅髓、白髓界線清晰，脾索網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)良好。表明鷹嘴豆多肽緩解了環(huán)磷酰胺引起的小鼠脾臟組織學(xué)病變。

胸腺組織切片染色結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，空白組小鼠胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)界限分明，皮質(zhì)顏色較深，面積較廣，可以觀察到胸腺細(xì)胞排列緊密(圖3-A)。模型組小鼠胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)界限不清，皮質(zhì)占比縮小而髓質(zhì)占比增加，皮質(zhì)區(qū)胸腺細(xì)胞數(shù)量減少(圖3-B)。與模型組相比，鷹嘴豆多肽低、中、高劑量組皮質(zhì)占比增加，皮、髓質(zhì)界線逐漸清晰，中、高劑量組基本恢復(fù)到空白組水平(圖3-D，E，F(xiàn))。表明鷹嘴豆多肽也可緩解環(huán)磷酰胺引起的小鼠胸腺組織學(xué)病變。

A1.空白組(×100)；A2.空白組(×200)；B1.模型組(×100)；B2.模型組(×200)；C1.陽性對照組(×100)；C2.陽性對照組(×200)； D1～F1.鷹嘴豆多肽低、中、高劑量組(×100)；D2～F2.鷹嘴豆多肽低、中、高劑量組(×200)。.白髓， .紅髓A1.Blank group(×100)；A2.Blank group(×200)；B1.Model group(×100)；B2.Model group(×200)；C1.Positive group(×100)； C2.Positive group(×200)；D1-F1.Chickpea polypeptide low,medium and high dose groups (×100)； D2-F2.Chickpea polypeptide low,medium and high dose groups(×200)..White pulp, .Red pulp圖2 鷹嘴豆多肽對小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of chickpea polypeptides on spleen tissue morphology in mice

A.空白組；B.模型組；C.陽性對照組；D～F.鷹嘴豆多肽低、中、高劑量組。.皮質(zhì)， .髓質(zhì)A.Blank group;B.Model group;C.Positive group;D-F.Chickpea polypeptide low,medium and high dose groups..Cortex, .Medulla圖3 鷹嘴豆多肽對小鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)的影響(×100)Fig.3 Effect of chickpea polypeptides on tissue structure of thymus in mice(×100)

2.4 鷹嘴豆多肽對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

由圖4可知，模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率(刺激指數(shù))極顯著低于空白組(P<0.01)；鷹嘴豆多肽各劑量組小鼠經(jīng)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖率與模型組相比顯著或極顯著提高，并表現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系，其中高劑量組作用效果最明顯。

2.5 鷹嘴豆多肽對血清免疫球蛋白和細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的影響

由表3可知，模型組小鼠的血清IgG、IgA和IgM質(zhì)量濃度均極顯著低于空白組(P<0.01)；鷹嘴豆多肽各劑量組小鼠的IgG、IgA和IgM質(zhì)量濃度大多顯著或極顯著高于模型組，且隨鷹嘴豆多肽用量的增加而升高，存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

從表4可以看出，模型組小鼠細(xì)胞因子IL-2、IL-6和IFN-γ質(zhì)量濃度均極顯著低于空白組(P<0.01)。鷹嘴豆多肽組小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-6和IFN-γ質(zhì)量濃度與空白組小鼠相比均有所降低，其中低、中劑量組顯著或極顯著降低，高劑量組降低不顯著。與模型組相比，鷹嘴豆多肽組小鼠血清中IL-2、IL-6和IFN-γ質(zhì)量濃度大多顯著或極顯著增加，且具有劑量效應(yīng)關(guān)系。

與空白組相比，圖柱上標(biāo)*表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)**表示 差異極顯著(P<0.01)； 與模型組相比，圖柱上標(biāo)#表示差異 顯著(P<0.05)，標(biāo)##表示差異極顯著(P<0.01)。圖6，7同Compared with the blank group,* indicates significant difference (P<0.05),and ** indicates very significant difference (P<0.01); Compared with the model group,# indicates significant difference (P<0.05),and ## indicates extremely significant difference (P<0.01).The same for Fig.6 and 7圖4 鷹嘴豆多肽對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of chickpea polypeptides on proliferation of mouse spleen lymphocytes

表3 鷹嘴豆多肽對小鼠血清免疫球蛋白質(zhì)量濃度的影響Table 3 Effect of chickpea polypeptides on mass concentration of serum immunoglobulin in mice serum

表4 鷹嘴豆多肽對小鼠血清細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的影響Table 4 Effect of chickpea polypeptides on mass concentration of cytokines in mice serum pg/mL

2.6 鷹嘴豆多肽對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

由表5可知，隨著鷹嘴豆多肽質(zhì)量濃度的增加，RAW264.7細(xì)胞的增殖率逐漸增大，其中當(dāng)質(zhì)量濃度為200和400 μg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖率分別為15.76%和22.62%，與空白組差異極顯著(P<0.01)。表明鷹嘴豆多肽可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖，且表現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.7 鷹嘴豆多肽對RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的作用

由圖5可以看出，空白組RAW264.7細(xì)胞較小，呈圓形(圖5-A)；陽性對照組細(xì)胞增大，呈梭形并且出現(xiàn)偽足(圖5-B)；鷹嘴豆多肽組細(xì)胞也增大，細(xì)胞趨于長梭形，其中400 μg/mL劑量組細(xì)胞與陽性對照組細(xì)胞形態(tài)相近。表明鷹嘴豆多肽可以刺激RAW264.7細(xì)胞形態(tài)由正常狀態(tài)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。

表5 鷹嘴豆多肽對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Table 5 Effect of chickpea polypeptide on proliferation of RAW264.7 cells

A.空白組；B.陽性對照組；C～F.鷹嘴豆多肽質(zhì)量濃度分別為50，100，200和400 μg/mLA.Blank group;B.Positive control group;C-F.Chickpea polypeptide mass concentrations are 50,100,200 and 400 μg/mL,respectively圖5 鷹嘴豆多肽對RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)Fig.5 Effect of chickpea peptides on morphology of RAW264.7 cells(×100)

CP50,CP100,CP200,CP400分別代表50,100,200,400 μg/mL 鷹嘴豆多肽處理。圖7同CP50,CP100,CP200 and CP400 represent 50,100,200 and 400 μg/mL chickpea polypeptide treatments,respectively. The same for Fig.7圖6 鷹嘴豆多肽對RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的作用Fig.6 Effect of chickpea polypeptides on phagocytic ability of RAW264.7 cells

由圖6可以看出，與空白組相比，鷹嘴豆多肽處理組(50 μg/mL組除外)可以顯著增加RAW264.7細(xì)胞的相對吞噬率(P<0.05)，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，表明鷹嘴豆多肽可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞吞噬作用的提升。

2.8 鷹嘴豆多肽對RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響

與空白組相比，不同質(zhì)量濃度鷹嘴豆多肽組RAW264.7細(xì)胞的NO和TNF-α水平均極顯著提高(P<0.01)，且隨著質(zhì)量濃度升高作用效果加強(qiáng)(圖7-A，B)。與空白組對比， 100～400 μg/mL鷹嘴豆多肽組均能夠顯著或極顯著提高RAW264.7細(xì)胞的IL-6和IL-1β水平，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系(圖7-C,D)。表明鷹嘴豆多肽可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞分泌NO、IL-6、IL-1β和TNF-α，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

3 討 論

鷹嘴豆資源豐富，營養(yǎng)成分含量極高，是天然的植物蛋白資源。由鷹嘴豆蛋白質(zhì)酶解得到的鷹嘴豆多肽必需氨基酸種類齊全且分子質(zhì)量相對較小，易于消化吸收[15]。本研究所得鷹嘴豆多肽分子質(zhì)量主要集中在1 000 u以下，富含谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、亮氨酸、絲氨酸等，其中谷氨酸含量最高，占18.412%；其次是天冬氨酸和精氨酸，分別占9.592%和7.088%。有研究表明，豆科植物分子質(zhì)量在1 000 u以下的蛋白肽具有良好的免疫活性，其中含有谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等疏水性氨基酸的多肽免疫調(diào)節(jié)活性較強(qiáng)[16-18]。

圖7 鷹嘴豆多肽對RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響Fig.7 Effect of chickpea polypeptide on cytokine secretion of RAW264.7 cells

本研究采用環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫功能低下的小鼠模型，模型組小鼠的免疫器官指數(shù)、血清免疫球蛋白及IL-2、IL-6和IFN-γ質(zhì)量濃度均顯著降低，說明免疫功能低下模型建造成功。本研究結(jié)果顯示，鷹嘴豆多肽可提升免疫功能低下小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，可有效緩解環(huán)磷酰胺對小鼠脾臟和胸腺組織的損傷，表明鷹嘴豆多肽對小鼠胸腺和脾臟有一定的保護(hù)和損傷修復(fù)作用。本研究結(jié)果還表明，鷹嘴豆多肽可以促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，提升經(jīng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率。同時(shí)，鷹嘴豆多肽可以有效增強(qiáng)免疫功能低下小鼠血清中IL-2、IL-6和IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。IL-2主要由Th1細(xì)胞分泌，是一種有效的T淋巴細(xì)胞生長因子，且IL-2可以促進(jìn)Th1細(xì)胞自身的增殖與分化，在機(jī)體的細(xì)胞免疫方面發(fā)揮著重要作用[19-20]；IL-6作為一種免疫調(diào)節(jié)因子，其功能多樣，在許多方面發(fā)揮著重要作用，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長與分化，如促進(jìn)機(jī)體T細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)NK細(xì)胞分化等[21-22]；IFN-γ為Th1細(xì)胞產(chǎn)生的多效能活性蛋白質(zhì)，可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，也可增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力[23-24]。本研究結(jié)果顯示，鷹嘴豆多肽可有效促進(jìn)小鼠體內(nèi)多種細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而通過細(xì)胞免疫途徑增強(qiáng)小鼠的免疫力。環(huán)磷酰胺對小鼠血清IgG質(zhì)量濃度影響較為明顯，而IgG是血清中質(zhì)量濃度最高的抗體，產(chǎn)生于主動免疫后，主要發(fā)揮體液免疫功能[25]。本研究中，鷹嘴豆多肽對環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠血清IgG、IgA和IgM質(zhì)量濃度下降有顯著的恢復(fù)作用，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，表明鷹嘴豆多肽可能通過體液免疫途徑增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。綜上所述，鷹嘴豆多肽可以通過促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖和血清細(xì)胞因子的分泌來提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，通過提高血清免疫球蛋白的質(zhì)量濃度來提高機(jī)體的體液免疫，這是其增強(qiáng)免疫功能的機(jī)制之一。

以巨噬細(xì)胞為主的吞噬細(xì)胞是病毒入侵和癌癥發(fā)生的首要防線[26]。巨噬細(xì)胞被激活后，細(xì)胞增殖率顯著增加，并可分泌大量與免疫活性相關(guān)的細(xì)胞因子，如炎性介質(zhì)NO和細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β等[27]，促進(jìn)T細(xì)胞活化[28]。本研究考察了鷹嘴豆多肽對RAW264.7細(xì)胞功能的影響，發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆多肽可活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO及細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。這從另一個角度說明，增強(qiáng)機(jī)體的先天性免疫功能也是鷹嘴豆多肽發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制之一。

4 結(jié) 論

鷹嘴豆多肽可以顯著改善環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠多項(xiàng)免疫相關(guān)指標(biāo)的下降情況，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，同時(shí)可以有效激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬能力，誘導(dǎo)白介素等細(xì)胞因子的生成，從而提高機(jī)體的先天性免疫機(jī)能。鷹嘴豆多肽具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性，可有效增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，具有極大的開發(fā)利用價(jià)值。