陜西周至杏樹(shù)流膠病病原菌鑒定及其對(duì)3種藥劑的敏感性

許 靜，李 晶，張雨溪

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安710065)

杏樹(shù)是一種宜林宜果的果樹(shù)，不僅能起到抵御風(fēng)沙、保護(hù)農(nóng)田、改善環(huán)境的生態(tài)作用，其果實(shí)還具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。杏樹(shù)在我國(guó)主要分布在東北、華北和西北地區(qū)，其中，陜西杏樹(shù)栽培面積約有 10.7 萬(wàn)hm2，是全國(guó)第三大產(chǎn)區(qū)[1-3]。

流膠病是杏樹(shù)最主要的病害之一，流行范圍廣泛，輕者引起杏減產(chǎn)，重者可造成絕收，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。杏樹(shù)流膠病可分為生理性流膠和侵染性流膠2種，其中生理性流膠主要由蟲(chóng)傷、切口等機(jī)械性傷口引起，而侵染性流膠則是由輪枝孢菌、葡萄座腔菌等真菌侵染造成[4-6]。流膠主要發(fā)生在杏樹(shù)的枝干上，在病害處流出透明的樹(shù)膠，與空氣接觸后，樹(shù)膠逐漸變成褐色，成為晶瑩柔軟的膠塊，最后變成深褐色硬質(zhì)膠塊。此外，流膠處常呈腫脹狀，病部皮層及木質(zhì)部逐漸褐化腐朽，嚴(yán)重時(shí)可造成整株樹(shù)死亡[5,7]。其果實(shí)也會(huì)流膠, 多在有蟲(chóng)傷的傷口處發(fā)生, 樹(shù)膠糊在果面上, 導(dǎo)致果實(shí)停止生長(zhǎng)。該病在春季到秋季均可發(fā)生，每年5月下旬至6月中旬和8月下旬至9月中旬出現(xiàn)發(fā)病高峰[7]。流膠病的防治主要有以下方法：首先是農(nóng)業(yè)防治，包括及時(shí)清理果園移走感染源，及時(shí)排澇防旱減少發(fā)病條件，合理施肥以改善杏樹(shù)長(zhǎng)勢(shì)，適度修剪以減少傷口和病原侵入口[8-9]。其次是生物防治，楊艷敏[10]和Li等[11]分別篩選出1株對(duì)桃樹(shù)流膠病有較好防治效果的解淀粉芽孢桿菌；董施源等[12]從健康桃樹(shù)葉片中分離篩選到1株枯草芽孢桿菌，其對(duì)造成桃流膠病的可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)有較強(qiáng)的拮抗作用。再次，合理應(yīng)用病毒也是潛在的生防手段，Yang等[13]鑒定了一種可感染葡萄座腔菌的正義單鏈RNA病毒。最后是化學(xué)防治，將病部流膠和潰爛組織刮除干凈后，用殺菌劑涂抹傷口，也可進(jìn)行噴灑或灌根處理[7-8]。但目前最有效、最直接和最穩(wěn)定的防治方法還是依賴(lài)于殺菌劑的化學(xué)防治。

近幾年流膠病在陜西周至杏樹(shù)果園廣泛流行，對(duì)果農(nóng)造成較大經(jīng)濟(jì)損失，但其病因尚不明確。因此，本研究通過(guò)對(duì)發(fā)病果園內(nèi)杏樹(shù)流膠病枝取樣，用組織培養(yǎng)法進(jìn)行病原菌的分離純化，采用形態(tài)學(xué)和ITS序列分析法進(jìn)行病原菌鑒定，再用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定3種市面常用殺菌劑對(duì)該病菌的抑制作用，以期為該病的診斷和田間有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與純化

從陜西周至杏李研究所采集有流膠病癥的杏樹(shù)枝條帶回實(shí)驗(yàn)室，自來(lái)水沖洗后用體積分?jǐn)?shù)75%酒精擦拭表面，用滅菌解剖刀切成小塊后置于PDA平板中心，25 ℃培養(yǎng)，定期觀察菌落生長(zhǎng)情況并及時(shí)轉(zhuǎn)接新的PDA平板進(jìn)行純化，得到分離病原菌的純培養(yǎng)。

1.2 病原菌的致病性測(cè)定

取幼嫩健康的杏樹(shù)枝條，用體積分?jǐn)?shù)75%酒精進(jìn)行表面消毒后，切成9 cm枝條段，用無(wú)菌解剖刀小心刮掉表皮，露出木質(zhì)層。用滅菌的直徑9 mm打孔器從培養(yǎng)4 d的PDA平板上取帶有新鮮菌絲的菌餅，有菌絲一面貼緊枝條傷口處，覆蓋吸有無(wú)菌水的無(wú)菌脫脂棉，用封口膜固定。將接種后的枝條放入裝有100 mL無(wú)菌水的組培瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中(溫度25 ℃，光照周期16 h/8 h，相對(duì)濕度70%)培養(yǎng)6 d，每天更換培養(yǎng)枝條用水，以無(wú)菌的純PDA培養(yǎng)基瓊脂塊接種為對(duì)照，定期觀察病癥發(fā)展情況。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 將分離純化的菌株接種于PDA平板中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察菌落顏色、表面紋飾、形態(tài)與質(zhì)地，描述其培養(yǎng)特征。將菌株接種在水瓊脂培養(yǎng)基上，光照條件下培養(yǎng)2周后在顯微鏡(Nikon)下觀察其分生孢子形態(tài)。

1.3.2 ITS序列分析 收集長(zhǎng)滿(mǎn)平板的新鮮菌絲，用天根公司植物全基因組抽提試劑盒提取總DNA，然后使用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：ITS1 和ITS4各1 μL,2×PCR Mix(天根公司) 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL,DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)34次；最后72 ℃延伸10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并將擴(kuò)增后的ITS片段送至上海生工生物股份有限公司測(cè)序。

將獲得的ITS序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對(duì)，根據(jù)序列覆蓋率確定該菌所屬種類(lèi)，然后用MEGA軟件通過(guò)鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.4 病原菌對(duì)3種藥劑的敏感性測(cè)定

1.4.1 供試藥劑 供試3種藥劑分別為：70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(山東百農(nóng)思達(dá)生物科技有限公司),2.6%靚果安水劑(主要成分為生物堿和梔子甙，山東濰坊奧豐作物病害防治有限公司),2%潰腐靈水劑(主要成分為蒼術(shù)素和厚樸酚，山東濰坊奧豐作物病害防治有限公司)。

1.4.2 含藥培養(yǎng)基的制備 配制含藥培養(yǎng)基時(shí)，3種藥劑均設(shè)置6個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度有10個(gè)平板，3次重復(fù)。其中70%甲基硫菌靈可濕性粉劑先用無(wú)菌水溶解后再按比例加入培養(yǎng)基，終質(zhì)量濃度分別為0.25，0.5，1，2，4，8 μg/mL；2.6%靚果安水劑直接按比例加入PDA培養(yǎng)基中倒平板，終質(zhì)量濃度分別為10.835，21.67，43.3，86.7，173.3，520 μg/mL；2%潰腐靈水劑直接按比例加入PDA培養(yǎng)基，終質(zhì)量濃度分別為10.45，20.83，41.67，166.67，666.7，20 000 μg/mL。以不加藥的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.4.3 敏感性的測(cè)定 將分離得到的病原菌轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d，用直徑4 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，轉(zhuǎn)接到含藥和對(duì)照平板中央，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)照平板基本長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲，采用十字交叉法測(cè)量各平板上的菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率(抑制率=(對(duì)照菌落直徑-含藥菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%)。用SPSS 23對(duì)不同處理的菌落直徑進(jìn)行差異顯著性分析。將藥劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換為以10為底的對(duì)數(shù)值(X)，菌絲生長(zhǎng)抑制率轉(zhuǎn)換為概率值(Y)，通過(guò)Excel軟件對(duì)藥劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值和菌絲生長(zhǎng)抑制率概率值進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算各藥劑對(duì)病原菌的半最大效應(yīng)濃度(concentration of 50% of maximal effect,EC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏樹(shù)流膠病病原菌分離物SXZZ的致病性

用實(shí)驗(yàn)室人工接種分離的杏樹(shù)流膠病病原菌病原菌(編號(hào)為SXZZ)接種健康杏樹(shù)枝條3 d后，接種部位呈黑褐色，有少許白色或灰白色菌絲生長(zhǎng)；6 d后接種處呈黑色并開(kāi)始出現(xiàn)流膠癥狀；對(duì)照枝條僅傷口處略呈深褐色，無(wú)菌絲生長(zhǎng)或流膠癥狀(圖1)。用接種后發(fā)病的枝條重新進(jìn)行病原菌分離純化，得到的病原菌菌落形態(tài)和分生孢子與接種所用的病原菌完全一致，根據(jù)柯赫氏法則，可以確定分離得到的病原菌就是引起杏樹(shù)流膠病的病原菌。

A.對(duì)照枝條；B.接種SXZZ 3 d后的枝條；C.接種SXZZ 6 d后的枝條A.Control twig;B.Twig inoculated with SXZZ for 3 d; C.Twig inoculated with SXZZ for 6 d圖1 杏樹(shù)流膠病病原菌SXZZ的致病性觀察Fig.1 Evaluation of the pathogenicity of the apricot gummosis pathogen SXZZ

2.2 杏樹(shù)流膠病病原菌分離物SXZZ的形態(tài)特性

杏樹(shù)流膠病病原菌分離物SXZZ在PDA平板上菌落為圓形，菌絲為絨毛狀，培養(yǎng)初期菌落呈白色或灰白色(圖2-A)，隨后逐漸變?yōu)榛疑?，至培養(yǎng)后期呈黑色(圖2-B)。在顯微鏡下觀察，菌絲無(wú)色有隔(圖2-C)；分生孢子紡錘形，無(wú)色，單孢，基部鈍圓，頂部稍尖(圖2-D)。根據(jù)病原菌形態(tài)特征，參照葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)真菌相關(guān)文獻(xiàn)，初步鑒定其為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)。

A.培養(yǎng)4 d后的菌落形態(tài)；B.培養(yǎng)2周后的菌落形態(tài)；C.菌絲形態(tài)；D.分生孢子形態(tài)A.Colony morphology after 4 days culture;B.Colony morphology after 2 weeks culture; C.Mycelium morphology;D.Conidia morphology

2.3 杏樹(shù)流膠病病原菌分離物SXZZ的ITS序列分析

對(duì)杏樹(shù)流膠病病原菌分離物SXZZ的通用引物PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將獲得的序列上傳至GenBank(序列登錄號(hào)為MW250225)， Blast比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，其與葡萄座腔菌的同源性高達(dá)99%(圖3)。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，可以確定陜西周至地區(qū)杏樹(shù)流膠病病原菌為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)，其分類(lèi)地位為子囊菌門(mén)腔菌綱格孢腔菌目葡萄座腔菌科葡萄座腔菌屬。

圖3 杏樹(shù)流膠病病原菌分離物SXZZ的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of apricot gummosis pathogen SXZZ

2.4 杏樹(shù)流膠病病原菌對(duì)3種藥劑的敏感性

甲基硫菌靈、靚果安和潰腐靈為市面常用的防治果樹(shù)流膠病的3種藥劑，為探究其能否用于防治由葡萄座腔菌引起的杏樹(shù)流膠病，本研究測(cè)定了這3種藥劑對(duì)杏樹(shù)流膠病病原菌的抑制作用，并計(jì)算了相應(yīng)EC50值，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，與對(duì)照組相比，甲基硫菌靈質(zhì)量濃度為1 μg/mL時(shí)能顯著抑制杏樹(shù)流膠病病原菌菌絲生長(zhǎng)，其EC50為2.831 5 μg/mL；而靚果安和潰腐靈分別在質(zhì)量濃度達(dá)到86.7和20.83 μg/mL時(shí)，才能顯著抑制杏樹(shù)流膠病病原菌菌絲的生長(zhǎng)，且抑制率較低，二者的EC50非常高。這說(shuō)明甲基硫菌靈對(duì)葡萄座腔菌菌絲生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，但靚果安和潰腐靈的抑制效果較差，即該菌對(duì)靚果安和潰腐靈不敏感。

表1 杏樹(shù)流膠病病原菌對(duì)3種藥劑的敏感性Table 1 Susceptibility of apricot gummosis pathogen to three fungicides

3 討論與結(jié)論

流膠病是杏樹(shù)最主要的病害之一，可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究采集有流膠病癥的杏樹(shù)枝條，分離純化得到分離物的純培養(yǎng)，根據(jù)分離物的致病性，其菌落、菌絲和分生孢子的形態(tài),以及ITS序列分析結(jié)果，認(rèn)為引起陜西周至地區(qū)杏樹(shù)流膠病的病原菌為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)，其分類(lèi)地位為子囊菌門(mén)腔菌綱格孢腔菌目葡萄座腔菌科葡萄座腔菌屬。這與Li等[14]報(bào)道的浙江省杏樹(shù)流膠病病原菌一致。

葡萄座腔菌屬真菌分布廣泛、寄主多樣，是農(nóng)林業(yè)上重要的病原菌或內(nèi)生菌，尤其是葡萄座腔菌可在桃、杏、櫻桃、核桃、柳樹(shù)、橡樹(shù)、桉樹(shù)等45個(gè)屬的木本植物上引起潰瘍、枯梢、葉斑病、花果腐爛枯萎等病害，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[15-18]。目前對(duì)于葡萄座腔菌引起的植物病害主要依賴(lài)化學(xué)防治，即噴灑、涂抹或灌根各種殺菌劑，主要有氟硅唑、撲海因、多菌靈、三唑類(lèi)殺菌劑和有機(jī)氯類(lèi)殺菌劑等[19-28]。研究表明，甲基硫菌靈在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)葡萄腔座菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)都有很好的抑制效果，在田間試驗(yàn)中也有較好的防治效果，但其對(duì)不同菌株的敏感性有所差異[24-29]。另外，靚果安和潰腐靈也是市面常見(jiàn)的用于防治流膠病的藥劑，也曾被報(bào)道可用于防治葡萄座腔菌引起的果樹(shù)流膠病[5]。本研究通過(guò)測(cè)試這3種藥劑對(duì)陜西周至地區(qū)杏樹(shù)流膠病病原菌的抑制效果發(fā)現(xiàn)，甲基硫菌靈對(duì)該菌株有較好的抑制作用，因此針對(duì)陜西周至地區(qū)杏樹(shù)流膠病的防治可采用甲基硫菌靈噴霧或傷口涂抹等處理；靚果安和潰腐靈雖然在高質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)有一定抑制作用，但結(jié)合EC50值來(lái)看，其抑制效果不佳，但這2種藥劑的有效成分均為植物源生物堿，除了對(duì)病原菌生長(zhǎng)有直接影響外，此類(lèi)化合物還可促進(jìn)植物的生理生長(zhǎng)[30]，所以不排除靚果安和潰腐靈可以促進(jìn)杏樹(shù)長(zhǎng)勢(shì)，從而增強(qiáng)其對(duì)流膠病抵抗性的可能。在后續(xù)研究中，將進(jìn)行活體試驗(yàn)以驗(yàn)證這一推測(cè)。