霉菌毒素吸附劑與有機酸或植物精油的復合物對蛋雞飼糧養(yǎng)分表觀消化率及腸道微生物的影響

陳繼發(fā)

（宜春學院生命科學與資源環(huán)境學院，江西省高等學校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，江西宜春 336000）

腸道是家禽消化和吸收飼糧養(yǎng)分的主要場所，健康的腸道有利于提高養(yǎng)分利用率。腸道微生物能夠與宿主爭奪腸腔中的養(yǎng)分，過度繁殖的致病菌會消耗腸腔內(nèi)養(yǎng)分，降低飼料利用率[1]。調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善腸道健康是提高飼料利用率、實現(xiàn)家禽高效生產(chǎn)的重要課題。蒙脫石等霉菌毒素吸附劑（Mycotoxin Adsorbent，MA）能優(yōu)化家禽腸道菌群、提升腸道健康水平[2-3]。有機酸（Organic Acid，OA）和植物精油（Essential Oil，EO）具有抗菌、抑炎功能[4-5]，可提升家禽腸道健康水平、促進飼糧養(yǎng)分消化吸收[6-7]。飼糧被多種低濃度[含量未超過我國《飼料衛(wèi)生標準》（GB 13078—2017）]霉菌毒素污染和致病菌引發(fā)的腸道疾病是當前蛋雞生產(chǎn)中較普遍面臨的問題。前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞產(chǎn)蛋率、日產(chǎn)蛋重、平均日采食量和料蛋比均無顯著影響[8]。根據(jù)MA、OA 和EO 的功能，推測飼糧添加MA-OA 復合物和MA-EO 復合物也許能有效調(diào)節(jié)蛋雞腸道菌群結(jié)構(gòu)、改善腸道健康，促進飼糧養(yǎng)分消化吸收，提高養(yǎng)分利用率。因此，本試驗旨在研究含有多種低劑量霉菌毒素飼糧（黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A 和T-2 毒素含量未超標）[8]中添加MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞血漿生化指標、養(yǎng)分表觀消化率、腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體基因表達及腸道微生物的影響，為其在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 MA-OA 復合物主要成分：MA（蒙脫石）80%，OA（主要為甲酸、丙酸和丁酸）＞10%；MA-EO復合物主要成分：MA（蒙脫石）75%，EO（主要為丁香酚和肉桂醛）含量＞ 4%。MA-OA 復合物、MA-EO復合物主要是利用蒙脫石特殊的晶層結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，通過蒙脫石表面改性、電荷調(diào)控，與丁香酚、肉桂醛或甲酸、丙酸等組裝、表面交聯(lián)等工藝制備而成。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理 選用29 周齡健康的羅曼粉殼蛋雞270 只，隨機分為3 組，每組6 個重復，每個重復15 只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.65 g/kg MA-OA 復合物（MA-OA 復合物組）、0.70 g/kg MA-EO 復合物（MA-EO 復合物組）的試驗飼糧。預試期1 周，正試期10 周?；A(chǔ)飼糧參考《雞飼養(yǎng)標準》（NY/T33-2004）設(shè)計，其組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分（風干基礎(chǔ)）

試驗雞只采用3 層階梯式籠養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)3 只。試驗期雞舍內(nèi)平均溫度、相對濕度分別為（25.6±2.8）℃、（77.2±6.3）%。每日于08:00、15:00 喂料，自由飲水，人工光照與自然光照相結(jié)合，光照時間為16 h/d。

1.3 樣品采集 在試驗第67 天，每個重復隨機選取1 只蛋雞單籠飼養(yǎng)，采用內(nèi)源性指示劑法開展為期3 d 的代謝試驗，于雞籠底部放置干凈的集糞盤，參照文獻[9]的方法收集糞樣、制備風干糞樣和飼料樣，置于干燥器中保存。

試驗第70 天清晨，每個重復隨機選擇2 只蛋雞（空腹）進行采血。參照文獻[8]的方法采集血液樣品和制備血漿，并置于-20℃保存。此外，從每個重復隨機選取1 只未禁食的蛋雞，參照文獻[9-10]的方法采集十二指腸內(nèi)容物和空腸黏膜樣品（每份采集1～2 g），-80℃下凍存。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 血漿生化指標 血漿樣品于4℃解凍后，使用全自動生化分析儀（BS-200，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）測定血漿生化指標，測定方法參照邁瑞公司生產(chǎn)的試劑盒相應(yīng)說明書進行。

1.4.2 養(yǎng)分表觀消化率 參照文獻[11]的方法檢測糞便與飼糧干物質(zhì)、能量、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、粗灰分、鈣和磷的含量。糞便與飼糧中鹽酸不溶灰分含量按照《飼料中鹽酸不溶灰分的測定》（GB/T 23742—2009）的方法測定。計算公式：

某養(yǎng)分表觀消化率=100%－100%×（飼糧中鹽酸不溶灰分含量×糞便中某養(yǎng)分含量）/（飼糧中某養(yǎng)分含量×糞便中鹽酸不溶灰分含量）

1.4.3 空腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體基因表達 使用Trizol試劑（TaKaRa，日本）提取蛋雞空腸總RNA，經(jīng)檢測合格的RNA 樣品用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）制備cDNA，然后以其為模板使用RT-PCR 試劑盒（TaKaRa，日本）進行PCR 擴增，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照文獻[9]。引物由上海生工生物有限公司合成，B0系統(tǒng)中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體（B0AT）引物為F：TATCCTGGCTGGGTCTATGC；R：AGGCCTGTACGA TCCCTTCT。

小肽轉(zhuǎn)運載體1（PepT1）、鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運載1（SGLT1）、易化葡萄糖轉(zhuǎn)運載體2（GLUT2）和β-肌動蛋白引物序列參照文獻[9]，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA 表達量。

1.4.4 腸道微生物相對含量 每份腸道內(nèi)容物樣品稱取約0.2 g 置于2 mL EP 管中，用糞便基因組DNA 提取試劑盒（DP328，天根生化科技（北京）有限公司）提取細菌DNA，將所有合格DNA 樣品的濃度稀釋至100 ng/μL。使用RT-PCR 試劑盒（TaKaRa，日本）進行PCR 擴增，反應(yīng)體系、反應(yīng)程序和引物序列參照文獻[10]。以總菌為參比基因，采用2-ΔΔCt法計算目的細菌的相對含量[10]。

1.5 統(tǒng)計分析 利用SAS 9.2 軟件對試驗數(shù)據(jù)作單因素方差分析，差異顯著者用Duncan's 法進行多重比較。結(jié)果用平均值±標準差表示，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞血漿生化指標的影響 試驗結(jié)果顯示，MA-OA 復合物和MA-EO復合物對所測定的血漿生化指標均無顯著影響（表2）。

表2 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞血漿生化指標的影響

2.2 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞飼糧養(yǎng)分表觀消化率的影響 試驗結(jié)果顯示，各組間干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、鈣和磷表觀消化率均無顯著差異（表3）。與對照組、MA-EO 復合物組相比，MA-OA 復合物組能量表觀消化率分別提高了18.67%、12.47%（P＜0.05）。

表3 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞飼糧養(yǎng)分表觀消化率的影響 %

2.3 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞空腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體基因表達的影響 由表4 可知，各組間蛋雞空腸黏膜B0AT、PepT1、GLUT2mRNA 表達水平均無顯著差異。與對照組、MA-EO 復合物組相比，MA-OA復合物組空腸SGLT1mRNA 表達量提高（P＜0.05）。

表4 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞空腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體基因表達的影響

2.4 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞十二指腸微生物相對含量的影響 由表5 可知，MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞十二指腸內(nèi)容物雙歧桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門氏菌和腸球菌相對含量均無顯著影響。與對照組相比，MA-OA 復合物組、MA-EO 復合物組十二指腸大腸桿菌相對含量降低（P＜0.05）。MA-OA復合物組十二指腸乳酸桿菌相對含量高于對照組和MA-EO 復合物組（P＜0.05）。

表5 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞十二指腸微生物相對含量的影響

3 討 論

3.1 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞血漿生化指標的影響 谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶是反映動物肝臟健康水平的重要指標。研究表明，飼糧添加EO、OA能夠提升動物肝臟健康水平[12-13]，這與其能夠抑制腸道病原體、維護腸屏障功能有關(guān)，可降低致病菌和毒素“移位”，進而減少肝臟損傷[6-7]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，在霉菌毒素含量超標飼糧中添加MA 能夠改善蛋雞肝臟健康[14]。本試驗結(jié)果表明，添加MA-OA 復合物、MA-EO 復合物對蛋雞血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均無顯著影響，與上述研究的試驗結(jié)果不一致，可能與添加劑的使用量和飼糧霉菌毒素含量存在差異有關(guān)。另外，本試驗中，添加MA-OA 復合物、MA-EO 復合物對蛋雞血漿中反映機體養(yǎng)分代謝的指標均無顯著影響，提示二者可能不影響蛋雞機體蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類代謝。而有研究指出，飼糧添加MA、OA 或EO 能夠改善蛋雞血液中部分養(yǎng)分代謝指標[15-17]，可能因蛋雞生產(chǎn)階段、飼糧組成、添加劑成分和使用劑量、試驗周期等不同造成試驗結(jié)果存在差異。

3.2 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞飼糧養(yǎng)分表觀消化率的影響 本試驗發(fā)現(xiàn)，添加MA-OA 復合物顯著提高了飼糧能量表觀消化率，一定程度上提高了干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的表觀消化率。研究認為，添加一定水平的蒙脫石不會影響肉雞對飼糧養(yǎng)分的消化率[18]；添加0.5 g/kg 蒙脫石對蛋雞飼糧養(yǎng)分表觀消化率無顯著影響[9]。劉艷利等[19]報道，蛋雞飼糧添加OA（主要為丁酸甘油酯）一定程度上提高了飼糧能量和粗蛋白質(zhì)的真消化率，顯著提高了鈣和磷的表觀消化率；另外，添加復合OA 顯著提高了肉雞飼糧粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的表觀消化率[17]。綜上，MA-OA 復合物改善蛋雞飼糧養(yǎng)分表觀消化率的作用與含有OA 有關(guān)，其能夠降低腸道pH、抑制腸道有害菌、改善腸黏膜形態(tài)以及提高腸道消化酶活性[6,17,19]，進而有利于促進動物對飼糧養(yǎng)分的消化、吸收。

3.3 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞空腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體基因表達的影響 小腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體的正常表達對于飼糧養(yǎng)分吸收非常重要。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧添加MA-OA 復合物顯著上調(diào)了蛋雞空腸黏膜SGLT1mRNA 表達水平，一定程度上提高了GLUT2和PepTlmRNA 表達量，提示MA-OA 復合物可能增強了腸道對葡萄糖和小肽的吸收能力，有利于提高飼糧養(yǎng)分利用率。研究表明，飼糧添加蒙脫石顯著上調(diào)了蛋雞空腸黏膜堿性氨基酸轉(zhuǎn)運載體1 mRNA 表達水平[9]；梁賽賽[20]報道，添加OA 在一定程度上提高了蛋雞小腸黏膜SGLT1、GLUT2、B0AT和y+L 氨基酸轉(zhuǎn)運載體2 mRNA 表達量。以上研究表明，添加蒙脫石和OA 有利于促進蛋雞腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體的表達。本試驗結(jié)果也表明，MA-OA 復合物組能量和粗蛋白質(zhì)的表觀消化率較對照組均有提高，且血漿總蛋白、白蛋白和葡萄糖含量也有一定增加。可見，養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體mRNA 的表達水平與相應(yīng)養(yǎng)分表觀消化率和血漿相關(guān)指標的結(jié)果基本可以相互佐證。腸道刷狀緣膜和基底膜中養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體的表達受腸腔內(nèi)養(yǎng)分調(diào)節(jié)，某養(yǎng)分含量提高，相應(yīng)轉(zhuǎn)運載體的活性將隨之提高[21]，提示MA-OA 復合物也許是通過促進蛋雞對飼糧養(yǎng)分的消化使腸腔內(nèi)小分子養(yǎng)分的含量增加，進而提高相關(guān)轉(zhuǎn)運載體的表達。

3.4 MA-OA 復合物和MA-EO 復合物對蛋雞十二指腸微生物相對含量的影響 研究表明，飼糧添加蒙脫石、OA或EO 能夠降低家禽腸道有害菌數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡[6,10,19]。據(jù)報道，蒙脫石對有害菌有吸附作用，能固定細菌隨動物腸道蠕動而排出體外[22]。OA 可降低動物腸道pH，利于有益菌生長繁殖，抑制有害菌增殖[7,17,19]。EO能夠直接殺滅有害菌[4]。綜上表明，蒙脫石和OA、蒙脫石和EO 聯(lián)用能夠有效控制腸道有害菌，優(yōu)化腸道菌群。Lillehoj 等[23]研究表明，MA-OA 復合物對產(chǎn)氣莢膜梭菌和艾美球蟲誘導的肉雞壞死型腸炎具有明顯緩解作用。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧添加MA-OA 復合物和MA-EO 復合物均不同程度降低了蛋雞十二指腸產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌和沙門氏菌相對含量。此外，添加MA-OA 復合物還提高了有益菌（如乳酸桿菌）相對含量，這與OA 具有降低腸道pH 的作用有關(guān)；同時腸道有害菌減少，間接對有益菌的生長繁殖帶來益處。腸道微生物會與宿主爭奪腸腔內(nèi)養(yǎng)分，當腸道有害菌減少，有害菌同機體爭奪養(yǎng)分的競爭力降低[1]，進而有利于提高飼糧養(yǎng)分利用率。本試驗中，蛋雞腸道有害菌含量降低和乳酸桿菌含量提高可能是MA-OA 復合物提高飼糧能量表觀消化率的主要原因之一。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，飼糧添加0.65 g/kg MA-OA 復合物、0.70 g/kg MA-EO 復合物可以調(diào)節(jié)蛋雞腸道菌群結(jié)構(gòu)；添加MA-OA 復合物能夠提高蛋雞飼糧能量表觀消化率。