基于網(wǎng)絡藥理學研究五苓散治療慢性腎衰竭的潛在機制

熊致立 周珊珊 巴元明

摘要 目的：基于網(wǎng)絡藥理學方法，研究五苓散治療慢性腎衰竭的機制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）檢索五苓散活性成分，使用有機小分子生物活性（PubChem）數(shù)據(jù)庫、瑞士生物信息學研究所（SIB）數(shù)據(jù)庫進行靶點排查。根據(jù)GeneCards數(shù)據(jù)庫得到疾病相關(guān)靶點。并利用Omicshare平臺將藥物及疾病靶點進行匹配。采用String Version 10.5數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡。利用Omicshare軟件對關(guān)鍵靶點進行基因本體（GO）富集分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。采用CytoscapeVersion3.8.0對藥物-成分-靶點-信號通路進行分析。結(jié)果：篩選得到五苓散活性成分532個，治療靶點112個，五苓散治療疾病的主要活性成分包括啤酒甾醇（Cerevisterol），β谷甾醇（β-sitosterol），澤瀉醇（Alisol B）等;治療疾病的核心靶點包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等;主要涉及的信號通路包括Toll-like Receptor（TLR）、T Cell Receptor（TCR）等，生物過程主要包括細胞凋亡過程、磷酸鹽代謝過程等。結(jié)論：本研究以網(wǎng)絡藥理學方式探究了五苓散治療慢性腎衰竭的多途徑-多靶點的作用機制，推斷五苓散主要通過調(diào)節(jié)TLR/NF-κB、T Cell Receptor等信號通路，抑制TNF-α、IL-6等相關(guān)炎癥介質(zhì)活性從而延緩慢性腎衰竭。為進一步的實驗提供理論參考。

關(guān)鍵詞 五苓散;網(wǎng)絡藥理學;慢性腎衰竭;靶點;作用機制

Abstract Objective：To explore the mechanism of Wuling powder in the treatment of chronic renal failure based on the network pharmacology.Methods：The main active ingredients of Wuling powder were obtained through TCMSP.SwissTargetPrediction and PubChem database were used to predict and filter the relevant action targets，and then a database of potential targets was built.Next GenCards database was used to screen reported therapeutic targets for chronic renal failure.Active components and disease targets were matched based on the Omicshare.Target protein-protein interaction（PPI） network was constructed by String Version 10.5 database.Omicshare software was used for gene ontology（GO） enrichment analysis and the Kyoto Encyclopedia of genes and genomes（KEGG） pathway enrichment analysis of the key targets.Cytoscape Version 3.8.0 software was used for visualized analysis of drugs-active ingredient-key target network and the ingredient-target-signal pathway network.Results：Totally 532 active ingredients of Wuling powder and 112 targets of anti-chronic renal failure effect were screened out.The main components of Wuling powder used to treat chronic renal failure include Cerevisterol，β-sitosterol and alisol B.Core targets including TNF-α and IL-6，and receptor signaling pathways are mainly Toll-like receptor，T cell receptor signaling pathway，etc.Biological process（BP） includes regulation of programmed cell death，phosphorylation and positive regulation of cell proliferation.Conclusion：This study explored the mechanism of Wuling powder in the treatment of chronic renal failure based on the method of network pharmacology.The mechanisms of its anti-chronic renal failure effects may be related to inhibiting TNF-α、IL-6 by regulating TLR/NF-κB、T cell receptor signaling pathway.It provides theoretical reference for further experiments.

Keywords Wuling powder; Network pharmacology; Chronic renal failure; Target; Mechanism of function

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.008

慢性腎衰竭（Chronic Renal Failure，CRF）為多種臨床腎臟病持續(xù)進展的最終結(jié)果，是以水、電解質(zhì)紊亂，酸堿代謝失衡及多系統(tǒng)癥狀為主要表現(xiàn)的一種臨床綜合征[1]。21世紀以來，CRF流行病學研究已成為全球腎臟病研究熱點，據(jù)調(diào)查研究，中國東部沿海地區(qū)CRF患病率為11%～13%，而知曉率不足10%[2]。在此基礎上，針對終末期腎衰竭的替代治療（透析、腎移植）則會因其高昂的治療費用造成社會負擔和經(jīng)濟壓力。

中醫(yī)藥憑借其獨特的辨證論治體系在治療CRF方面具有良好的效果[3]。慢性腎衰竭在中醫(yī)學中歸屬于“關(guān)格”“隆閉”“水腫”等范疇，其基本病機為脾腎衰憊，氣化不利，濕濁毒邪氣內(nèi)蘊三焦。病理性質(zhì)多屬本虛標實，治宜溫補脾腎，祛濕化濁[4]。五苓散來源于東漢張仲景所著《傷寒雜病論》，用于治療太陽表邪未解，內(nèi)傳太陽之腑，遂成太陽表里同病之蓄水證。原方澤瀉為君、臣以豬苓、茯苓，并佐以白術(shù)、桂枝共同構(gòu)成。澤瀉善于治療水腫、小便不利，下焦?jié)駸嵴哂纫?，《本草新編》有云：“入太陽、少陽足?jīng)，能入腎，長于利水，去陰汗，利小便如神，除濕去渴之仙丹也?！狈街袧蔀a用量獨重，故為君藥;豬苓、茯苓甘補淡滲，長于利水，而無明顯寒熱之偏性，可應對虛實寒熱等多種類型之水腫，二苓合用共為臣藥;白術(shù)性苦、甘、溫，功能燥濕利水，健脾益氣，長于治療脾虛水停而致的水腫、小便不利;外加桂枝甘溫，助陽化氣行水，溫通經(jīng)脈;諸藥合用則可利水滲濕，化氣解表，故蓄水留飲諸癥自除[5]。有研究表明，五苓散具有保護腎臟、改善腎功能的作用[6]。但五苓散治療CRF的作用機制有待進一步研究。

網(wǎng)絡藥理學是以系統(tǒng)生物學理論和多向藥理學為基礎的新興學科，具有系統(tǒng)性和整體性的特點，能夠以可視化角度清晰、直觀地表達藥物成分與疾病靶基因的聯(lián)系，尤其與中藥復方多成分-多靶點-多途徑的特點有良好的適應性。本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法，通過構(gòu)建“藥物-成分-靶點-信號通路”來研究五苓散治療CRF的作用機制。

1 資料與方法

1.1 五苓散活性成分的收集與篩選 分別以“豬苓”“茯苓”“澤瀉”“白術(shù)”“桂枝”為關(guān)鍵詞，采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）進行檢索，獲得相應活性成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件進行篩選，從而構(gòu)建五苓散藥物靶點集合。

1.2 藥物與疾病靶點的預測與初步排查

1.2.1 根據(jù)PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到已篩選出的藥物靶點SMILE式，并將活性成分對應的SMILE式輸入SIB數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），條件限定為Homosapiens，得到其作用靶點，去除重復項后，構(gòu)建五苓散潛在靶點集合。

1.2.2 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）以“Chronic Renal Failure”為關(guān)鍵詞查找分析相關(guān)疾病基因，經(jīng)整合處理，得到CRF疾病相關(guān)靶點。利用Omicshare（www.omicshare.com）將活性成分潛在靶點與CRF疾病靶點進行匹配，得到活性成分-CRF共同作用靶點作為治療靶點，繪制韋恩圖。

1.3 “五苓散-CRF”蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構(gòu)建 將匹配得到的五苓散-CRF治療靶點導入STRING（https：//string-db.org/），以Homosapiens（智人）為標準確定物種條件，獲得PPI關(guān)系，利用Cytoscape Version3.8.0進行可視化處理，并對相關(guān)靶點進行網(wǎng)絡拓撲分析，據(jù)分析得出Averrage Node Degree值為26.2。將Degree值大于26.2作為篩選條件，得到核心靶點。

1.4 基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫（http：//www.david.niaid.nih.gov）對核心靶點分別進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析選擇3個部分，分別是細胞組分（CC），分子功能（MF），生物過程（BP）。利用Omicshare（www.omicshare.com）工具對KEGG信號通路富集分析和GO富集分析繪制氣泡圖。

1.5 構(gòu)建“藥物-成分-靶點-信號通路”結(jié)構(gòu)圖 參照KEGG富集通路信息，設定P-value<0.05，Count值呈降序排列，篩選靠前的15條通路進行整合，將核心靶點與信號通路上富集的靶點相互匹配，取其交集得到富集靶點。最后導入CytoscapeVersion3.8.0繪制藥物-成分-靶點-信號通路結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果

2.1 五苓散藥物靶點的篩選 本研究以TCMSP平臺共收集活性成分386個，其中豬苓31個，茯苓34個，澤瀉46個，白術(shù)55個，桂枝220個。將OB≥30%、DL≥0.18作為篩選條件，同時剔除未找到靶點的活性成分，共獲得活性成分30種，其中豬苓、茯苓共有的活性成分為Cerevisterol、Ergosta-7，22E-dien-3beta-ol，豬苓、桂枝共有的活性成分為Peroxyergosterol，澤瀉、桂枝共有的活性成分為Sitosterol。見表1。

2.2 五苓散活性成分靶點基因及疾病基因預測 利用PubChem數(shù)據(jù)庫得到活性成分對應的SMILE式，并將其輸入SIB數(shù)據(jù)庫，物種條件設定為人，經(jīng)篩選整合后得到532個活性成分靶點;以“Chronic Renal Failure”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫中進行檢索，慢性腎衰竭相關(guān)靶點基因共7 820個，根據(jù)Relevance Score值呈降序排列，選取前981個作為疾病靶點。將981個疾病靶點與532個活性成分靶點取交集，共得到112個共同靶點作為治療靶點。見圖1。

2.3 “五苓散-CRF”PPI網(wǎng)絡的形成與探究 通過STRING數(shù)據(jù)庫，將112個治療靶點導入后得到獲得PPI網(wǎng)絡，將其導入Cytoscape Version3.8.0進行可視化處理。得到112個節(jié)點（靶點）和1 466條邊（靶點之間的相互作用），節(jié)點的Degree值與其顏色、大小成正比。取Degree大于Average Node Degree值即26.2的44個靶點作為核心靶點。得到白細胞介素6（IL6）、血清清蛋白（ALB）、表皮生長因子受體（EGFR）、腫瘤壞死因子（TNF）等靶點，此類靶點與CRF的進展有較高的相關(guān)性，可能對于治療疾病具有重要意義。見圖2。

2.4 GO富集分析和KEGG富集分析 GO富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫對44個核心靶點進行富集分析，取P<0.05，并以Count值降序排列篩選出前15位GO條目。GO富集分析分別從生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）3個方面進行分析。其中關(guān)聯(lián)生物過程主要包括細胞凋亡過程、磷酸鹽代謝過程及細胞增殖的正向調(diào)控;細胞組分主要涉及質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠、細胞器內(nèi)腔;分子功能中主要涉及ATP結(jié)合、腺苷核糖核苷酸結(jié)合、嘌呤核苷結(jié)合等。

KEGG富集分析KEGG通路富集的靶點主要與Toll樣受體信號通路、MAPK信號通路及T細胞樣受體信號通路。見圖3。

2.5 構(gòu)建五苓散治療CRF“藥物-成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡圖 篩選KEGG信號通路富集排名前15的信號通路，并收集其對應的靶點與核心靶點取交集，得到富集靶點31個。見表2。整合繪制為最終的“藥物-成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡圖。其中涉及的靶點主要包括白細胞介素6（IL6）、腫瘤壞死因子（TNF）、表皮生長因子受體（EGFR）等。圖中菱形代表藥物，橢圓代表活性成分，矩形代表靶點，四邊形代表信號通路。見圖4。

3 討論

五苓散收錄于《中華人民共和國藥典》2010版，列入《中國國家基本藥物名錄》。在我國，五苓散用于治療腎炎、尿道損傷引起的排尿困難和水腫已有數(shù)百年的歷史。有研究表明，五苓散對于高尿酸血癥、糖尿病腎病、肝硬化腹水具有良好的療效[7-9]，但其在治療慢性腎衰竭中的作用尚未完全揭示。

慢性腎衰竭病理上常表現(xiàn)為腎小球硬化伴隨大量細胞外基質(zhì)的積累，腎小球周圍區(qū)域和腎間質(zhì)均顯示纖維。多種原發(fā)性腎臟疾病均可引起CRF。大量證據(jù)表明，炎癥在腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[10]。首先，炎癥對腎臟損傷提供了最初的保護性反應，其試圖消除病因并促進恢復，但未解決的炎癥會促進炎癥-纖維化反應（Inflammation Fibrosis）。具體表現(xiàn)為炎癥激活免疫系統(tǒng)細胞及固有腎臟細胞從而產(chǎn)生的炎癥細胞浸潤及炎癥介質(zhì)釋放，最終導致成纖維細胞的活化及細胞外基質(zhì)的沉積，促成腎臟的纖維化。在這一過程中，巨噬細胞具有重要作用，其與α-平滑肌肌動蛋白共生，能夠引起炎癥反應和增加腎小球基質(zhì)沉積，具體包括了巨噬細胞基于IFN-γ、脂多糖的M1廣泛促炎經(jīng)典激活，以及基于免疫復合物誘導的促進纖維化和傷口愈合的M2交替激活[11]。對于原發(fā)病解除，腎臟損傷消退的研究，如急性缺血-再灌注的損傷，已證明巨噬細胞具有保護和恢復作用。因此，找出控制炎癥反應相關(guān)的治療靶點將有助于開發(fā)有效的方法來預防和阻止腎衰竭的進展。

本研究在藥物-成分-靶點-信號通路中得到五苓散關(guān)鍵活性成分為啤酒甾醇（Cerevisterol），β谷甾醇（β-sitosterol），澤瀉醇（Alisol B）等。研究表明，啤酒甾醇（Cerevisterol）可降低促炎癥介質(zhì)（例如TNF-α，IL-6和IL-1β）的表達[12]。此外，啤酒甾醇通過阻斷抑制性蛋白κBα的磷酸化并抑核因子κB（NF-κB）的轉(zhuǎn)錄;β-谷甾醇均為甾醇類提取物，有研究表明，在β-谷甾醇是否對動脈瘤的生長具有抑制作用的實驗中，與對照組大鼠比較，用β-谷固醇治療的大鼠動脈瘤大小明顯減少[13]。此外，β-谷甾醇的給藥降低了趨化因子和包括TNF-α、IL-6在內(nèi)的炎癥介質(zhì)的表達，β-谷甾醇給藥的大鼠中炎癥介質(zhì)的水平顯著降低，炎癥部位募集的細胞數(shù)量減少;澤瀉醇（Alisol B）23-acetate（AB23A）是一種三萜類化合物，是從澤瀉根莖中提取，具有抗炎活性。實驗證明，在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激的小鼠模型中，澤瀉醇提高了存活率并改善了心肌損傷，減少了炎癥細胞浸潤以及IL-6，IL-1β和TNF-α的水平[14]。此外，澤瀉醇在體內(nèi)和體外均抑制TLR4和NOX2的水平以及P38和ERK的激活水平;而根據(jù)PPI網(wǎng)絡分析，治療慢性腎衰的關(guān)鍵靶點包括TNF、IL6、MAPK等，這與五苓散主要活性成分功能相符合。其中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是巨噬細胞/單核細胞在炎癥過程中產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)，負責細胞內(nèi)各種信號轉(zhuǎn)導事件，導致壞死或凋亡。該蛋白質(zhì)對于炎癥-纖維化反應也很重要。在臨床和實驗中，巨噬細胞采用M1經(jīng)典激活產(chǎn)生廣泛促炎時，激活包括TNF-α在內(nèi)的多種炎癥介質(zhì)，從而誘導更多白細胞群體的募集[15]。但當系統(tǒng)阻斷TNF-α及其衍生因子時，腎臟損傷明顯改善。此外，TNF-α在固有腎細胞的損傷如足細胞、腎小管上皮細胞，以及血漿補體蛋白的泄露導致的補體系統(tǒng)激活過程中有明顯的表達。這既證明了TNF-α作為炎癥和纖維化間關(guān)鍵環(huán)節(jié)的重要性，同時說明中藥治療慢性腎衰竭具有多靶點、多途徑的特點和優(yōu)勢;白細胞介素6（IL6）是通過對感染和組織損傷的響應而迅速產(chǎn)生的，它通過激活急性期反應、造血作用和免疫反應來促進宿主防御。盡管它的表達受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機制的嚴格控制，但是失調(diào)的IL6持續(xù)合成在慢性炎癥和腎纖維化中起著病理作用，并廣泛表達炎癥反應與纖維化的全過程[16]。

根據(jù)KEGG富集通路篩選，五苓散調(diào)控的主要通路包括Toll樣受體（Toll-like Receptor，TLR）、T細胞受體（T Cell Receptor，TCR）等。其中Toll樣受體屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體，其廣泛表達于小管上皮細胞、系膜細胞等腎臟固有細胞，是關(guān)聯(lián)炎癥與腎臟纖維化的重要因素，且為KEGG富集的關(guān)鍵通路。其能夠通過NF-κB途徑激活炎癥介質(zhì)使其大量釋放而加速纖維化進程[17]。有研究表明，TLR4缺陷小鼠的TGF-β及纖連蛋白的表達明顯減少，故阻斷TLR4，抑制TLR/NF-κB信號通路，有利于抑制TNF-α、IL6、IFN-γ等炎癥介質(zhì)的活性，從而緩解腎臟纖維化的進程[18];T淋巴細胞來源于多能干細胞，能夠響應TCR和常見的γ鏈細胞因子受體信號轉(zhuǎn)導而誘導巨噬細胞吞噬，且TCR為KEGG所富集的關(guān)鍵通路，T細胞在腎組織內(nèi)激活可產(chǎn)生趨化因子和免疫因子，誘導單核細胞募集并放大炎癥作用，尤其在抗體產(chǎn)生及抗體依賴性腎小球損傷中的作用更為明顯。有研究表明，在單側(cè)輸尿管梗阻實驗（UUO）中明確了T細胞在促進間質(zhì)纖維化的作用。而抑制T Cell Receptor通路對于抗腎臟纖維化、保護腎功能具有重要作用[19]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學的手段挖掘、闡述了五苓散的活性成分、組方規(guī)律以及對于慢性腎衰竭治療的多成分-多靶點-多途徑的機制，初步推斷五苓散可能通過調(diào)節(jié)TLR/NF-κB、T cell receptor等信號通路，抑制TNF-α、IL6等相關(guān)炎癥介質(zhì)活性從而延緩慢性腎衰竭[20]?？蔀橹筮M行的臨床試驗提供參考。然而慢性腎衰竭及腎臟纖維化的機制復雜，涉及的大量的信號通路及靶點，因此本研究所得到的結(jié)果仍應廣泛付諸實驗研究以期為臨床治療慢性腎衰竭提供更為明確的理論參考[21]。

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（2021-01-04收稿 責任編輯：魏慶雙）