基于粉末和顯微特征顏色數(shù)字化的生地黃與熟地黃判別

甄 臻，李慧芬，劉 靜，王 楊，孔慶悅，張學(xué)蘭, 2*

·藥劑與工藝·

基于粉末和顯微特征顏色數(shù)字化的生地黃與熟地黃判別

甄 臻1，李慧芬1，劉 靜1，王 楊1，孔慶悅1，張學(xué)蘭1, 2*

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355 2. 山東省高校中藥質(zhì)量控制與全產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250355

采用色差法和顯微成像技術(shù)獲取生地黃與熟地黃粉末和顯微特征顏色信息，通過統(tǒng)計(jì)分析探究基于色度學(xué)原理對(duì)生地黃與熟地黃進(jìn)行快速鑒別的可行性。利用色差儀測(cè)定地黃生、熟品粉末顏色，使用顯微鏡攝取生地黃與熟地黃木栓細(xì)胞、導(dǎo)管的顯微特征圖像，使用“顯微特征顏色提取”軟件測(cè)定顯微特征顏色，以生地黃與熟地黃粉末和顯微特征顏色值（*、*、*）及總色值（*ab）為基礎(chǔ)，利用Kruska-Wallis秩和檢驗(yàn)、聚類分析和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）研究生地黃與熟地黃的差異，利用Fisher判別分析建立二者粉末與顯微特征顏色的非標(biāo)準(zhǔn)化典則判別函數(shù)。*為生地黃與熟地黃主要差異性顏色值，木栓細(xì)胞為生地黃與熟地黃主要差異性顯微特征。生地黃與熟地黃粉末顏色的非標(biāo)準(zhǔn)化典則判別函數(shù)為＝0.629*＋0.379*－2.754*＋1.494*ab－40.662，顯微特征顏色的非標(biāo)準(zhǔn)化典則判別函數(shù)為＝0.497*－0.659*＋0.267*ab－5.428；上述2個(gè)函數(shù)判別規(guī)則為＞0判為生地黃，＜0判為熟地黃。利用色差法和顯微成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了生地黃與熟地黃粉末和顯微特征顏色的數(shù)字化表達(dá)，F(xiàn)isher判別分析利用飲片粉末和顯微特征顏色信息可有效判別生地黃與熟地黃，為中藥生、制飲片的判別提供了一種新方法，為中藥飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了借鑒。

生地黃；熟地黃；粉末顏色；顯微特征顏色；數(shù)字化；色差法；顯微成像技術(shù)；Kruska-Wallis秩和檢驗(yàn)；聚類分析；正交偏最小二乘-判別分析；Fisher判別分析

地黃為玄參科植物地黃Libosch.的新鮮或干燥塊根，生地黃（RR）炮制成熟地黃（RRP）后藥性由寒性轉(zhuǎn)變?yōu)闇匦?，作用由清轉(zhuǎn)化為補(bǔ)，味由苦轉(zhuǎn)甜。生地黃具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的作用，熟地黃則具有滋陰補(bǔ)血、益精填髓的作用[1]。《中國(guó)藥典》2020年版一部收載了生地黃與熟地黃飲片，規(guī)定了生地黃的顯微鑒別內(nèi)容，對(duì)其粉末顏色及顯微特征顏色僅進(jìn)行了主觀描述，無(wú)客觀的顏色量化評(píng)價(jià)指標(biāo)，熟地黃則無(wú)顯微鑒別內(nèi)容，不能體現(xiàn)炮制對(duì)其顯微特征的影響。徐曼菲等[2]提出“辨色論質(zhì)”的思想，認(rèn)為顏色作為最直觀的指標(biāo)與藥材內(nèi)在質(zhì)量具有直接關(guān)系，但是，傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)鑒別法對(duì)于中藥飲片顏色的評(píng)價(jià)依賴于主觀判斷，存在主觀性強(qiáng)、個(gè)體差異大的缺點(diǎn)?，F(xiàn)在，已有研究利用色差儀實(shí)現(xiàn)了一些中藥飲片外觀和粉末顏色的客觀化評(píng)價(jià)，如大黃、黨參、穿心蓮[3-5]。有學(xué)者還將顏色與成分含量、生物活性等質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性研究，結(jié)果表明，飲片顏色與成分含量、生物活性密切相關(guān)[6-9]，同時(shí)也證明了顏色作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)之一的科學(xué)性。

顯微鑒定技術(shù)利用光學(xué)系統(tǒng)或電子光學(xué)系統(tǒng)設(shè)備，觀察肉眼所不能分辨的微小物體形態(tài)結(jié)構(gòu)及其特征[10]，具有快捷、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的特點(diǎn)[11]。目前，該技術(shù)在中藥飲片質(zhì)量研究中已廣泛應(yīng)用，主要用于中藥材（飲片）的定性鑒別[12-15]，及通過顯微特征定量、顯微組織測(cè)定實(shí)現(xiàn)顯微特征數(shù)量的定量分析[16-19]。目前研究已建立了生地黃與熟地黃的含量測(cè)定方法、HPLC指紋圖譜、炮制工藝[20-23]，但未見生地黃與熟地黃粉末與顯微特征顏色數(shù)字化評(píng)價(jià)相關(guān)研究報(bào)道。本研究采用色差法和顯微成像技術(shù)量化生地黃與熟地黃飲片粉末和顯微特征的顏色，并通過多種數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法分析生地黃與熟地黃粉末、顯微特征顏色的差異性，建立生地黃與熟地黃飲片的判別函數(shù)，為進(jìn)一步完善生地黃與熟地黃飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

WF30精密色差儀，深圳市威福光電科技有限公司；Olympus BX 53顯微鏡，廣州市明美光電技術(shù)有限公司，配套成像軟件，Mshot Image Analysis System；New Classic MF型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；101-1ES電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；粘附載玻片，1.0～1.2 mm，25 mm×75 mm，Wuhan Goodbio Technology Co.，Ltd.；SAIL BRAND蓋玻片，0.13～0.17 mm，22 mm×22 mm，天津市奧淇洛譜商貿(mào)有限公司。

1.2 藥品與試劑

水合氯醛（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%，批號(hào)J09S10H97118）、甘油（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，批號(hào)Z20A10Y95672），上海源葉生物科技有限公司。

水合氯醛試液的配制[1]：取水合氯醛50 g，加水15 mL與甘油10 mL使溶解，即得。

1.3 生地黃與熟地黃飲片樣品收集信息

共收集生地黃、熟地黃飲片各10批樣品，具體樣品信息見表1、2，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為玄參科植物地黃Libosch.的干燥塊根的炮制加工品。所有樣品均粉碎過4號(hào)篩，備用。

表1 10批生地黃飲片樣品信息

表2 10批熟地黃飲片樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 生地黃與熟地黃飲片外觀顏色比較

取生地黃與熟地黃飲片各10批，室內(nèi)自然光下觀察其外觀顏色，結(jié)果10批生地黃飲片外表皮棕黑色或棕灰色，切面棕黃色至黑色或?yàn)鹾谏?0批熟地黃飲片外表皮和斷面均呈烏黑色，生地黃與熟地黃飲片的外觀顏色均符合《中國(guó)藥典》2020年版要求。飲片性狀見圖1。

2.2 生地黃與熟地黃飲片粉末和顯微特征顏色比較

《中國(guó)藥典》2020年版一部地黃飲片“鑒別”項(xiàng)下規(guī)定，生地黃粉末深棕色，其顯微特征包括木栓細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、分泌細(xì)胞、導(dǎo)管[1]。

取生地黃與熟地黃飲片粉末各10批，按照《中國(guó)藥典》2020年版四部2001顯微鑒別法（粉末制片法）制備生地黃、熟地黃粉末制片[1]，置于顯微鏡下觀察。結(jié)果10批生地黃飲片粉末均呈深棕色，10批熟地黃粉末均呈棕褐色或棕黑色；10批生地黃與熟地黃飲片均檢出木栓細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、分泌細(xì)胞、導(dǎo)管。與生地黃飲片比較，熟地黃飲片粉末和顯微特征的顏色均呈不同程度加深。顯微特征見圖2。

圖1 生地黃(A)與熟地黃(B)飲片實(shí)物圖

2.3 生地黃與熟地黃飲片粉末顏色測(cè)定

2.3.1 色差法原理 色差法是利用CIE***均勻色空間及色差公式進(jìn)行顏色測(cè)定，為國(guó)際通用的測(cè)色標(biāo)準(zhǔn)。該法采用*、*、*3個(gè)指標(biāo)表征被測(cè)物質(zhì)的顏色：*為亮度值，值越大亮度越高；*為紅-綠色軸，+*表示紅色，?*表示綠色，值越大顏色偏紅，反之偏綠；*為黃-藍(lán)色軸，+*表示黃色，?*表示藍(lán)色，值越大顏色偏黃，反之偏藍(lán)[24]；*ab為總色值，表示待測(cè)物質(zhì)的總體顏色情況，計(jì)算公式為*ab=[*2＋*2＋*2]1/2[25]。

2.3.2 測(cè)定條件 可選光源：D65；色系：LAB；口徑8 mm；照明8/d；含光：SCI。

1.1 一般資料 2018年1月至 2018年6月，在海軍軍醫(yī)大學(xué)（第二軍醫(yī)大學(xué)）東方肝膽外科醫(yī)院泌尿外科行后腹腔鏡下腎部分切除術(shù)治療的腎臟腹側(cè)腎腫瘤患者 15例，術(shù)中應(yīng)用自制簡(jiǎn)易腹膜反折懸吊裝置。其中男 9例、女 6例，平均年齡為（62.5±9.2）歲，腫瘤平均最大徑為（2.9±1.0）cm，腫瘤位于右腎 7例、左腎 8例，均為位于腎臟腹側(cè)的單發(fā)腫瘤，腫瘤分期均為 T1N0M0 期，R.E.N.A.L 評(píng)分為 6～10 分。無(wú)淋巴結(jié)、腎靜脈或下腔靜脈癌栓及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取生地黃飲片粉末（過4號(hào)篩），均勻平鋪于測(cè)試盒中，連續(xù)測(cè)定6次，記錄*、*、*值，結(jié)果RSD分別為0.08%、0.35%、0.95%，均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 樣品飲片粉末顏色測(cè)定 生地黃與熟地黃飲片粉末（過4號(hào)篩），利用精密色差儀進(jìn)行顏色測(cè)定，記錄樣品的*、*、*值，并計(jì)算*ab值，每份樣品粉末平均測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果見表3。

2.4 生地黃與熟地黃飲片顯微特征顏色測(cè)定

2.4.1 粉末裝片制備 精密稱取生地黃與熟地黃飲片樣品粉末（過4號(hào)篩）1.00 mg置于載玻片上，滴加水合氯醛試液60 μL，蓋上蓋玻片，置于烘箱內(nèi)90 ℃加熱10 min。

2.4.2 顯微特征攝取條件 對(duì)Mshot Image Analysis System成像軟件的分辨率、曝光控制、顏色控制、圖像調(diào)整、熒光控制模塊進(jìn)行設(shè)置，具體參數(shù)見表4。調(diào)整顯微鏡光圈數(shù)值3，設(shè)置光圈大小3，光源強(qiáng)度3，放大倍數(shù)200倍（目鏡×10，物鏡×20），木栓細(xì)胞、導(dǎo)管2種顯微特征各攝取3張不同的顯微圖像。

圖2 生地黃(A) 與熟地黃(B) 飲片顯微特征圖(×200)

表3 生地黃與熟地黃飲片粉末顏色測(cè)定結(jié)果(n = 3)

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取同一批生地黃粉末（過4號(hào)篩），約1 mg，精密稱定，按“2.4.1”項(xiàng)下粉末裝片制備方法制備粉末裝片1份，置顯微鏡下觀察并攝取木栓細(xì)胞顯微圖像，采用“顯微特征顏色提取”軟件對(duì)同一木栓細(xì)胞連續(xù)測(cè)定6次，記錄木栓細(xì)胞的*、*、*值，結(jié)果*、*、*值的RSD分別為0.04%、0.01%、0.02%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批生地黃粉末（過4號(hào)篩），約1 mg，精密稱定，按“2.4.1”項(xiàng)下粉末裝片制備方法制備粉末裝片1份，在室溫（25 ℃）條件下自然放置24 h，分別于0、2、4、8、12、24 h置顯微鏡下觀察并攝取同一木栓細(xì)胞顯微圖像，采用“顯微特征顏色提取”軟件測(cè)定并記錄木栓細(xì)胞的*、*、*值，結(jié)果*、*、*值的RSD分別為 0.03%、0.06%、0.03%，表明樣品在24 h內(nèi)顏色值穩(wěn)定性良好。

表4 Mshot Image Analysis System軟件參數(shù)

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批生地黃粉末（過4號(hào)篩）平行6份，各約1 mg，精密稱定，按“2.4.1”項(xiàng)下粉末裝片制備方法制備，置于顯微鏡下觀察并攝取木栓細(xì)胞顯微圖像，測(cè)定并記錄木栓細(xì)胞的*、*、*值，結(jié)果*、*、*值的RSD分別為0.02%、0.04%、0.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 顯微特征顏色測(cè)定 取生地黃與熟地黃飲片粉末（過4號(hào)篩），按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備粉末裝片，置于顯微鏡下觀察木栓細(xì)胞、導(dǎo)管，按“2.4.2”項(xiàng)下顯微特征攝取條件攝取木栓細(xì)胞與導(dǎo)管顯微圖像，將顯微圖像導(dǎo)入“顯微特征顏色提取”軟件，測(cè)定并記錄*、*、*值，取3張圖像*、*、*值的平均值，并計(jì)算*ab值。結(jié)果見表5。

2.5 生地黃與熟地黃飲片粉末顏色差異性分析

表5 生地黃與熟地黃飲片顯微特征顏色測(cè)定結(jié)果(n = 3)

2.5.2 聚類分析 運(yùn)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行聚類分析，采用系統(tǒng)聚類法，以生地黃與熟地黃各10批飲片的粉末顏色值*、*、*、*ab值為變量，結(jié)合平方歐式距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)20批樣品進(jìn)行聚類分析，見圖3。結(jié)果顯示，當(dāng)距離為5～10時(shí)，SD1～SD10為生地黃聚為一類，JD1～JD10為熟地黃聚為一類，表明生地黃與熟地黃飲片粉末顏色具有差異。

表6 生地黃與熟地黃飲片粉末顏色Kruska-Wallis H秩和檢驗(yàn)結(jié)果(, n = 10)

與生地黃組比較：**＜0.01，下表同

**< 0.01RR group, same as below tables

圖3 生地黃與熟地黃飲片粉末顏色值聚類分析

2.5.3 正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA） 將生地黃與熟地黃各10批飲片的粉末顏色值*、*、*導(dǎo)入SIMCA14.1軟件中，啟動(dòng)PLS-DA分析程序。模型解釋率參數(shù)2＝1.000，2＝0.824，預(yù)測(cè)能力參數(shù)2＝0.769，說明所建模型具有較高的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)率。分別生成得分散點(diǎn)圖與變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值圖，見圖4。由圖4-A可見，生地黃與熟地黃飲片樣品被分為2類，10批生地黃（SD1～SD10）聚為一類，10批熟地黃（JD1～JD10）聚為一類。VIP值圖（圖4-B）可直觀的表現(xiàn)出各顏色值影響生、熟地黃分類的權(quán)重大小，3個(gè)顏色參數(shù)根據(jù)VIP值大小排序依次為*＞*＞*。VIP＞1的為*，認(rèn)為*值是生地黃與熟地黃飲片粉末主要差異性顏色參數(shù)。

圖4 生地黃與熟地黃飲片粉末顏色值PLS-DA得分圖(A)及VIP圖(B)

2.5.4 Fisher判別分析 將樣本分為生地黃、熟地黃兩組，利用SPSS 21.0軟件，以組別為因變量，以飲片粉末顏色值*、*、*、*ab為自變量進(jìn)行Fisher判別分析，建立判別函數(shù)，并用訓(xùn)練樣本對(duì)判別式作回代考核，對(duì)判別函數(shù)進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)。

組均值的均等性檢驗(yàn)表明*、*、*、*ab值的λ值分別為0.324、0.310、0.459、0.338，值均為0.00，認(rèn)為在生地黃與熟地黃的判別函數(shù)中，*、*、*、*ab值均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。建立非標(biāo)準(zhǔn)化典則判別函數(shù)＝0.629*＋0.379*－2.754*＋1.494*ab－40.662，該函數(shù)判別規(guī)則為＞0判為生地黃，＜0判為熟地黃?；卮?yàn)證結(jié)果見表7，認(rèn)為該函數(shù)能通過粉末顏色有效判別生地黃、熟地黃飲片。

表7 回代檢驗(yàn)結(jié)果

2.6 生地黃與熟地黃飲片顯微特征顏色差異性分析

2.6.1 Kruska-Wallis秩和檢驗(yàn) 由于數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性，故采用Kruska-Wallis秩和檢驗(yàn)對(duì)生地黃與熟地黃飲片木栓細(xì)胞與導(dǎo)管顏色的*、*、*、*ab值進(jìn)行差異性比較。結(jié)果熟地黃木栓細(xì)胞和導(dǎo)管的*、*、*ab值均較生地黃顯著降低（＜0.01），而二者木栓細(xì)胞和導(dǎo)管的*值均無(wú)顯著性差異。結(jié)果見表8、9。

2.6.2 聚類分析 運(yùn)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行聚類分析，采用系統(tǒng)聚類法，以生地黃與熟地黃各10批飲片的木栓細(xì)胞、導(dǎo)管的*ab值為變量，結(jié)合平方歐式距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)20批樣品進(jìn)行聚類分析，見圖5。結(jié)果顯示，SD1～SD10為生地黃聚為一類，JD1～JD10為熟地黃聚為一類，表明生地黃與熟地黃飲片顯微特征顏色具有差異。

表8 生地黃與熟地黃飲片木栓細(xì)胞顏色Kruska-Wallis H秩和檢驗(yàn)結(jié)果(, n = 10)

表9 生地黃與熟地黃飲片導(dǎo)管顏色Kruska-Wallis H秩和檢驗(yàn)結(jié)果(, n = 10)

圖5 生地黃與熟地黃飲片顯微特征E*ab值聚類分析

2.6.3 OPLS-DA 將生地黃與熟地黃各10批飲片的木栓細(xì)胞、導(dǎo)管的*ab值導(dǎo)入SIMCA14.1軟件中，啟動(dòng)PLS-DA分析程序。模型解釋率參數(shù)2＝1.000，2＝0.824，預(yù)測(cè)能力參數(shù)2＝0.769，說明所建模型具有較高的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)率。分別生成得分散點(diǎn)圖與VIP值圖，見圖6。由圖6-A可見，生地黃與熟地黃飲片樣品被分為2類，10批生地黃（SD1～SD10）聚為一類，10批熟地黃（JD1～JD10）聚為一類。如圖6-B所示，2種顯微特征根據(jù)VIP值大小排序依次為木栓細(xì)胞＞導(dǎo)管。VIP＞1的為木栓細(xì)胞，認(rèn)為該顯微特征是生地黃與熟地黃飲片的主要差異性顯微特征。

圖6 生地黃與熟地黃顯微特征PLS-DA得分圖(A) 及VIP圖(B)

2.6.4 Fisher判別分析 由“2.6.1”項(xiàng)Kruska-Wallis秩和檢驗(yàn)表明，生地黃與熟地黃木栓細(xì)胞和導(dǎo)管顏色的*、*、*ab值存在顯著差異。由“2.6.3”項(xiàng)研究結(jié)果可知，木栓細(xì)胞為生地黃與熟地黃飲片的主要差異性顯微特征。故將樣本分為生地黃、熟地黃2組，利用SPSS 21.0軟件，以組別為因變量，以生、熟地黃飲片的木栓細(xì)胞*、*、*ab值為自變量進(jìn)行Fisher判別分析，建立判別函數(shù)，并用訓(xùn)練樣本對(duì)判別式作回代考核，對(duì)判別函數(shù)進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)。

組均值的均等性檢驗(yàn)表明*、*、*ab值的值分別為0.268、0.364、0.220，*、*、*ab值的值均為0.000，認(rèn)為生、熟地黃的判別函數(shù)中，*、*、*ab值均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。建立非標(biāo)準(zhǔn)化典則判別函數(shù)＝0.497*－0.659*＋0.267*ab－5.428，該函數(shù)判別規(guī)則為＞0判為生地黃，＜0判為熟地黃?；卮?yàn)證結(jié)果見表10，認(rèn)為該函數(shù)能通過木栓細(xì)胞顏色有效判別生地黃、熟地黃飲片。

表10 回代檢驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

本研究運(yùn)用色差法與顯微成像技術(shù)量化生地黃與熟地黃飲片粉末與顯微特征的顏色；通過OPLS- DA分析確定*為二者粉末顏色的主要差異性參數(shù)，木栓細(xì)胞為二者主要差異性顯微特征；利用Fisher判別分析建立了生地黃與熟地黃飲片粉末、顯微特征顏色的非標(biāo)準(zhǔn)化典則判別函數(shù)，規(guī)定函數(shù)判別規(guī)則為＞0判為生地黃，＜0判為熟地黃。本研究實(shí)現(xiàn)了生地黃與熟地黃粉末與顯微鑒別特征顏色的數(shù)字化評(píng)價(jià)，提供了一種通過粉末與顯微特征顏色測(cè)定快速判別生地黃與熟地黃飲片的方法。

4 討論

4.1 顯微特征顏色測(cè)定時(shí)粉末裝片工藝的優(yōu)選

目前多采用冷法裝片和酒精燈加熱透化后裝片后進(jìn)行顯微特征觀察，本研究前期對(duì)冷法裝片、酒精燈加熱透化裝片、烘箱加熱透化裝片的透化效果進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酒精燈和烘箱加熱透化的粉末裝片中顯微特征透化程度完全，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰，但酒精燈加熱透化程度不穩(wěn)定，導(dǎo)致顯微特征顏色差異較大，測(cè)定結(jié)果誤差大，而烘箱加熱透化程度穩(wěn)定，且便于控制，因此，確定采用烘箱加熱透化裝片。對(duì)不同烘制工藝進(jìn)行比較，結(jié)果以90 ℃烘制10 min裝片中顯微特征結(jié)構(gòu)清晰，透化程度統(tǒng)一，顏色均勻，因此確定透化工藝為90 ℃烘10 min。

因本研究需要待測(cè)定顯微特征在成像范圍內(nèi)單獨(dú)存在，以減少其他顯微特征或物質(zhì)對(duì)待測(cè)特征的干擾，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，因此，本研究還曾對(duì)粉末裝樣量進(jìn)行優(yōu)選，以顯微鏡視野下的特征分布密度是否適合特征單獨(dú)拍攝的需要以及特征細(xì)胞數(shù)量是否可以滿足拍攝數(shù)量的需要為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，確定粉末裝樣量為1.00～2.00 mg。在上述上對(duì)水合氯醛試液用量同樣進(jìn)行了優(yōu)選，以制備好的裝片邊緣平整，試液充滿整個(gè)蓋玻片范圍，稍有溢出可擦拭干凈，內(nèi)部無(wú)氣泡為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選取最佳水合氯醛試液用量為60～70 μL。

4.2 外界光線對(duì)顯微特征顏色測(cè)定的影響

本研究曾對(duì)外界光線是否會(huì)影響顯微特征顏色測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了考察，選擇早、午、晚3個(gè)不同光照強(qiáng)度的時(shí)間段，分別在不避光（開燈＋不拉簾）和避光（關(guān)燈＋拉簾）的環(huán)境中獲取顯微特征圖像，測(cè)定顯微特征顏色，結(jié)果顯示，不同時(shí)間段、不同光照環(huán)境下各顯微特征顏色*、*、*、*ab值的RSD均小于3%，說明外界光線的強(qiáng)弱對(duì)顯微特征顏色測(cè)定無(wú)明顯影響。

4.3 顯微特征顏色提取

本研究基于圖像分割技術(shù)與Lab顏色空間原理，以“顯微特征顏色提取”軟件，實(shí)現(xiàn)顯微特征的分割與顏色數(shù)字化測(cè)定。該軟件基于無(wú)監(jiān)督聚類和數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的方法對(duì)攝取的顯微特征圖像進(jìn)行分割，進(jìn)一步采用深度學(xué)習(xí)模型的圖像分割方案，以大量的顯微特征分割的標(biāo)注圖像為基礎(chǔ)，區(qū)分待測(cè)顯微特征與顯微圖像背景，實(shí)現(xiàn)待測(cè)顯微特征的圈定[26]，然后測(cè)定顯微特征顏色，結(jié)果以*、*、*表示。

4.4 顯微特征的選擇

本研究曾對(duì)《中國(guó)藥典》2020年版地黃與熟地黃顯微鑒別項(xiàng)下收錄的4種顯微特征木栓細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、分泌細(xì)胞、導(dǎo)管顏色均進(jìn)行了測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，薄壁細(xì)胞與分泌細(xì)胞的邊緣結(jié)構(gòu)不清晰，該兩種顯微特征與顯微圖像背景的分割效果不好，特征圈定范圍或大或小，導(dǎo)致顏色測(cè)定結(jié)果存在較大誤差，因此本實(shí)驗(yàn)未對(duì)這兩種顯微特征顏色進(jìn)行數(shù)字化分析。

4.5 生地黃與熟地黃差異性顯微特征的篩選

由于每個(gè)顯微特征的顏色指標(biāo)有3個(gè)參數(shù)，分別為*、*、*，即1個(gè)變量下有3個(gè)分變量，不能實(shí)現(xiàn)生地黃與熟地黃差異性顯微特征的篩選。本研究利用國(guó)際公認(rèn)的色差公式計(jì)算每種顯微特征的總色值*ab，將*ab值作為變量進(jìn)行PLS-DA分析，可實(shí)現(xiàn)生地黃與熟地黃飲片的差異性顯微特征的快速篩選。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification ofandbased on color digitization of powder and microscopic characteristics

ZHEN Zhen1, LI Hui-fen1, LIU Jing1, WANG Yang1, KONG Qing-yue1, ZHANG Xue-lan1, 2

1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 2. Shandong Province University Collaborative Innovation Center of Traditional Chinese Medicine Quality Control and Construction of Whole Industry Chain, Jinan 250355, China

To study the color information of powder and microscopic characteristics of Dihuang (, RR) and Shudihuang (, RRP) by the color difference method and the microscopic imaging technology, and explore the feasibility of rapid identification of RR and RRP based on colorimetric principle through statistical analysis.The precision colorimeter was used to measure the powder color of RR and RRP, the microscope was used to obtain the microscopic images of cork cells and conduits of RR and RRP, the “microscopic characteristics color extraction” software was used to measure the microscopic characteristics color, based on the values of*,*,*and*abof powder and microscopic characteristics of RR and RRP, Kruska-Wallistest, hierarchical cluster analysis and OPLS-DA was used to compare the differences between RR and RRP, Fisher discriminant analysis was used to establish the non-standardized criterion discriminant function of powder color and microscopic characteristics color of RR and RRP.*was the main difference color value and the cork cells was the main difference in microscopic characteristics of RR and RRP. The non-standardized criterion discriminant function of powder color := 0.629*+ 0.379*－2.754*+ 1.494*ab－40.662 and the non-standardized criterion discriminant function of microscopic characteristics color:= 0.497*－0.659*+ 0.267*ab－5.428, the discriminant rules of the two functions were as follows:> 0 corresponding to RR,< 0 corresponding to RRP.The digital expression of powder color and microscopic characteristics color of RR and RRP is realized by the color difference method and the microscopic imaging technology, Fisher discriminant analysis are feasible to distinguish the RR and RRP using the color information of powder and microscopic characteristics, which provides a new method for the identification of raw and processed Chinese medicine, with view to providing reference for quality evaluation of Chinese medicine.

;; color of powder; color of microscopic characteristics; digitization; color difference method; microscopic imaging technology; Kruska-Wallistest; hierarchical cluster analysis; OPLS-DA; fisher discriminant analysis

R283.6

A

0253 - 2670(2021)24 - 7438 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.005

2021-07-08

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2018YFC1707002）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2018YFC1707204）；山東省高校中藥質(zhì)量控制與全產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)協(xié)同創(chuàng)新中心資助課題（CYLXTCX2021-12）；《山東省中藥飲片炮制規(guī)范》（2022年版）飲片標(biāo)準(zhǔn)研究課題（2020-272）；《山東省中藥飲片炮制規(guī)范》（2022年版）飲片標(biāo)準(zhǔn)研究課題（2020-273）；《山東省中藥飲片炮制規(guī)范》（2022年版）飲片標(biāo)準(zhǔn)研究課題（2020-274）

甄 臻（1996—），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庯嬈苽浼夹g(shù)與質(zhì)量控制研究。Tel: 13280011703 E-mail: zz961018@126.com

張學(xué)蘭（1963—），女，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥飲片制備技術(shù)與質(zhì)量控制研究。Tel: 13406062766 E-mail: zhang8832440@sina.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]