銀杏酮酯通過抑制鈉、鈣通道和自發(fā)性鈣波防治心律失常

劉 備，張光永，劉愛華，張志雄，王星禹

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，上海 201203)

心律失常是許多心血管疾病常見癥狀，易造成循環(huán)系統(tǒng)障礙如心輸出量下降，動(dòng)脈血壓降低，暈厥，甚至導(dǎo)致心源性猝死[1]。心律失常由沖動(dòng)發(fā)生異常和傳導(dǎo)異常引起，沖動(dòng)發(fā)生異常包括異位節(jié)律和后除極引起的觸發(fā)活動(dòng)(triggered activity，TA)。后除極一旦除極至閾電位水平就觸發(fā)動(dòng)作電位導(dǎo)致心律失常。延遲后除極(delayed after depolarization，DAD)是在心肌細(xì)胞動(dòng)作電位4期復(fù)極結(jié)束后發(fā)生的短暫性、并呈現(xiàn)振蕩性的除極電活動(dòng)，又稱晚期后除極。DAD通常發(fā)生在肌漿網(wǎng)Ca2+濃度異常升高，亦即所謂鈣超載時(shí)[2]。此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度升高，激活非選擇性陽離子通道如鈣通道、鈉通道，促進(jìn)Ca2+、Na+內(nèi)流或Na+/Ca2+交換電流，形成內(nèi)向電流，導(dǎo)致DAD，引發(fā)心律失常。

近年來由于激光共聚焦顯微鏡和鈣熒光染料的普及，研究人員發(fā)現(xiàn)自發(fā)性鈣波(spontaneous Ca2+wave，SCaW)能觸發(fā)各種心律失常，鈣波是指心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高、胞內(nèi)Ca2+在局部的自發(fā)性釋放增加并發(fā)生傳導(dǎo)的現(xiàn)象[3]。SCaW激活Na+/Ca2+交換電流(INa/Ca)內(nèi)向電流，引起DAD，可能導(dǎo)致心律不齊[4]。

銀杏酮酯(ginkgo biloba extract 50,GBE50)是我國獨(dú)立研發(fā)的新型銀杏葉提取物制劑，其銀杏內(nèi)酯含量>0.06，銀杏總黃酮含量>0.44，總黃酮醇苷>0.24，毒性成分銀杏酸含量則控制在5 μg·g-1以下。有研究報(bào)道在整體水平GBE50具有抗烏頭堿、哇巴因引起的大鼠心律失常的作用[5]；另離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)也顯示GBE50能夠降低缺血/再灌注導(dǎo)致的室顫的發(fā)生率，部分縮短室顫的持續(xù)時(shí)間[6]。GBE50抗心律失常作用可能是通過抑制異常的電活動(dòng)(DAD和TA)實(shí)現(xiàn)的[5]，但其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步闡明。本研究利用膜片鉗技術(shù)研究GBE50對烏頭堿誘發(fā)的心室肌細(xì)胞異常鈉電流(INa)和L型鈣電流(ICa,L)的影響，通過激光共聚焦鈣離子成像技術(shù)觀察GBE50對缺血/再灌注誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞自發(fā)性鈣波的作用，探討其抗心律失常的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級SD雄性大鼠，體質(zhì)量(225±25)g，由上海中科院斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號：SCXK(滬)012-0002。經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會審查，實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利及倫理相關(guān)規(guī)范，倫理編號：PZSHUTCM190614008。

1.1.2藥品與試劑 Taurine、HEPES、Tetraethylammonium Chloride(TEA-Cl)、MgATP、EGTA、Tris-GTP、2，3-丁二酮一肟(BDM)、Na2-ATP、蛋白酶、烏頭堿等試劑購自Sigma公司。Fluo-4-AM購自東仁化學(xué)科技有限公司。Ⅱ型膠原酶(Collagenase，Type 2)購自Worthington 公司。Laminin購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。銀杏酮酯(GBE50)由上海杏靈制藥有限公司提供，批號為：111002。其他試劑均為滬試的分析純。

1.1.3儀器 IX-70倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)公司)；MultiClamp 700B膜片鉗放大器(美國Molecular Devices公司)；LGF-1B Langendorff 心臟灌流裝置(成都儀器廠)；TCS SP8激光共聚焦成像系統(tǒng)(德國Leica 公司)；P-97微電極拉制儀(美國Sutter公司)；SEN-3201電子刺激器(日本NIHON KOHDEN 公司)；PB-10 PH計(jì)(德國賽多利斯公司)。

1.1.4溶液配制 Krebs-Henseleit(K-H)改良液配方為(mmol·L-1)：NaCl 118.0，KCl 4.7，CaCl21.25，KH2PO41.2，MgSO41.2，NaHCO325.0，Glucose 11.0。無鈣緩沖液(mmol·L-1)：NaCl 120，KCl 5.4，NaH2PO41.2，NaHCO320，MgSO41.2，Glucose 5.6，BDM 10，Taurine 5，用稀鹽酸將pH調(diào)至7.4。在無鈣緩沖液中加入10% FBS和12.5 mmol·L-1CaCl2得到停止酶解液。缺血液(mmol·L-1)：NaCl 118.0，KCl 4.7，CaCl21.25，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO325，2-Deoxy-D-glucose 10，Na2S2O410[7]。KB液(mmol·L-1)：K glutamate 100，KCl 25，MgSO42，KH2PO42，Taurine 20，Creatine base 5，EGTA 0.5，HEPES 5，Glucose 20，加KOH校正pH值至7.4。記錄ICa,L外液(mmol·L-1)：NaCl 140，CsCl 10，CaCl21，MgCl21，glucose 10，HEPES 10(加NaOH校正pH值至7.4)。記錄ICa,L電極內(nèi)液(mmol·L-1)：CsCl 130，TEA-Cl 20，MgATP 5，EGTA 5，Tris-GTP 0.1，HEPES 5(用CsOH將pH值調(diào)至7.2)。記錄INa外液(mmol·L-1)：choline chloride 120，NaCl 25，CsCl 4，CaCl20.1，CoCl22，MgCl21，HEPES 10，Glucose 10(用CsOH將pH值調(diào)至7.4)。記錄INa電極內(nèi)液(mmol·L-1)：CsCl 140，NaCl 10，EGTA 5，Na2-ATP 5，HEPES 5(用CsOH將pH值調(diào)至7.3)。GBE50母液配制：1.25 g GBE50加入10 mL丙二醇，加熱溶解，然后加超純水至500 mL攪拌溶解，用孔徑為0.22 μm的混合纖維素脂膜過濾置于4 ℃冷藏室待用。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞分離 通過酶解法獲得單個(gè)大鼠心室肌細(xì)胞。腹腔注射20%烏拉坦5 mL·kg-1麻醉大鼠后，迅速開胸取出心臟，在冰冷的K-H緩沖液中洗去余血，迅速將心臟連于Langendorff灌流裝置上，通過主動(dòng)脈進(jìn)行逆向灌流。灌流液用 95% O2+5% CO2混合氣飽和，溫度恒定于37 ℃。先用K-H緩沖液灌流15 min，灌流速度為9 mL·min-1；然后以5 mL·min-1的速度改用無鈣緩沖液灌流10 min；再改用含0.05% II型膠原酶、0.01% 蛋白酶、0.1% BSA的無鈣緩沖液灌流2 min，最后無鈣緩沖液加入CaCl2(50 mmol·L-1)對心臟進(jìn)行循環(huán)灌流至全心松軟，取下心臟，剪下心室并剪碎心肌組織，置于搖床中振蕩溫孵5 min進(jìn)一步酶解，然后加入5 mL的停止酶解液振蕩溫孵5 min，可得到50%-60%桿狀、表面橫紋呈搓衣板狀且邊緣清晰的耐鈣細(xì)胞，沉淀后用停止酶解液換去上清兩次，然后用KB液孵育室溫保存待用。

1.2.2膜片鉗技術(shù)記錄心肌細(xì)胞膜通道電流 所用微電極用玻璃毛細(xì)管置于玻璃微電極拉制儀拉制而成，沖灌電極內(nèi)液后，其尖端電阻值為2.5-5 MΩ。吸取上述分離好的細(xì)胞滴放入顯微工作臺上細(xì)胞浴槽中，然后用微量恒流泵以1.5 mL·min-1的速度對細(xì)胞進(jìn)行灌流。并選擇形態(tài)完整、橫紋清晰、表面干凈規(guī)則、無收縮的細(xì)胞置于視野下作為實(shí)驗(yàn)對象。打開膜片鉗實(shí)驗(yàn)軟件Clampex 10.3，對細(xì)胞進(jìn)行封接，破膜，將串聯(lián)電阻補(bǔ)償?shù)?0%以上。選擇設(shè)定好的Clampex采樣軟件的Protocol，細(xì)胞膜電流信號通過膜片鉗放大器放大后通過軟件進(jìn)行記錄。并觀察1 μmol·L-1烏頭堿灌流5 min后[8]，各組細(xì)胞INa、ICa,L電流的變化。其中INa電流記錄方案為：膜電位鉗制于-100 mV，指令電壓以5 mV為步階，脈沖持續(xù)時(shí)間為100 ms，從-80 mV躍至 +25 mV。ICa,L電流記錄方案為：膜電位鉗制于-40 mV以失活T型鈣通道和鈉通道，以10 mV為步階，脈沖持續(xù)時(shí)間為200 ms，從-50 mV躍至+25 mV，每個(gè)指令電壓之前有個(gè)50 ms的-50 mV 的預(yù)脈沖。

1.2.3電刺激誘導(dǎo)鈣波 分離好的單個(gè)細(xì)胞滴加于laminin孵育過的培養(yǎng)皿，棄掉上清液，再用含5 μmol·L-1Fluo-4-AM染料的K-H液孵育15 min。將培養(yǎng)皿固定于激光共聚焦系統(tǒng)的細(xì)胞槽中，使用Ar激光在488 nm處激發(fā)染料，并檢測到波長大于510 nm的熒光發(fā)射。正常組對照組(Control組)：K-H液灌流10 min以洗脫染料，開始電刺激10 s(電壓10 mV，頻率1 Hz或3 Hz)，同時(shí)選擇xt掃描方式[9]進(jìn)行線掃(掃描分辨率為：512×1像素，每次線掃時(shí)長為1.43 ms)，待電刺激結(jié)束后繼續(xù)線掃記錄1 min，以觀察記錄鈣波發(fā)生情況。缺血/再灌注組(IR組)或加藥組(IR+GBE50組)：先用K-H液或加藥K-H液灌流10 min以洗脫染料，改用缺血液或加藥缺血液灌流4 min，再用K-H液或加藥K-H液再灌流3 min，然后開始電刺激10 s，同時(shí)進(jìn)行線掃，待電刺激結(jié)束后繼續(xù)線掃記錄1 min，以觀察記錄鈣波發(fā)生情況。

2 結(jié)果

2.1 GBE50對烏頭堿灌流的心肌細(xì)胞INa電流的作用烏頭堿(1 μmol·L-1)使心肌細(xì)胞INa最大電流密度從(-25.94±2.10)pA/pF增至(-37.21±4.23)pA/pF(P<0.05)，使INa激活曲線左移，半激活電壓從(-44.07±0.92)mV變?yōu)?-49.52±0.81)mV(P<0.01)；而25 mg·L-1GBE50使該模型的INa最大電流密度減小至(-27.11±2.18)pA/pF(P<0.05)，激活曲線右移，半激活電壓改變?yōu)?-46.33±1.19)mV(P<0.05,Fig 1)。

2.2 GBE50對烏頭堿灌流的心肌細(xì)胞ICa,L電流的作用使用L型鈣通道特異性阻斷劑Nifedipine(10 μmol·L-1)能明顯阻斷記錄到的電流，證明記錄到的正是ICa,L電流(Fig 2A)。

烏頭堿(1 μmol·L-1)使心肌細(xì)胞ICa,L最大電流密度從(-3.79±0.27)pA/pF增至(-5.01±0.26)pA/pF(P<0.01)，使ICa,L激活曲線左移，半激活電壓從(-16.22 ± 0.81)mV變?yōu)?-23.67±0.85)mV(P<0.01)；而25 mg·L-1GBE50使該模型的ICa,L最大電流密度減小至(-3.81± 0.24)pA/pF(P<0.01)，激活曲線右移，半激活電壓改變?yōu)?-20.84±0.82 mV)(P<0.05,Fig 2B-H)。

Fig 1 GBE50 inhibited aconitine-induced increase in sodium current in rat ventricular cells n=12-14)A:INa recorded for the control;B:INa recorded in the Aco group;C:INa recorded in Aco+GBE50 group;D:Current density-voltage curves for INa in different groups;E:Recording protocol of INa;F:INa Steady-state activation curves;G:Half activation potential of different groups;.Aco:aconitine;*P<0.05,**P<0.01 vs Aco group

Fig 2 GBE50 inhibited aconitine-induced increase in calcium current in rat ventricular cells n=8)A:Nifedipine block of ICa,L；B：ICa,L recorded for the control;C:ICa,L recorded in the Aco group;D:ICa,L recorded in Aco+GBE50 group;E:Current density-voltage curves for ICa,L in different groups;F:Recording protocol of ICa,L;G:ICa,L Steady-state activation curves;H:Half activation potential of different groups;Aco:aconitine;*P<0.05,**P<0.01 vs Aco group

2.3 GBE50對缺血/再灌注心肌細(xì)胞的自發(fā)性鈣波的影響使用1 Hz頻率刺激大鼠缺血/再灌注心肌細(xì)胞10 s誘導(dǎo)產(chǎn)生自發(fā)性鈣波，IR組鈣波的發(fā)生率明顯高于Control組，由12.50%上升至81.25%(P<0.01)；25 mg·L-1GBE50未引起正常心肌細(xì)胞鈣波的發(fā)生，可降低IR組的鈣波發(fā)生，將鈣波發(fā)生率降低至26.67%(P<0.01,Fig 3A,C)。

使用3 Hz頻率刺激大鼠缺血/再灌注心肌細(xì)胞10 s誘導(dǎo)產(chǎn)生自發(fā)性鈣波，IR組鈣波的發(fā)生率明顯高于Control組，由20.00%上升至90.00%(P<0.01)；25 mg·L-1GBE50可降低IR組的鈣波發(fā)生，將鈣波發(fā)生率降低至30.00%(P<0.01,Fig 3B，D)。

Fig 3 25 mg·L-1 GBE50 inhibited increase of SCaWs during ischemia-reperfusion in rat ventricular myocytes (n=10-15)A:SCaWs was induced by applying depolarizing pulses at 1 Hz;B:SCaWs was induced by applying depolarizing pulses at 3 Hz;C:Percent of cells with SCaWs at 1 Hz (n=15);D:Percent of cells with SCaWs at 3 Hz (n=10);**P<0.05 vs Control group,##P<0.01 vs IR group

3 討論

烏頭堿可導(dǎo)致整體或細(xì)胞水平的“心律失?！保驯粡V泛用作誘導(dǎo)各種心律失常模型、篩選抗心律失常藥物的工具藥[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道烏頭堿能夠延長心肌細(xì)胞鈉通道的開放，促進(jìn)Na+向細(xì)胞中的滲透[8]，并可增加ICa,L離子流[11]。烏頭堿誘導(dǎo)的胞內(nèi)Na+濃度的增加會促進(jìn)Na+/Ca2+雙向交換[12]，和ICa,L促進(jìn)Ca2+內(nèi)流可共同導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而引起DAD，同時(shí)胞內(nèi)Na+濃度的增加并導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)的去極化即觸發(fā)活動(dòng)(TA)。上述過程構(gòu)成了烏頭堿的致心律失常作用的電生理基礎(chǔ)。本文對INa和ICa,L進(jìn)行激活動(dòng)力學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)烏頭堿使INa和ICa,L激活曲線左移，半激活電壓絕對值增加，說明烏頭堿灌流心肌細(xì)胞后INa和ICa,L內(nèi)向電流被激活增強(qiáng)。而25 mg·L-1GBE50使該模型的INa和ICa,L最大電流密度減小，激活曲線右移，半激活電壓減小，提示GBE50明顯抑制烏頭堿激活的INa和ICa,L，可能是GBE50抑制異常的電活動(dòng)(DAD和TA)抗心律失常的機(jī)制。

臨床上大多數(shù)的抗心律失常藥物都是通過改變心肌細(xì)胞動(dòng)作電位不同時(shí)期的離子通道開放狀態(tài)和離子流而發(fā)生作用的。近年來發(fā)現(xiàn)抗心律失常藥物本身有時(shí)也會引起心律失常，如Ιa類藥物中度阻斷鈉通道，使Q-T間期延長，可引起致死性的尖端扭轉(zhuǎn)性室速的發(fā)生。鑒于單通道抗心律失常藥物具有致心律失常的不良反應(yīng)，有學(xué)者提出最佳靶點(diǎn)學(xué)說：細(xì)胞膜上的鈉、鉀、鈣離子通道與心律失常發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，一個(gè)理想的抗心律失常藥物會對其中的至少兩個(gè)通道起作用[13]。理想的抗心律失常藥物應(yīng)該作用于多通道靶標(biāo)和非離子通道靶標(biāo)[14]。1 Hz電刺激下GBE50未能引起正常心肌細(xì)胞自發(fā)性鈣波的發(fā)生，說明GBE50的抗心律失常作用是安全的。GBE50對心肌非選擇性陽離子通道如鈉、鈣離子通道均有作用，抑制鈣超載治療心律失常，致心律失常的風(fēng)險(xiǎn)降低，符合“最佳靶點(diǎn)學(xué)說”的要求。

缺血/再灌注后由于鈣釋放和回?cái)z通道的異常作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣循環(huán)的紊亂，表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)鈣超載從而促進(jìn)肌漿網(wǎng)鈣超載，產(chǎn)生肌漿網(wǎng)的鈣泄漏引起舒張期自發(fā)性鈣釋放即鈣波，可誘導(dǎo)DAD的活動(dòng)，從而引發(fā)再灌注性心律失常[15]。我們之前有發(fā)現(xiàn)模擬缺血能誘發(fā)心室肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度增加，GBE50可減輕缺血后鈣超載[16]。本文采用含有2-脫氧-D-葡萄糖和連二亞硫酸鈉的無糖K-H液[7]模擬缺血灌流心室肌細(xì)胞4 min，再用K-H液復(fù)灌3 min，制備模擬缺血/再灌注模型，觀察自發(fā)性鈣波產(chǎn)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 Hz和3 Hz電刺激心室肌細(xì)胞尚能發(fā)生收縮和鈣瞬變，停止刺激后能觀察到Ca2+在局部的自發(fā)性釋放增加并伴傳導(dǎo)即自發(fā)性鈣波的發(fā)生。GBE50可抑制缺血/再灌注心肌細(xì)胞自發(fā)性鈣波的發(fā)生，提示GBE50可能通過抑制心肌缺血導(dǎo)致的鈣超載，減少肌漿網(wǎng)的鈣泄漏，阻止DAD的發(fā)生從而減輕再灌注性心律失常。

自發(fā)性鈣波產(chǎn)生的機(jī)制尚不清楚，在數(shù)學(xué)模型中它們的出現(xiàn)與肌漿網(wǎng)的蘭尼堿受體(ryanodine receptors,RyRs)的活性有關(guān)[3]。肌漿網(wǎng)鈣釋放有兩條不同的機(jī)制：一是通過由L型鈣通道和RyRs共定位形成的所謂鈣釋放單位，也就是經(jīng)典的鈣誘導(dǎo)的鈣釋放途徑[17]。另一種不依賴于L型鈣通道和RyRs的耦聯(lián)，由隨機(jī)開放的一個(gè)或幾個(gè)RyRs引起鈣的釋放。上述兩種情況下局部的鈣釋放都可以通過鈣敏感探針將胞內(nèi)Ca2+可視化而記錄到鈣火花(Ca2+sparks)。GBE50對鈣火花即肌漿網(wǎng)的鈣泄漏是否有影響及其機(jī)制還亟待探索。