蘆薈大黃素衍生物AE-YJ通過PI3K-Akt/NF-κB和MAPK/NF-κB途徑抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥介質(zhì)的釋放

郭 靜，尚 海，馬麗炎，高 源，李陵宇，鄒忠梅，宛 蕾

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 貴州 550025；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

炎癥定義為免疫系統(tǒng)對微生物入侵或傷害的局部保護(hù)反應(yīng)[1]。但值得注意的是，過度的炎癥會(huì)損害身體[2]。巨噬細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞充當(dāng)?shù)钟肭治?細(xì)菌、病毒和真菌)的第一道防線[3]。在炎癥過程中，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過量的炎癥介質(zhì)[4]，例如PGE2、NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等，繼而引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。炎癥與許多疾病相關(guān)，并且由于其復(fù)雜性很難被治愈[5]。

炎癥通過不同途徑起作用。NF-κB作為炎癥發(fā)生的一條重要途徑，是炎癥和抗炎的核心[6]。細(xì)胞外刺激(例如IL-1β和TNF-α)可觸發(fā)NF-κB途徑激活。NF-κB信號(hào)通路的起始端由信號(hào)分子結(jié)合膜受體(例如TLR4)進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，激活I(lǐng)KK激酶。IKK是IκB的激酶，可以促進(jìn)IκB的磷酸化，磷酸化的IκB被泛素化降解，使得NF-κB脫離出來從胞質(zhì)入核，激活下游基因(例如iNOS和COX-2)的轉(zhuǎn)錄[7]。NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性受細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控，包括PI3K/Akt和MAPK途徑。PI3K/Akt途徑中，活化的Akt增加IKKα的磷酸化，激活NF-κB途徑[8]。MAPK稱為NF-κB的上游激活劑，可調(diào)控NF-κB途徑的轉(zhuǎn)錄激活[9]。MAPK信號(hào)通路本身也對炎癥因子的釋放起著重要的調(diào)節(jié)作用[10]。研究證明，MAPK抑制劑降低LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中NF-κB的下游效應(yīng)因子，例如iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)[11]。總之，PI3K-Akt/NF-κB和MAPK/NF-κB途徑之間相對激活的微妙平衡似乎對于細(xì)胞存活和增殖基因的表達(dá)至關(guān)重要[12]。

蘆薈大黃素(aloe-emodin,AE)作為一種蒽醌類天然產(chǎn)物，主要來源于大黃、蘆薈、決明子等中藥，其具有出色的抗炎活性。已有研究表明，蘆薈大黃素可通過NF-κB[13]，MAPK[14]和PI3K/Akt[15]等多種途徑降低炎癥因子(例如TNF-α、IL-1β、IL-6)的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用。然而，蘆薈大黃素的溶解度很差，在很大程度上影響了其生物利用度。因此，本研究設(shè)計(jì)合成帶親水哌嗪基團(tuán)的蘆薈大黃素衍生物AE-YJ。在此基礎(chǔ)上，以LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞作為炎性細(xì)胞模型，檢測AE-YJ對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)的影響，通過蛋白質(zhì)印跡分析和免疫熒光的方法進(jìn)一步研究對PI3K/Akt、NF-κB和MAPK信號(hào)途徑的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(20042706，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)。

1.2 藥品與試劑蘆薈大黃素(DL0007)，成都德思特生物技術(shù)有限公司；LPS(057M4013V)，美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基(11965092)，美國Gibco公司；FBS(10099-141)，澳大利亞Gibco公司；ECL Western blot底物(P0018FS、BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒(P0012S)、一氧化氮檢測試劑盒(S0021)，中國Beyotime公司；TNF-α ELISA試劑盒(430907)、IL-6 ELISA試劑盒(431307)，美國Biolegend公司；IL-1β ELISA試劑盒(1210122)，深圳達(dá)科為公司；PGE2 ELISA試劑盒(ADI-930-001)，美國ENZO公司；iNOS兔多克隆抗體(A18247，1 ∶1 000)、COX-2兔多克隆抗體(A1253，1 ∶1 000)、IκBα兔單克隆抗體(A19714，1 ∶1 000)、p-IκBα兔多克隆抗體(AP0614，1 ∶1000)、NF-κB p65兔單克隆抗體(A19653，1 ∶1 000)、Akt 兔單克隆抗體(A17909，1 ∶1 000)、p-Akt 兔單克隆抗體(AP1208，1 ∶1 000)、ERK1/2鼠單克隆抗體(A10613，1 ∶1 000)、p-ERK1/2鼠單克隆抗體(AP0485，1 ∶1 000)、p38 兔單克隆抗體(A4771，1 ∶1 000)、p-p38 兔多克隆抗體(AP0057，1 ∶1 000)、JNK1/JNK2/JNK3兔單克隆抗體(A4867，1 ∶1 000)、p-JNK 兔單克隆抗體(AP0613，1 ∶1 000)、組蛋白H3多克隆抗體(A2348，1 ∶1 000)、GAPDH兔單克隆抗體(AC033，1 ∶1 000)、羊抗兔IgG辣根過氧化物酶二抗(AS014，1 ∶10 000)、羊抗鼠IgG辣根過氧化物酶二抗(AS003，1 ∶10 000)、Alexa Fluor 488羊抗兔IgG辣根過氧化物酶二抗(AS053，1 ∶500)，武漢ABclonal公司。

1.3 AE-YJ的結(jié)構(gòu)本實(shí)驗(yàn)室合成了AE-YJ，見Fig 1。

Fig 1 Chemical structures of AE and AE-YJ

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%熱滅活的FBS含青霉素G(100 kU·L-1)和鏈霉素(100 mg·L-1)的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2和95%空氣的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。RAW264.7細(xì)胞每隔3 d進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞用不同濃度的AE-YJ培養(yǎng)，并用LPS(10 μg·L-1)刺激指定的時(shí)間。在DMSO中制備AE-YJ的儲(chǔ)備溶液，實(shí)驗(yàn)中所用AE-YJ為培養(yǎng)基稀釋至指定濃度，DMSO的最終濃度小于0.5%。

1.5 小鼠腹膜原發(fā)性巨噬細(xì)胞的提取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性Balb/c小鼠，(18-22)g，SPF級，購自北京維通利華，SYXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.6 AE-YJ對RAW264.7細(xì)胞活力的影響用不同濃度的AE-YJ(0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol·L-1)處理RAW264.7細(xì)胞(2.0×109個(gè)·L-1)24 h，每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL，繼續(xù)孵育4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀492 nm處讀取吸光度。

1.7 NO測定將RAW264.7細(xì)胞以2.0×109個(gè)·L-1的密度接種到96孔板中，然后用10 μg·L-1LPS和AE-YJ(1.5625、3.125、6.25、12.5、25 μmol·L-1)處理24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，按NO檢測試劑盒操作說明檢測NO含量。

1.8 NO自由基的清除根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[16]測定AE-YJ對一氧化氮自由基的影響。將75 μL硝普鈉(60 mmol·L-1SNP溶于PBS)溶液與75 μL不同濃度的AE-YJ在25 ℃避光孵育5 h。然后將100 μL Griess試劑添加到包含混合物的孔中，540 nm測亞硝酸鹽水平。

1.9 IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2測定RAW264.7細(xì)胞(2.0×109個(gè)·L-1)接種至96孔板中，并用不同濃度(3.125、6.25、12.5 μmol·L-1)的AE或AE-YJ和LPS(10 μg·L-1)孵育24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液后，使用LEGEND MAXTM小鼠ELISA試劑盒測定IL-6、TNF-α的濃度。用小鼠IL-1β ELISA試劑盒檢測IL-1β含量。用PGE2高靈敏度ELISA試劑盒對樣品中PGE2濃度進(jìn)行了定量。

1.10 細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白的制備RAW264.7細(xì)胞(2.0×109個(gè)·L-1)接種至6孔板中，用不同濃度(3.125、6.25、12.5 μmol·L-1)的AE-YJ處理細(xì)胞24 h，100 μg·L-1LPS刺激30 min后，按細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒說明分別制備細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白，然后進(jìn)行Western印跡分析。

1.11 總mRNA提取和定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)RAW264.7細(xì)胞接種在6孔板，LPS(10 μg·L-1)和AE-YJ共同處理24 h后，使用TRIzol從細(xì)胞樣品中分離出總RNA。用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ?qū)⒖俁NA(2 μg)反轉(zhuǎn)錄成cDNA 20 μL。q-PCR在PIKORed 96實(shí)時(shí)PCR上進(jìn)行。用于RT-PCR分析的引物序列如下。COX-2 sense-ATTCCAAACCAGCAGACTCATA,antisense-CTTGAGTTTG AAGTGGTAACCG,IL-6 sense-CTCCCAACAGACCT GTCTATAC,antisense-CCATTGCACAACTTTTCTCA;IL-1β sense-TCTCGCAGCAGCAACATCAACAAGAGC，antisense-GGAAGGTCCAAGGGAAAGACACAGGT;GAPDH sense-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGA TT,antisense-GTCTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGG循環(huán)擴(kuò)增條件如下隨后：95 ℃初始變性30 s，95 ℃持續(xù)變性5 s和55 ℃持續(xù)退火30 s，72 ℃持續(xù)30 s充分延伸，采集熒光。完成45個(gè)PCR擴(kuò)增周期后，進(jìn)行溶解曲線分析。COX-2、IL-1β、IL-6 mRNA水平歸一化為GAPDH。

1.12 蛋白質(zhì)印跡分析RAW264.7細(xì)胞(2.0×109個(gè)·L-1)接種至6孔板中并生長直到85%-95%匯合度。裂解細(xì)胞后在4 ℃下離心15 min，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度后，煮沸10 min使其完全變性。用4%-20%梯度分離膠電泳分離后再轉(zhuǎn)移至PVDF膜。室溫下用封閉液封閉30 min，然后將膜與特異性一抗在4 ℃孵育過夜。洗膜3次后孵育對應(yīng)二抗1 h。洗膜3次后在ChemDocTMXRS +成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)中獲得蛋白條帶。將GAPDH和H3用作過程控制的內(nèi)標(biāo)。用Image Lab軟件進(jìn)行印跡密度測定。

1.13 免疫熒光檢測取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞(5.0×109個(gè)·L-1)，取500 μL接種至24孔板，用不同濃度的AE-YJ(3.125、6.25、12.5 μmol·L-1)處理24 h。在100 μg·L-1LPS刺激30 min后，將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min。用0.5% Triton X-100處理10 min，然后用免疫熒光封閉液封閉1 h，用p65抗體在4 ℃孵育過夜。將細(xì)胞與Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG避光在室溫下孵育1 h。在黑暗中，用抗熒光淬滅封片劑(含DAPI)封片，使用掃描電子顯微鏡(Ex:495 nm，Em:519 nm，Inspect，美國FEI)掃描全片。使用Caseviewer軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 AE-YJ減少LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NO的產(chǎn)生MTT結(jié)果顯示，AE-YJ在0-25 μmol·L-1的濃度下對細(xì)胞活力無明顯影響(Fig 2A)。因此，在下述實(shí)驗(yàn)中，AE-YJ的濃度不超過25 μmol·L-1。Griess實(shí)驗(yàn)顯示，LPS誘導(dǎo)，RAW264.7細(xì)胞中的NO明顯增加(P<0.01)。AE-YJ明顯抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生NO(P<0.01)(Fig 2B)，6.25 μmol·L-1劑量AE-YJ抑制NO作用明顯強(qiáng)于AE(P<0.01)。AE和AE-YJ抑制LPS刺激RAW264.7細(xì)胞中NO釋放的IC50分別為7.091 μmol·L-1和5.725 μmol·L-1。在小鼠腹膜原發(fā)性巨噬細(xì)胞中也得到了類似結(jié)果，AE-YJ和AE抑制LPS刺激NO釋放的IC50分別為5.332 μmol·L-1和3.191 μmol·L-1(Fig 2C)。因此，AE-YJ抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO并不是由細(xì)胞毒作用導(dǎo)致的。

2.2 AE-YJ對NO自由基無直接清除作用將不同濃度的AE-YJ(0-25 μmol·L-1)與SNP避光25 ℃孵育5 h。結(jié)果顯示，AE-YJ未減少SNP溶液中NO自由基釋放(Fig 3)。同時(shí)，AE也得到了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，AE-YJ無直接清除NO自由基的作用。

2.3 AE-YJ減少LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的釋放使用ELISA試劑盒測定培養(yǎng)上清中PGE2、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平。結(jié)果顯示(Fig 4)，LPS模型組的細(xì)胞上清液中PGE2、TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度明顯增加(P<0.01)。不同濃度的AE-YJ對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中PGE2、TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放具有明顯的抑制作用(P<0.01)。同等劑量的AE-YJ抑制作用明顯強(qiáng)于AE(P<0.01)。因此，AE-YJ可明顯抑制RAW264.7細(xì)胞中炎癥介質(zhì)(如PGE2、TNF-α、IL-1β和IL-6)的釋放，且抑制作用強(qiáng)于AE。

Fig 2 Effect of AE and AE-YJ on NO release ##P<0.01 vs control group；*P<0.05，**P<0.01 vs LPS group；△△P<0.01 vs AE group.

2.4 AE-YJ減少LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中COX-2、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)Fig 5所示，LPS(10 μg·L-1)模型組中IL-1β、IL-6和COX-2 mRNA的表達(dá)明顯增加(P<0.01)。與LPS模型組相比，不同濃度的AE-YJ處理RAW264.7細(xì)胞24 h后，IL-1β、IL-6和COX-2 mRNA的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。與同等濃度處理的AE組相比，AE-YJ抑制IL-1β、IL-6和COX-2 mRNA表達(dá)的作用更強(qiáng)(P<0.01)。

Fig 3 Effects of AE-YJ on nitric oxide radicals n=3)##P<0.01 vs control group.

2.5 AE-YJ抑制LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2的蛋白表達(dá)RAW264.7細(xì)胞用LPS(10 μg·L-1)和AE-YJ處理24 h，并通過蛋白印跡法分析NF-κB信號(hào)通路中iNOS、COX-2的表達(dá)。如Fig 6所示，LPS模型組iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)。與LPS模型組比較，AE-YJ處理后LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中iNOS和COX-2的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。

2.6 AE-YJ抑制LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中NF-κB通路的激活LPS(100 μg·L-1)暴露促進(jìn)了模型組中RAW264.7細(xì)胞中的IκBα蛋白降解(P<0.01)(Fig 7A，B)。與LPS模型組相比，AE高濃度處理可以阻礙IκBα蛋白降解(P<0.01)，AE-YJ可明顯抑制IκBα蛋白降解(P<0.01)，但AE-YJ還顯示出可以明顯增加IκBα蛋白表達(dá)水平(P<0.01)。為了研究AE-YJ對NF-κB p65核易位的影響，使用蛋白質(zhì)印記分析和免疫熒光法檢查了 LPS刺激后p65在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的分布。如Fig 7(C，D，E，F(xiàn))所示，LPS模型組RAW264.7細(xì)胞核中p65的含量明顯增加(P<0.01)。與LPS模型組相比，AE-YJ的處理明顯降低了p65蛋白在細(xì)胞核中含量(P<0.01)。免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步顯示(Fig 7G-I)，正常對照組中，p65蛋白在細(xì)胞核內(nèi)幾乎無表達(dá)。LPS模型組RAW264.7細(xì)胞，p65在細(xì)胞核內(nèi)的含量明顯增加(P<0.01)。與LPS模型組相比，AE-YJ明顯減少p65蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的量(P<0.01)。這些結(jié)果表明，AE-YJ抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的核易位，并且能增加IκBα的蛋白表達(dá)。因此，AE-YJ抑制了RAW264.7細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的激活，這可能與增加IκBα的蛋白表達(dá)有關(guān)。

Fig 4 Effects of AE and AE-YJ on inflammatory mediators released by LPS stimulated RAW 264.7 cells n=3)##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs LPS group;△△P<0.01 vs AE group.

Fig 5 Effects of AE-YJ on mRNA expression of IL-1β,IL-6 and COX-2 in LPS-stimulated RAW 264.7 cells ##P<0.01 vs control group;**P<0.01 vs LPS group;ΔΔP<0.01 vs AE group.

2.7 AE-YJ抑制LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路的激活如Fig 8，LPS誘導(dǎo)模型組RAW264.7細(xì)胞中磷酸化Akt的表達(dá)明顯增加(P<0.01)。與LPS模型組相比，3.125 μmol·L-1AE-YJ處理使磷酸化Akt的表達(dá)降低75%(P<0.01)，而相同濃度的AE僅使其降低30%(P<0.01)。6.25 μmol·L-1濃度下AE-YJ和AE分別使Akt的磷酸化表達(dá)降低85%(P<0.01)和65%(P<0.01)。12.5 μmol·L-1濃度下AE-YJ和AE分別使Akt的磷酸化表達(dá)降低93%(P<0.01)和90%(P<0.01)。這些結(jié)果表明，AE-YJ對Akt磷酸化的抑制作用強(qiáng)于AE。

Fig 6 Effects of AE-YJ on protein expression levels of iNOS,COX-2 in LPS stimulated RAW264.7 cells ##P<0.01 vs control group;**P<0.01 vs LPS group.

2.8 AE-YJ抑制LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路的激活結(jié)果如Fig 9所示。LPS模型組p-ERK、p-p38和p-JNK的蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，表明LPS誘導(dǎo)可以激活RAW264.7細(xì)胞MAPK途徑中的ERK、p38和JNK的磷酸化。與LPS模型組相比，AE-YJ處理后，LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路的p-ERK、p-p38和p-JNK的表達(dá)明顯減少(P<0.01)。結(jié)果表明AE-YJ的抗炎機(jī)制可能與抑制MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)。AE-YJ也可能是通過抑制MAPK信號(hào)通路中ERK、p38和JNK蛋白的激活，并間接影響NF-κB通路的活化，通過MAPK/NF-κB途徑發(fā)揮抗炎作用。

3 討論

許多研究已證明,AE在體內(nèi)外具有多種藥理活性[10]，其抗炎作用尤為突出[17]。對AE的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了修飾，設(shè)計(jì)引入含氮基團(tuán)和哌嗪基團(tuán)，合成了蘆薈大黃素衍生物AE-YJ。在炎癥反應(yīng)中，iNOS和COX-2大量表達(dá)并催化產(chǎn)生大量的NO和PGE2。過量的NO又會(huì)誘發(fā)炎性疾病的發(fā)生發(fā)展[18]。結(jié)果顯示AE-YJ可以有效抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞和小鼠腹膜原發(fā)性巨噬細(xì)胞釋放NO。驚喜的是，相較于AE，AE-YJ顯示出更為強(qiáng)烈的抑制NO釋放的活性。由于化合物直接清除NO也可以造成細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO含量減少，為檢查AE-YJ是否對NO自由基有影響，采用了SNP釋放NO的無細(xì)胞體系，實(shí)驗(yàn)也證明了AE-YJ無直接清除NO的作用(Fig 3)。此外，炎性介質(zhì)(例如PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β)在炎癥疾病的發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示AE-YJ可明顯降低LPS刺激RAW264.7細(xì)胞中PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β(Fig 4)的產(chǎn)生，AE-YJ顯示出比AE更好的抗炎活性，AE-YJ更明顯的抑制炎性細(xì)胞因子釋放。這些結(jié)果表明，AE-YJ具有抗炎活性，這可能是通過抑制炎性介質(zhì)的產(chǎn)生而發(fā)揮作用。iNOS和COX-2[18]的蛋白表達(dá)直接影響NO和PGE2的量。研究結(jié)果顯示AE-YJ明顯抑制iNOS和COX-2的表達(dá)(Fig 6)。

Akt是葡萄糖代謝和細(xì)胞生長中重要的調(diào)節(jié)分子，調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖。炎癥中，Akt的異常表達(dá)會(huì)促進(jìn)IκBα的降解，介導(dǎo)NF-κB途徑的活化。本研究表明，LPS刺激30 min后，Akt的磷酸化增加，IκBα的降解以及IκBα和p65的磷酸化也明顯增加，提示NF-κB的激活明顯增加。AE-YJ處理可以有效抑制Akt的磷酸化，明顯阻礙IκBα的降解，并明顯增加IκBα的表達(dá)(Fig 7,8)，免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡分析顯示p65易位入核減少(Fig 7)進(jìn)而降低炎性相關(guān)蛋白基因的表達(dá)。因此，AE-YJ的抗炎機(jī)理可能與PI3K-Akt和NF-κB途徑有關(guān)。AE-YJ通過下調(diào)PI3K-Akt/NF-κB途徑來抑制炎癥介質(zhì)和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。除NF-κB外，許多證據(jù)表明MAPK途徑在炎癥反應(yīng)中也起重要作用。MAPK途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長周期，調(diào)控炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。MAPK途徑在NF-κB通路的活化中起著重要作用。研究顯示AE-YJ明顯降低LPS誘導(dǎo)的p38、ERK和JNK的磷酸化和炎癥因子的表達(dá)。這可能是AE-YJ通過抑制MAPK信號(hào)通路的激活，直接降低炎性細(xì)胞因子的釋放。也有可能是AE-YJ通過抑制MAPK信號(hào)通路的激活，從而影響NF-κB途徑的活化。即AE-YJ通過MAPK/NF-κB途徑降低炎癥因子和炎癥相關(guān)蛋白基因的產(chǎn)生。因此，AE-YJ可能通過抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中的PI3K-Akt/NF-κB 和MAPK/NF-κB途徑降低炎性細(xì)胞因子PGE2、TNF-α、IL-6以及IL-1β的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。

Fig 7 Effects of AE-YJ on NF-κB pathway in LPS-stimulated RAW264.7 cells ##P<0.01 vs control group;*P<0.05，**P<0.01 vs LPS group.

Fig 8 Effects of AE-YJ on PI3K/Akt signaling in LPS-induced RAW264.7 ##P<0.01 vs control group;*P<0.05，**P<0.01 vs LPS group.

Fig 9 Effects of AE-YJ on MAPK signaling pathway in LPS-induced RAW264.7 ##P<0.01 vs control group;*P<0.05，**P<0.01 vs LPS group.

綜上所述，AE-YJ抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NO、PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生，同等劑量下，AE-YJ顯示出比AE更強(qiáng)的抗炎活性。AE-YJ的抗炎作用機(jī)制可能是通過PI3K-Akt/NF-κB和MAPK/NF-κB途徑下調(diào)iNOS、COX-2以及IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)。