• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    補(bǔ)氣活血解毒方及依普利酮抑制醛固酮誘導(dǎo)HK2細(xì)胞焦亡

    2021-12-16 06:15:34馬雪蓮王香婷王琬瑤許慶友
    中國(guó)藥理學(xué)通報(bào) 2021年12期

    馬雪蓮,李 慧,常 奕,王 箏,王香婷,,王琬瑤,許慶友

    (1.河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2.河北中醫(yī)學(xué)院,河北 石家莊 050091)

    梗阻性腎病占成人慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)病因10%,也是兒童終末期腎病的首要病因[1]。炎性損傷和腎臟固有細(xì)胞損失是梗阻性腎病的重要原因。動(dòng)物研究表明,凋亡、自噬、壞死或細(xì)胞轉(zhuǎn)化可引起腎臟固有細(xì)胞急劇減少[2]。腎臟固有細(xì)胞損失可促進(jìn)腎臟纖維化和腎功能惡化。焦亡,一種新的可調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式,不僅導(dǎo)致細(xì)胞減少而且?guī)?lái)嚴(yán)重炎癥損傷,近來(lái)在心血管和腎臟領(lǐng)域頗受關(guān)注。有報(bào)道稱梗阻性腎病時(shí)血漿醛固酮升高可導(dǎo)致腎臟巨噬細(xì)胞焦亡,而關(guān)于腎臟固有細(xì)胞焦亡少有研究。本實(shí)驗(yàn)采用醛固酮體外刺激人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK2),觀察補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清及依普利酮對(duì)于DNA損傷、鹽皮質(zhì)激素受體NR3C2、血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1 (serum and glucocorticoid-induced protein kinase 1,SGK-1)、核因子кB(nuclear factor кB,NF-κB)、焦亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-like pyrin domain containing protein 3)、caspase-1和IL-1β的調(diào)控情況,研究補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清及依普利酮抑制鹽皮質(zhì)激素受體活化導(dǎo)致的HK2細(xì)胞焦亡的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 藥物依普利酮:購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(粉劑,批號(hào)APN12608-1-1),用DMSO配制成100 mmol·L-1的溶液。醛固酮:購(gòu)自美國(guó)Cayman公司(粉劑,批號(hào)0487439-4),用無(wú)水乙醇配制成10 mmol·L-1溶液。補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清:5只Wistar大鼠,清潔級(jí),♂,購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證編號(hào)1605359)用于血清制備。補(bǔ)氣活血解毒方采用一方制藥公司(廣東)的配方顆粒劑,藥味包括金銀花(批號(hào)6020961)、黃芩(批號(hào)6033511)、黃芪 (批號(hào)403196T)、赤芍(批號(hào) 311400T)、醋鱉甲(批號(hào)6013581)、地龍(批號(hào)6033291),質(zhì)量配伍比例為20 ∶18 ∶40 ∶20 ∶7 ∶10。該組方顆粒按1.92 g·kg-1大鼠質(zhì)量溶于3 mL蒸餾水,每日1次灌胃,共3日。末次給藥后1 h股靜脈取血分離血清并使用0.22 μm針孔過濾器過濾備用。

    1.2 試劑與主要儀器TUNEL試劑盒(英國(guó)Eterlife公司,批號(hào)11422200),NR3C2抗體(美國(guó)Proteintech公司,批號(hào)21854-1-AP),SGK-1抗體(英國(guó)Abcam公司,批號(hào)GR197317-12),NF-кB(p65)抗體(武漢Servicebio公司,批號(hào)181905),IL-1β抗體(美國(guó)Novus公司,批號(hào)NB60-633),caspase-1抗體(美國(guó)Proteintech公司,批號(hào)00046167),NLRP3抗體(英國(guó)Eterlife公司,批號(hào)F1716),DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)GIBCO公司,批號(hào)8118319)。全自動(dòng)活細(xì)胞成像系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Fisher scientific公司,型號(hào)EVOS FL Auto),近紅外激光掃描成像儀(美國(guó)LI-COR公司,型號(hào)Odyssey),半干轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)BIO-RAD公司,型號(hào)Semi-dry),激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司,型號(hào)SP8)。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)采用人近端腎小管上皮細(xì)胞HK2為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。細(xì)胞復(fù)蘇后置于培養(yǎng)皿,在DMEM培養(yǎng)液(體積分?jǐn)?shù)為1%青鏈霉素,8%牛血清)中培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)。待細(xì)胞增殖為培養(yǎng)面積的60%-70%時(shí)制備單細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)瓶或細(xì)胞孔板繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)改為去血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化,最后在相應(yīng)藥物干預(yù)24 h后收集細(xì)胞檢測(cè)。干預(yù)藥物的濃度依據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)試藥物的細(xì)胞毒性及參考文獻(xiàn)確定[3]。

    1.4 實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組(Cont):僅采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);醛固酮組(Ald):DMEM培養(yǎng)基加醛固酮(終濃度1 μmol·L-1);依普利酮干預(yù)組(EPL):DMEM培養(yǎng)基加醛固酮(終濃度1 μmol·L-1)和依普利酮(10 μmol·L-1);補(bǔ)氣活血解毒方干預(yù)組(TCM):DMEM培養(yǎng)基加醛固酮(終濃度1 μmol·L-1)和體積分?jǐn)?shù)10%中藥血清。

    1.5 指標(biāo)檢測(cè)

    1.5.1TUNEL檢測(cè)細(xì)胞死亡 4%多聚甲醛固定細(xì)胞后,滴加Triton-X 100冰浴2 min進(jìn)行細(xì)胞破膜;滴加TUNEL試劑孵育1 h(37 ℃、避光);碘化丙啶復(fù)染細(xì)胞核,封片后使用全自動(dòng)活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察熒光(Ex:450-500 nm;Em:520-560 nm)。免疫熒光半定量分析:隨機(jī)選取每組細(xì)胞標(biāo)本TUNEL熒光圖片3張,計(jì)算每張圖片高倍鏡視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量,取陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量平均值作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

    1.5.2蛋白免疫印跡檢測(cè)SGK-1、NF-кB(p65)、IL-1β、caspase-1和NLRP3蛋白表達(dá)情況 胰酶消化細(xì)胞后PBS洗滌、離心,留取細(xì)胞沉淀,加入含有PMSF的細(xì)胞裂解液,冰浴30 min,震蕩吹打促進(jìn)裂解,離心留取含蛋白上清液,加入上樣緩沖液備用;制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠,電泳分離蛋白;使用半干轉(zhuǎn)膜儀使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到孔徑為0.22 μm的醋酸纖維素(PVDF)膜上;PVDF膜放入5%脫脂牛奶中封閉2 h后孵育不同一抗和內(nèi)參抗體GAPDH(稀釋比例為1 ∶200-1 ∶2 000),4 ℃過夜;TBST清洗后滴加熒光標(biāo)記二抗(IR 680或IR 780)避光孵育1 h;TBST和TBS清洗后使用近紅外激光掃描成像儀觀察拍照,ImageJ軟件進(jìn)行蛋白定量。

    1.5.3免疫熒光方法檢測(cè)HK2細(xì)胞的NR3C2、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)情況 PBS洗滌細(xì)胞后4%多聚甲醛固定,Triton-X 100孵育20 min破膜,滴加山羊血清孵育30 min,分別滴加第一抗體(稀釋比例為1 ∶50-1 ∶200),4 ℃過夜;PBS溶液洗滌后室溫孵育熒光二抗(1 ∶200)1 h;DAPI復(fù)染、封片,采用活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察。免疫熒光半定量分析同“1.5.1”。

    2 結(jié)果

    2.1 TUNEL染色檢測(cè)HK2細(xì)胞死亡TUNEL陽(yáng)性標(biāo)記為綠色熒光細(xì)胞核,代表DNA斷裂的死亡細(xì)胞。Ald組與Cont組比較,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),EPL和TCM組陽(yáng)性細(xì)胞比Ald組明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見Fig 1。

    Fig 1 DNA damage evaluated by TUNEL **P<0.01 vs Cont,##P<0.01 vs Ald.

    2.2 SGK-1、NF-кB(p65)和NR3C2蛋白表達(dá)情況免疫熒光顯示NR3C2表達(dá):NR3C2被標(biāo)記為綠色熒光,NR3C2活化后由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核。與對(duì)照組比較,醛固酮刺激后NR3C2的細(xì)胞核表達(dá)數(shù)量增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與醛固酮組相比,依普利酮或補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清干預(yù)后NR3C2的細(xì)胞核表達(dá)數(shù)量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見Fig 2。Western blot檢測(cè)顯示SGK-1、NF-кB(p65)表達(dá):與Cont組比較,Ald組SGK-1、NF-кB(p65)蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(SGK-1:P<0.01;NF-кB:P<0.05);EPL組、TCM組與Ald組比較,SGK-1、NF-кB(p65)蛋白表達(dá)變?nèi)?見Fig 3。以上結(jié)果表明依普利酮或補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清抑制了HK2細(xì)胞MR的活化。

    Fig 2 Protein expression of NR3C2 in HK2 cells by **P<0.01 vs Cont,##P<0.01 vs Ald

    2.3 免疫熒光及Western blot檢測(cè)HK2細(xì)胞NLRP3、caspase-1和IL-1β表達(dá)免疫熒光顯示:NLRP3、caspase-1和IL-1β均呈綠色熒光表達(dá)于胞質(zhì)。Ald組與Cont組比較,三種蛋白表達(dá)增加,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;依普利酮或補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清干預(yù)后比Ald組表達(dá)減低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot檢測(cè):以上三種蛋白定量結(jié)果與免疫熒光結(jié)果具有一致性。與Cont比較,Ald組三種蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(NLRP3、caspase-1:P<0.01;IL-1β:P<0.05);與Ald組比較,EPL組和TCM組中三種蛋白表達(dá)明顯減低(NLRP3、caspase-1:P<0.01;IL-1β:P<0.05),見Fig 4。以上結(jié)果說明依普利酮或補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清對(duì)于醛固酮誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞焦亡具有抑制作用。

    Fig 3 Protein expression of SGK-1 and NF-κB in HK2 cells by Western *P<0.05,**P<0.01 vs Cont,#P<0.05,##P<0.01 vs Ald.

    Fig 4 Protein expression of NLRP3,caspase-1 and IL-1β in HK2 cells by Western blot or immunofluorescence *P<0.05,**P<0.01 vs Cont;#P<0.05,##P<0.01 vs Ald.

    3 討論

    焦亡屬于基因可調(diào)控的細(xì)胞死亡方式之一,與凋亡最大不同在于產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥損傷。故近年來(lái)焦亡在各器官病理?yè)p傷中頗受重視。有報(bào)道稱腎臟中巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞可通過NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)焦亡,而固有細(xì)胞一般則不發(fā)生焦亡,于艷等[4]研究發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞在高糖誘導(dǎo)下也可出現(xiàn)焦亡。炎癥損傷貫穿梗阻性腎病始終,而焦亡能引起劇烈炎癥反應(yīng),所以由梗阻因素備受累及的腎小管上皮細(xì)胞是否發(fā)生焦亡,進(jìn)而促進(jìn)梗阻性腎病的發(fā)生、發(fā)展值得關(guān)注。焦亡檢測(cè)需要關(guān)注兩方面:首先,TUNEL檢測(cè)DNA損傷以證明細(xì)胞死亡,但不能分辨此種死亡屬于焦亡還是凋亡;其次,檢測(cè)焦亡依賴的信號(hào)通路,以鑒別凋亡。NLRP3炎癥小體在CKD中關(guān)注度最高,也是觸發(fā)焦亡的炎癥體之一。NF-κB與相應(yīng)基因結(jié)合后促進(jìn)NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β等分子轉(zhuǎn)錄、翻譯。隨后,當(dāng)NLRP3蛋白感知到體內(nèi)存在損傷或病原相關(guān)分子模式時(shí)(DAMP、PAMP),迅速與接頭蛋白(ASC)和pro-caspase-1組裝,形成激活的NLRP3炎癥體。接下來(lái)NLRP3炎癥體級(jí)聯(lián)水解pro-caspase-1和pro-IL-1β[5]。NLRP3/caspase-1/IL-1β為檢測(cè)焦亡的經(jīng)典信號(hào)通路。近幾年研究發(fā)現(xiàn)Gasdermin家族中GSDMD蛋白被caspase激活后參與焦亡細(xì)胞膜孔的形成,炎癥因子可通過細(xì)胞膜孔溢出誘發(fā)炎癥反應(yīng)[6]。此實(shí)驗(yàn)通過TUNEL和NLRP3/caspase-1/IL-1β信號(hào)通路聯(lián)合檢測(cè)發(fā)現(xiàn)醛固酮誘導(dǎo)的HK2出現(xiàn)細(xì)胞焦亡。加之前期實(shí)驗(yàn)觀察到腎小球系膜細(xì)胞同樣出現(xiàn)了焦亡[7],故推測(cè)醛固酮可以誘導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞出現(xiàn)焦亡,給腎臟帶來(lái)炎癥損傷。

    醛固酮及其鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocoricoid receptor,MR)誘導(dǎo)的炎癥損傷,參與梗阻性腎病的發(fā)生、發(fā)展。據(jù)報(bào)道高濃度血漿醛固酮可造成腎功能下降、蛋白尿,在UUO模型大鼠可導(dǎo)致腎小球硬化、足細(xì)胞損傷、腎組織中巨噬細(xì)胞增多,NLRP3、caspase-1、IL-18等炎癥因子高表達(dá)[8],而鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑(MRB)可抑制腎組織炎性損傷。MR分布廣泛,除腎小管外還分布于心血管內(nèi)皮細(xì)胞等多個(gè)部位,是醛固酮誘導(dǎo)炎癥損傷的關(guān)鍵受體。MR屬于胞質(zhì)受體,當(dāng)與醛固酮結(jié)合后被激活進(jìn)入細(xì)胞核,觸發(fā)某些蛋白的基因轉(zhuǎn)錄[9]。SGK-1/NF-кB是醛固酮/MR下游的重要信號(hào)通路,MR活化促進(jìn)SGK-1、NF-кB蛋白高表達(dá),從而介導(dǎo)多種炎癥分子產(chǎn)生,如NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β等[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中TUNEL、NR3C2、SGK-1、NF-кB及焦亡相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果表明:高選擇性的MRB─依普利酮對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞焦亡起到了明顯抑制作用,結(jié)合之前研究發(fā)現(xiàn)MRB對(duì)于醛固酮介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷及系膜細(xì)胞焦亡的抑制作用[12],可證明MRB是抑制醛固酮/MR誘導(dǎo)的腎臟固有細(xì)胞損傷的良好選擇。

    梗阻性腎病如早期無(wú)明顯臨床癥狀,加之腎臟本身代償功能強(qiáng)大,早期發(fā)現(xiàn)困難。部分病人即使早期解除梗阻,腎臟損傷仍會(huì)持續(xù)進(jìn)展甚至發(fā)展為腎衰竭[13]。中醫(yī)治療慢性腎病具有一定優(yōu)勢(shì)。慢性腎病以腎間質(zhì)纖維化為特征,可歸于中醫(yī)的“關(guān)格”、“水腫”等病癥范疇,其基本病機(jī)為脾腎虧虛、毒瘀互結(jié)、腎絡(luò)瘀阻。虛為此病之本,以脾腎為主。脾虛無(wú)以運(yùn)化水濕、化生氣血,腎虛分清泌濁功能失常,致氣血不足、水濕內(nèi)停,體內(nèi)病理產(chǎn)物郁積日久化毒,氣虛、水停、毒邪均可致瘀,阻于腎絡(luò)[14]。梗阻性腎病時(shí)腎臟血流瘀滯,多種炎癥因子浸潤(rùn),日久腎間質(zhì)膠原沉積及纖維化,故補(bǔ)益脾腎、活血通絡(luò)、化瘀解毒為其基本治法[15]。此實(shí)驗(yàn)以上述治法為指導(dǎo)確立“補(bǔ)氣活血解毒方”,方藥組成有黃芪、赤芍、地龍、醋鱉甲、黃芩、金銀花,諸藥配伍具有補(bǔ)氣、活血化瘀、解毒通絡(luò)之功效。臨床應(yīng)用顯示此方有助于減輕尿蛋白、改善腎臟功能,但其分子蛋白水平的作用機(jī)制需要多方面研究。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)活血解毒中藥可以下調(diào)8-OhdG 表達(dá)抑制梗阻性腎病大鼠細(xì)胞凋亡[16],本次實(shí)驗(yàn)顯示補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清減輕醛固酮誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡,其作用機(jī)制與抑制NR3C2有關(guān)。

    綜上,該實(shí)驗(yàn)從醛固酮誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞焦亡角度探討了梗阻性腎病的發(fā)病機(jī)制,為補(bǔ)氣活血解毒方通過減輕腎臟炎性損傷和腎臟固有細(xì)胞損失,治療梗阻性腎病提供了實(shí)驗(yàn)支持。

    (致謝:衷心感謝河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供科研平臺(tái)!)

    十八禁网站免费在线| 午夜免费激情av| 操美女的视频在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久香蕉精品热| 国产xxxxx性猛交| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美日韩视频精品一区| 欧美最黄视频在线播放免费 | 自线自在国产av| 88av欧美| 日韩大码丰满熟妇| 级片在线观看| 亚洲三区欧美一区| 91精品三级在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久香蕉精品热| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品国产高清国产av| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产伦人伦偷精品视频| 校园春色视频在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 1024香蕉在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 91老司机精品| 日韩免费av在线播放| 十八禁网站免费在线| 久久九九热精品免费| 在线播放国产精品三级| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 高清毛片免费观看视频网站 | 村上凉子中文字幕在线| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产亚洲精品一区二区www| www.自偷自拍.com| 亚洲人成77777在线视频| 免费在线观看黄色视频的| xxxhd国产人妻xxx| 波多野结衣高清无吗| 国产三级黄色录像| 国产国语露脸激情在线看| 国产99久久九九免费精品| 久久婷婷成人综合色麻豆| 免费在线观看完整版高清| 国产欧美日韩综合在线一区二区| xxx96com| 女同久久另类99精品国产91| 国产一卡二卡三卡精品| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲精品国产色婷婷电影| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| avwww免费| 夜夜爽天天搞| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久精品人人爽人人爽视色| 首页视频小说图片口味搜索| 老司机深夜福利视频在线观看| 男女午夜视频在线观看| www.999成人在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲九九香蕉| 18禁美女被吸乳视频| 中亚洲国语对白在线视频| a在线观看视频网站| 中国美女看黄片| 亚洲精华国产精华精| 中文字幕人妻熟女乱码| 美女 人体艺术 gogo| 国产精品久久电影中文字幕| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产成+人综合+亚洲专区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 999久久久精品免费观看国产| 日韩免费av在线播放| 午夜福利一区二区在线看| 日韩人妻精品一区2区三区| 成人18禁在线播放| 妹子高潮喷水视频| 久久久久久大精品| 国产单亲对白刺激| 老司机亚洲免费影院| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 高清黄色对白视频在线免费看| 一级片'在线观看视频| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲三区欧美一区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产成人av教育| 久久久久久久久中文| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产97色在线日韩免费| 午夜激情av网站| 少妇被粗大的猛进出69影院| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲色图综合在线观看| 在线视频色国产色| 男人的好看免费观看在线视频 | 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品九九99| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 麻豆一二三区av精品| 99久久人妻综合| 香蕉丝袜av| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产欧美日韩一区二区三| 两性夫妻黄色片| xxxhd国产人妻xxx| 国产在线观看jvid| 国产精品成人在线| 亚洲av成人一区二区三| 日本 av在线| a在线观看视频网站| 免费观看精品视频网站| 亚洲欧美日韩无卡精品| 一区二区三区精品91| 日韩大尺度精品在线看网址 | www.999成人在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 中文字幕色久视频| 亚洲情色 制服丝袜| 成年版毛片免费区| 亚洲自拍偷在线| 天天添夜夜摸| av片东京热男人的天堂| 亚洲国产欧美网| 亚洲专区国产一区二区| 国产一区在线观看成人免费| 国产成人精品在线电影| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 午夜成年电影在线免费观看| 午夜日韩欧美国产| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 天堂动漫精品| 美女高潮到喷水免费观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 一区二区三区精品91| 丰满迷人的少妇在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 9热在线视频观看99| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 51午夜福利影视在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 久久久久国产一级毛片高清牌| 日韩欧美在线二视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产一区在线观看成人免费| 丰满的人妻完整版| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 9热在线视频观看99| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 99国产精品一区二区三区| 欧美成人午夜精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 在线看a的网站| 最新美女视频免费是黄的| 色哟哟哟哟哟哟| 黑丝袜美女国产一区| 一级片'在线观看视频| 亚洲精品在线美女| 一夜夜www| 两个人看的免费小视频| 天天影视国产精品| 久久香蕉激情| 亚洲专区国产一区二区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产成人av激情在线播放| 国产精品影院久久| 国产精品久久视频播放| 欧美乱色亚洲激情| 国产一区二区在线av高清观看| 在线av久久热| 国产一区二区三区视频了| 久久中文字幕一级| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲自拍偷在线| 日韩大码丰满熟妇| 黑人操中国人逼视频| 国产高清激情床上av| 波多野结衣一区麻豆| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲,欧美精品.| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产亚洲av高清不卡| 国产精品爽爽va在线观看网站 | av有码第一页| 搡老乐熟女国产| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 免费看十八禁软件| 欧美性长视频在线观看| 深夜精品福利| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 免费看a级黄色片| 1024视频免费在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品二区激情视频| 国产精品久久电影中文字幕| 久久人人精品亚洲av| 又大又爽又粗| 美女国产高潮福利片在线看| 成人免费观看视频高清| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 村上凉子中文字幕在线| 视频区图区小说| 欧美日韩精品网址| 男女床上黄色一级片免费看| 久久久国产一区二区| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久久久国内视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产成人精品在线电影| 免费在线观看日本一区| 日本 av在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲av电影在线进入| 免费av中文字幕在线| 亚洲 国产 在线| 午夜福利在线观看吧| 色综合婷婷激情| 国产精品国产av在线观看| x7x7x7水蜜桃| 午夜视频精品福利| 超色免费av| 高清欧美精品videossex| 久久精品影院6| 亚洲精品国产一区二区精华液| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 日韩大码丰满熟妇| 欧美日韩av久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 久久久国产精品麻豆| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产野战对白在线观看| 男人操女人黄网站| 午夜两性在线视频| cao死你这个sao货| 国产1区2区3区精品| 精品人妻在线不人妻| 99久久精品国产亚洲精品| 激情视频va一区二区三区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 精品人妻在线不人妻| 久99久视频精品免费| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 天天添夜夜摸| 中文字幕高清在线视频| 免费高清视频大片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产又爽黄色视频| 国产区一区二久久| 少妇粗大呻吟视频| 国产av又大| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 淫秽高清视频在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 美女午夜性视频免费| 女警被强在线播放| 热re99久久精品国产66热6| 人成视频在线观看免费观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日韩视频一区二区在线观看| 国产1区2区3区精品| 岛国视频午夜一区免费看| 老司机福利观看| 韩国精品一区二区三区| 欧美日韩一级在线毛片| 超碰97精品在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 色播在线永久视频| 女性生殖器流出的白浆| 久久 成人 亚洲| 精品一区二区三卡| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产精华一区二区三区| 校园春色视频在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品av久久久久免费| 在线观看免费午夜福利视频| 麻豆一二三区av精品| 午夜福利欧美成人| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看 | 亚洲人成电影免费在线| 又黄又粗又硬又大视频| 男男h啪啪无遮挡| 成人av一区二区三区在线看| 一二三四社区在线视频社区8| 一区在线观看完整版| 欧美乱色亚洲激情| 国产高清激情床上av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 三级毛片av免费| 色播在线永久视频| 亚洲伊人色综图| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产欧美日韩精品亚洲av| 人人妻人人澡人人看| 在线观看舔阴道视频| 在线观看一区二区三区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲欧美激情综合另类| 美国免费a级毛片| 久久久久亚洲av毛片大全| 五月开心婷婷网| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 乱人伦中国视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 人妻久久中文字幕网| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 午夜福利欧美成人| 国产成人影院久久av| 高潮久久久久久久久久久不卡| 水蜜桃什么品种好| 国产一区二区在线av高清观看| 国产成人欧美在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 午夜福利欧美成人| 69av精品久久久久久| 中出人妻视频一区二区| 国产精品1区2区在线观看.| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 一进一出抽搐动态| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日本精品一区二区三区蜜桃| 99久久国产精品久久久| 色综合婷婷激情| 欧美在线黄色| 欧美成人性av电影在线观看| 精品日产1卡2卡| 国产精品一区二区精品视频观看| 免费av毛片视频| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲国产欧美网| 18禁国产床啪视频网站| 精品第一国产精品| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 午夜福利,免费看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 午夜福利一区二区在线看| 久久伊人香网站| 两个人免费观看高清视频| 夫妻午夜视频| 黄片小视频在线播放| 高清在线国产一区| 亚洲男人天堂网一区| 久久人妻av系列| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 在线免费观看的www视频| 高清在线国产一区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 免费在线观看日本一区| 久久精品人人爽人人爽视色| 午夜福利影视在线免费观看| 国产一区二区在线av高清观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 一级a爱视频在线免费观看| 超碰97精品在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲国产精品sss在线观看 | 制服诱惑二区| 手机成人av网站| 99国产综合亚洲精品| 亚洲精品av麻豆狂野| 另类亚洲欧美激情| 99久久综合精品五月天人人| 波多野结衣高清无吗| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 高清黄色对白视频在线免费看| 午夜福利影视在线免费观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 超碰97精品在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲专区字幕在线| 十八禁网站免费在线| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 美女大奶头视频| 亚洲人成电影免费在线| 超碰97精品在线观看| www.www免费av| 不卡av一区二区三区| 成人免费观看视频高清| xxxhd国产人妻xxx| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 免费不卡黄色视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产精华一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲黑人精品在线| 亚洲中文日韩欧美视频| www.999成人在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| av欧美777| av网站在线播放免费| 久久久国产欧美日韩av| x7x7x7水蜜桃| 韩国精品一区二区三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 97人妻天天添夜夜摸| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 青草久久国产| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 日韩免费高清中文字幕av| 视频区欧美日本亚洲| 午夜免费鲁丝| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久热在线av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品久久久久久电影网| 丰满饥渴人妻一区二区三| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 黄频高清免费视频| 国产成人免费无遮挡视频| 男女床上黄色一级片免费看| 日本三级黄在线观看| 亚洲自拍偷在线| 99在线视频只有这里精品首页| 成人免费观看视频高清| 桃红色精品国产亚洲av| 国产精品1区2区在线观看.| 18禁美女被吸乳视频| www.熟女人妻精品国产| 波多野结衣高清无吗| 日韩大码丰满熟妇| 免费观看精品视频网站| 99热只有精品国产| 国产区一区二久久| 老司机亚洲免费影院| 国产高清激情床上av| 1024视频免费在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频 | 亚洲片人在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| av中文乱码字幕在线| 国产区一区二久久| 99国产极品粉嫩在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩视频一区二区在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 老汉色av国产亚洲站长工具| 夫妻午夜视频| av中文乱码字幕在线| 日本vs欧美在线观看视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 在线av久久热| 美女午夜性视频免费| 黄色片一级片一级黄色片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 女性生殖器流出的白浆| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品二区激情视频| 9色porny在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 夜夜躁狠狠躁天天躁| a级片在线免费高清观看视频| 婷婷丁香在线五月| 亚洲全国av大片| av福利片在线| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 操出白浆在线播放| 九色亚洲精品在线播放| 天堂中文最新版在线下载| 国产1区2区3区精品| 欧美日本中文国产一区发布| 久久久国产成人精品二区 | 神马国产精品三级电影在线观看 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 免费av毛片视频| 久久久国产成人免费| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲片人在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 在线观看一区二区三区激情| 18美女黄网站色大片免费观看| 看免费av毛片| 国产av在哪里看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲精华国产精华精| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲精品一区av在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 丰满迷人的少妇在线观看| 波多野结衣高清无吗| 老鸭窝网址在线观看| 国产激情欧美一区二区| 国产又爽黄色视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 麻豆国产av国片精品| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费在线观看完整版高清| 精品国产一区二区久久| 国产乱人伦免费视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| www.精华液| 免费在线观看完整版高清| 91大片在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久国产亚洲av麻豆专区| av视频免费观看在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 日本 av在线| 操出白浆在线播放| 9热在线视频观看99| 色综合站精品国产| 免费av中文字幕在线| 韩国精品一区二区三区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产1区2区3区精品| 国产真人三级小视频在线观看| 久久香蕉激情| 欧美精品亚洲一区二区| 午夜福利免费观看在线| 黄色丝袜av网址大全| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲人成电影观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲av成人av| 午夜久久久在线观看| 波多野结衣高清无吗| 久久久久九九精品影院| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 黄色视频不卡| 天堂影院成人在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 欧美一级毛片孕妇| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲男人的天堂狠狠| 免费看a级黄色片| 一区在线观看完整版| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 99精国产麻豆久久婷婷| 日韩大尺度精品在线看网址 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 欧美日韩视频精品一区| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜福利免费观看在线| 久久香蕉激情| 亚洲欧美激情在线| 人成视频在线观看免费观看| 91在线观看av| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久影院123| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产一卡二卡三卡精品| 精品久久久久久成人av| 精品久久久久久,| 国产麻豆69| 老司机靠b影院| 丝袜人妻中文字幕| 色老头精品视频在线观看| 久久中文字幕一级| 国产1区2区3区精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 大码成人一级视频| 国产男靠女视频免费网站| 日韩有码中文字幕| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 男女下面插进去视频免费观看| 精品久久久精品久久久| 国产一区二区在线av高清观看| 国产成人av激情在线播放| 国产精品免费一区二区三区在线| 免费av中文字幕在线| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 中文字幕色久视频| 91成人精品电影| 国产区一区二久久|