吉祥草甾體皂苷RCE-4誘導(dǎo)人宮頸癌Ca Ski細(xì)胞凋亡與自噬相互作用的分子機(jī)制

游方芳，程 凡，鄒 坤，張 晶，陳劍鋒

(三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002)

宮頸癌是一種常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，化療是主要的治療手段之一，但耐藥性和嚴(yán)重的毒副作用往往導(dǎo)致治療預(yù)期不佳。天然來(lái)源的藥物因其多靶點(diǎn)、毒性低的優(yōu)勢(shì)一直備受關(guān)注。RCE-4(結(jié)構(gòu)見(jiàn)Fig 1)是本實(shí)驗(yàn)室從百合科鈴蘭族植物吉祥草中分離得到的一個(gè)螺甾烷型甾體皂苷，實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，RCE-4對(duì)宮頸癌Ca Ski細(xì)胞具有較好的選擇性細(xì)胞毒性，能誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡和自噬[1-3]，對(duì)荷瘤裸小鼠的最高抑瘤率可達(dá)到69.1%，且對(duì)正常組織的毒性極低[4]，顯示了其治療宮頸癌的巨大潛力。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了RCE-4的一些不足之處，比如用藥劑量較大、抑瘤率還有待提高以及其抗宮頸癌作用機(jī)制研究還不夠深入等。

Fig 1 The chemical structure of RCE-4

化療藥物的最終目標(biāo)是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，凋亡和自噬作為細(xì)胞程序性死亡的主要方式，盡管其特征和機(jī)制不同，但大量研究已證實(shí)，二者并不是孤立存在的，一些關(guān)鍵的調(diào)控因子在雙方的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中頻繁地出現(xiàn)，說(shuō)明在兩者之間存在著復(fù)雜的相互作用。現(xiàn)有的研究表明兩者之間可能存在著如下幾種可能：(1)促進(jìn)關(guān)系。當(dāng)?shù)蛲龊妥允善渲幸环N被激活或者抑制時(shí)，另外一種也相應(yīng)被激活或抑制。宋峰等[5]發(fā)現(xiàn),自噬激動(dòng)劑雷帕霉素預(yù)處理細(xì)胞上調(diào)自噬可進(jìn)一步增加IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而使用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理抑制細(xì)胞自噬后則可逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導(dǎo)的INS-1胰島細(xì)胞凋亡。(2)拮抗關(guān)系。兩者之間是對(duì)抗的關(guān)系，自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞起保護(hù)作用，對(duì)腫瘤的發(fā)展起促進(jìn)作用。Zhuang等[6]發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rh2誘導(dǎo)的自噬可以保護(hù)人白血病U937和K562細(xì)胞免于凋亡，3-MA處理能增強(qiáng)其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。(3)合作關(guān)系。自噬和凋亡協(xié)作引起細(xì)胞死亡，兩者可能同時(shí)發(fā)生；或者當(dāng)其中一種受到阻礙或抑制時(shí)，另一程序則被激活并繼續(xù)完成細(xì)胞死亡進(jìn)程[7]。雖然凋亡和自噬相互作用的分子機(jī)制尚未完全闡明，但探討化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬之間的關(guān)系并進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控對(duì)腫瘤治療和抗腫瘤藥物研發(fā)具有非常重要的意義，已成為當(dāng)前引人注目的研究領(lǐng)域之一。

鑒于此，本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)不同抑制劑和siRNA質(zhì)粒的應(yīng)用，初步探討RCE-4誘導(dǎo)的Ca Ski細(xì)胞凋亡和自噬的相互作用，以期找到降低用藥劑量、提高其療效的途徑，為RCE-4將來(lái)的臨床應(yīng)用提供理論支撐。

(1β,3β,5β,25S)-spirostan-1,3-diol1-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranoside]

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人宮頸癌 Ca Ski細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供。

1.1.2藥物及試劑 RCE-4由本實(shí)驗(yàn)室從吉祥草中分離得到[8]；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)(M9281)、巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1，Baf A1)(HY-100558)和氯喹(chloroquine，CQ)(C6628)及凋亡抑制劑Z-VAD(OH)-FMK(Z-VAD-FMK)(HY-16658)均購(gòu)于中國(guó)Med Chem Express公司；基因沉默質(zhì)粒Bcl-2 siRNA(6441S)、Beclin 1 siRNA(6222S)一抗Beclin 1(3495S)、phospho (p)-Beclin 1(84966S)、LC3 Ⅰ/Ⅱ(4108S)、ATG 4B(13507S)、ATG 14(96752S)、Bax(5023T)、Bcl-2(4223S)、cleaved caspase-3(9664T)、cleaved caspase-7(8438T)、cleaved caspase-9(9505T)及β-actin(8457S)購(gòu)于美國(guó)CST公司；二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(GB23301，武漢賽維爾生物科技有限公司)；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(31800-022，美國(guó)Gibco公司)；四季青胎牛血清(11011-8611，浙江天杭生物科技股份有限公司)；青霉素-鏈霉素混合液(SV30010，北京索萊寶科技有限公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)(BS0328，美國(guó)Amersco公司)；ECL超敏發(fā)光液(BL520A，北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；GFP-CERTIED?細(xì)胞凋亡/壞死檢測(cè)試劑盒(ENZ-51002-100，美國(guó)ENZO公司)；AO/EB雙熒光染色試劑盒(DA0039，雷根生物公司)。

1.1.3儀器 滅菌器(型號(hào)：HVE-50)購(gòu)于日本Hirayama公司；CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)：9040-0112)購(gòu)于德國(guó)Binder公司；熒光顯微鏡(型號(hào)：XD30A-RFL)購(gòu)于寧波舜宇儀器有限公司；高速離心機(jī)(型號(hào)：FC5515R)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)：INFINITE 200 PRO)購(gòu)于瑞士Tecan公司；流式細(xì)胞儀(型號(hào)：FACS Verse)購(gòu)于美國(guó) BD 公司；低速離心機(jī)(型號(hào)：SC-2542)購(gòu)于安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；超純水儀(型號(hào)：Smart-S15UVF)購(gòu)于上海和泰儀器有限公司Smart-S15UVF;電泳儀(型號(hào)：EPA300)購(gòu)于北京基昂生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 Ca Ski 細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1% 青霉素-鏈霉素混合液)置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，待Ca Ski細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 以0.5、1、2、4、6、8、16、32 μmol·L-1RCE-4單用及分別與作用濃度為8 mmol·L-1的3-MA、0.4 μmol·L-1的Baf A1、30 μmol·L-1的CQ或30 μmol·L-1的Z-VAD-FMK聯(lián)合使用，并設(shè)置對(duì)照組，每組設(shè)定5個(gè)復(fù)孔，檢測(cè)對(duì)Ca Ski細(xì)胞的增殖抑制效果。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Ca Ski細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度并以1×107個(gè)·L-1的細(xì)胞濃度種96孔板，每孔加入100 μL，四周用PBS液封，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育，待細(xì)胞貼壁后：分別設(shè)置空白對(duì)照組；3-MA組；Baf A1組；CQ組；Z-VAD-FMK組；RCE-4組；RCE-4+3-MA組；RCE-4+Baf A1 組；RCE-4+CQ組；RCE-4+ Z-VAD-FMK組；RCE-4+Beclin 1 siRNA組；RCE-4+Bcl-2 siRNA組。反應(yīng)48 h后每孔加入5 g·L-1MTT工作液20 μL，避光孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO，室溫震蕩3 min。在酶標(biāo)儀上492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值，計(jì)算對(duì)細(xì)胞的抑制率。細(xì)胞抑制率(%)=1-(加藥孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(對(duì)照孔吸光度值-空白孔吸光度值)×100%，每組重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3AO/EB染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ca Ski細(xì)胞以2×108個(gè)·L-1的單細(xì)胞懸液1 mL接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別設(shè)置空白對(duì)照組；RCE-4組；Z-VAD-FMK組；RCE-4+Z-VAD-FMK組；RCE-4+Beclin 1 siRNA組。于37°C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育12 h后，收集細(xì)胞，用PBS沖洗2次，AO Stain Buffer 1×清洗細(xì)胞1次，加入適量的AO Stain Buffer 1×重懸細(xì)胞，按照細(xì)胞懸液 ∶AO Stain=19 ∶1的比例混合，并加入適量AO、EB染色液，輕輕混勻，室溫避光染色15 min，在熒光顯微鏡(激發(fā)濾光片波長(zhǎng)488 nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)515 nm)下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，計(jì)數(shù)并拍照。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞瓶傳代培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%左右時(shí)，分別設(shè)置空白對(duì)照組；3-MA組；Baf A1組；CQ組；Z-VAD-FMK組；RCE-4組；RCE-4+3-MA組；RCE-4+Baf A1 組；RCE-4+CQ組；RCE-4+ Z-VAD-FMK組；RCE-4+Beclin 1 siRNA組。反應(yīng)24 h后將培養(yǎng)基吸入離心管中，向培養(yǎng)瓶中加3-5 mL PBS清洗兩次，加3-5 mL不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞。收集細(xì)胞，離心，去上清，PBS清洗兩次(3 000 r·min-1，3 min)，晾干，按照Buffer ∶水=1 ∶9配制細(xì)胞混懸液，按照懸液 ∶染色液=100 ∶1的比例加入適量凋亡、壞死染色試劑，輕輕混勻，室溫避光染色15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5Western blot檢測(cè)自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ca Ski細(xì)胞用RCE-4單用或與3-MA、Baf A1、CQ、Z-VAD-FMK、Beclin 1 siRNA、Bcl-2 siRNA聯(lián)合應(yīng)用處理后，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h后，收集細(xì)胞，提取Ca Ski細(xì)胞蛋白，蛋白定量后，加樣品緩沖液煮沸5 min，各取20 μL加樣。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶封閉2 h后，用TBST洗滌3次×10 min，一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌3次×10 min，加二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h。再用ECL試劑可視化凝膠條帶，并使用發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5200)記錄結(jié)果，使用ImageJ軟件計(jì)算灰度值。

2 結(jié)果

2.1 RCE-4誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬對(duì)凋亡的影響采用不同的自噬抑制劑(3-MA、CQ和Baf A1)和RCE-4共處理Ca Ski細(xì)胞，通過(guò)對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的評(píng)估，探索RCE-4誘導(dǎo)的自噬的作用以及和凋亡的關(guān)系。

2.1.1不同自噬抑制劑對(duì)RCE-4所誘導(dǎo)的自噬流的影響 細(xì)胞自噬包括吞噬泡的形成、自噬小體的形成、自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體、自噬溶酶體的降解4個(gè)步驟[9]，自噬流是這些步驟在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)出現(xiàn)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，自噬流中的任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙自噬將無(wú)法順利進(jìn)行。3-MA可通過(guò)抑制class III PI3K而抑制自噬小體的形成，CQ可通過(guò)改變?nèi)苊阁w的pH從而阻止自噬小體與溶酶體的融合，Baf A1可阻止自噬溶酶體的降解[10]。

2.1.2RCE-4與自噬抑制劑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Ca Ski細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果如Fig 2所示，當(dāng)用不同的自噬抑制劑阻斷自噬流時(shí)，Ca Ski細(xì)胞對(duì)RCE-4的敏感性明顯增強(qiáng)，其中，Baf A1與RCE-4的協(xié)同效果最佳，使RCE-4對(duì)Ca Ski細(xì)胞的IC50由4.669 μmol·L-1減少到1.368 μmol·L-1(P<0.01)。

Fig 2 Proliferation of Ca Ski cells inhibited by RCE-4 combined with or without autophagy inhibitors n=3)##P<0.01 vs RCE-4

2.1.3RCE-4與自噬抑制劑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Ca Ski細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果如Fig 3所示，與單用RCE-4組相比，當(dāng)用不同的自噬抑制劑與RCE-4聯(lián)用時(shí)，細(xì)胞凋亡率明顯升高，其中，Baf A1與RCE-4的協(xié)同效果最佳，使RCE-4所誘導(dǎo)的Ca Ski細(xì)胞凋亡率由49.96% 增加到91.08%(P<0.01)。同時(shí)，如Fig 4A，B和C所示，與單用RCE-4組相比，聯(lián)用自噬抑制劑使凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的表達(dá)進(jìn)一步增加，Bcl-2的表達(dá)進(jìn)一步降低，表明當(dāng)RCE-4誘導(dǎo)的自噬被抑制后，其誘導(dǎo)的凋亡增強(qiáng)(P<0.01)。

2.2 RCE-4誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡對(duì)自噬的影響與上一個(gè)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)相似，我們擬采用凋亡抑制劑和RCE-4共處理Ca Ski細(xì)胞，通過(guò)對(duì)細(xì)胞增殖和自噬的評(píng)估，探索RCE-4誘導(dǎo)的凋亡的作用以及和自噬的關(guān)系。以前的研究已證實(shí)RCE-4能誘導(dǎo)Ca Ski細(xì)胞發(fā)生線(xiàn)粒體途徑的凋亡，因此，本實(shí)驗(yàn)選用Z-VAD-FMK來(lái)抑制凋亡。Z-VAD-FMK是一種細(xì)胞滲透性，不可逆的泛caspase抑制劑，能夠抑制caspase家族蛋白酶活性從而同時(shí)阻斷線(xiàn)粒體途徑和死亡受體途徑的凋亡。

2.2.1RCE-4與凋亡抑制劑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Ca Ski細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果如Fig 5所示，當(dāng)RCE-4與Z-VAD-FMK聯(lián)用時(shí)，與單用RCE-4組相比，細(xì)胞增殖差異無(wú)顯著性，凋亡抑制劑Z-VAD-FMK與RCE-4無(wú)協(xié)同效果。

2.2.2RCE-4與凋亡抑制劑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Ca Ski細(xì)胞自噬的影響 結(jié)果如Fig 6所示，當(dāng)RCE-4與Z-VAD-FMK聯(lián)用時(shí)，與單用RCE-4組相比，LC3II、Beclin 1、p-Beclin 1、ATG 4B、ATG 14的表達(dá)量降低，表明當(dāng)RCE-4誘導(dǎo)的凋亡被部分抑制時(shí)，其誘導(dǎo)的自噬也相應(yīng)被削弱(P<0.01)。

2.3 Beclin 1在RCE-4誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡自噬互反饋調(diào)控中的作用Beclin 1是自噬進(jìn)程的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，它可以與HMGB-1、ATG 14、Vps34、Vps15等自噬相關(guān)蛋白結(jié)合，形成不同的復(fù)合體，在不同階段參與自噬的進(jìn)程[11]。考慮到Beclin 1的重要性，我們用siRNA 質(zhì)粒將其沉默，以觀察Beclin 1對(duì)RCE-4所誘導(dǎo)的凋亡和自噬的影響。

2.3.1RCE-4與Beclin 1 siRNA聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Ca Ski細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果如Fig 7所示，當(dāng)應(yīng)用Beclin 1 siRNA處理后，Ca Ski細(xì)胞對(duì)RCE-4的敏感性明顯增強(qiáng)(P<0.01)，使RCE-4對(duì)Ca Ski細(xì)胞的IC50由4.669 μmol·L-1減少到1.538 μmol·L-1。

2.3.2RCE-4與Beclin 1 siRNA聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Ca Ski細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果如Fig 9所示，不管是單用Beclin 1 siRNA還是與RCE-4共處理Ca Ski 細(xì)胞，Beclin 1的表達(dá)均被明顯抑制，表明Beclin 1 siRNA發(fā)揮了作用。同時(shí)，與單用RCE-4組相比，Beclin 1siRNA與RCE-4共處理組中cleaved caspase-3/7/9和Bax的表達(dá)均明顯增加(P<0.01)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)則明顯降低(P<0.01)，表明抑制Beclin 1促進(jìn)了RCE-4誘導(dǎo)的Ca Ski細(xì)胞凋亡，Beclin 1在RCE-4誘導(dǎo)的凋亡和自噬互反饋調(diào)控中扮演了重要角色。

2.4 RCE-4與Bcl-2 siRNA 的聯(lián)合應(yīng)用Bcl-2因具有拮抗細(xì)胞凋亡的功能而被廣泛熟知，但現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2同時(shí)也是凋亡自噬互反饋調(diào)控的關(guān)鍵聯(lián)系蛋白之一[12]。因此，我們也重點(diǎn)考察了Bcl-2在RCE-4所誘導(dǎo)的凋亡自噬互反饋調(diào)控中的作用。

2.4.1RCE-4與Bcl-2 siRNA聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Ca Ski細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果如Fig 10所示，當(dāng)應(yīng)用Bcl-2 siRNA處理后，Ca Ski細(xì)胞對(duì)RCE-4的敏感性明顯增強(qiáng)(P<0.01)，使RCE-4對(duì)Ca Ski細(xì)胞的IC50由4.669 μmol·L-1減少到1.582 μmol·L-1，表明Bcl-2在RCE-4誘導(dǎo)的凋亡和自噬互反饋調(diào)控中扮演了重要角色。

Fig 4 Expression of apoptosis related proteins in Ca Ski cells treated with RCE-4 combined with or without autophagy inhibitors n=3)*P<0.05 vs control,**P<0.01 vs control,##P<0.01 vs RCE-4

2.4.2RCE-4與Bcl-2 siRNA聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Ca Ski細(xì)胞自噬的影響 結(jié)果如Fig 11所示，不管是單用Bcl-2 siRNA還是與RCE-4共處理Ca Ski 細(xì)胞，Bcl-2的表達(dá)均被明顯抑制，表明Bcl-2 siRNA發(fā)揮了作用。同時(shí)，與單用RCE-4組相比，Bcl-2 siRNA與RCE-4共處理組中Beclin 1、p-Beclin 1、LC3II、ATG 4B和ATG 14的表達(dá)均明顯增加(P<0.01)，表明抑制Bcl-2促進(jìn)了RCE-4誘導(dǎo)的Ca Ski細(xì)胞自噬。

Fig 5 Proliferation of Ca Ski cells inhibited by RCE-4 combined with or without apoptosis inhibitors n=3)

Fig 6 Expression of autophagy related proteins in Ca Ski cells treated with RCE-4 combined with or without apoptosis inhibitors n=3)**P<0.01 vs control,##P<0.01 vs RCE-4.

Fig 7 Proliferation of Ca Ski cells inhibited by RCE-4 combined with or without Beclin 1 siRNA n=3)##P<0.01 vs RCE-4.

Fig 8 Effect of RCE-4 combined with Beclin 1 siRNA on apoptosis of Ca Ski cells n=3)Scale:400×.**P<0.01 vs control,##P<0.01 vs RCE-4.

Fig 9 Expression of apoptosis-related proteins in Ca Ski cells treated with RCE-4 combined with or without Beclin 1 siRNA n=3)**P<0.01 vs control,##P<0.01 vs RCE-4.

Fig 10 Proliferation of Ca Ski cells inhibited by RCE-4 combined with or without Bcl-2 siRNA n=3)##P<0.01 vs RCE-4.

Fig 11 Expression of apoptosis-related proteins in Ca Ski cells treated with RCE-4 combined with or without Bcl-2 siRNA n=3)**P<0.01 vs control,#P<0.05 vs RCE-4,##P<0.01 vs RCE-4.

3 討論

本研究中，我們首次解析了凋亡和自噬在RCE-4所誘導(dǎo)的Ca Ski細(xì)胞程序性死亡中的作用。首先，應(yīng)用3種作用于自噬流不同階段的抑制劑與RCE-4共處理Ca Ski細(xì)胞后，Ca Ski細(xì)胞對(duì)RCE-4的敏感性和凋亡率均得到不同程度的增強(qiáng)，表明RCE-4所誘導(dǎo)的自噬可能是保護(hù)性的，對(duì)于Ca Ski細(xì)胞是一種存活機(jī)制。一般情況下，當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到外界刺激(如化療)后，誘發(fā)的自噬可以通過(guò)加速受損細(xì)胞器或蛋白聚集物的清除，使大分子物質(zhì)得以循環(huán)利用，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于死亡，這也是腫瘤細(xì)胞對(duì)抗化療，產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制之一[13-14]；在3種自噬抑制劑中，Baf A1對(duì)RCE-4的協(xié)同效果最好，這可能是由于Baf A1阻斷了自噬流的最后一道關(guān)卡—自噬溶酶體的降解，對(duì)自噬流的阻斷最為徹底，凋亡得到了最大程度的激活所致。需要指出的是，雖然誘導(dǎo)的自噬是保護(hù)性的，但這并不表明促進(jìn)自噬就能降低細(xì)胞死亡，自噬在腫瘤細(xì)胞中常常扮演“雙刃劍”的角色，過(guò)度激活的自噬很可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的自噬性死亡以及凋亡增加，細(xì)胞的死亡反而會(huì)進(jìn)一步增加[15-16]。

其次，我們應(yīng)用凋亡抑制劑Z-VAD-FMK與RCE-4共處理Ca Ski細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)蛲霰徊糠忠种茣r(shí)，自噬水平也相應(yīng)降低，表明RCE-4誘導(dǎo)的凋亡對(duì)觸發(fā)自噬起著重要作用。另外，相對(duì)于單用RCE-4組，凋亡抑制劑Z-VAD-FMK與RCE-4聯(lián)用時(shí)細(xì)胞死亡情況并沒(méi)有發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)變化，推測(cè)其原因可能是Z-VAD-FMK只是部分的抑制了凋亡。另外，聯(lián)用時(shí)其誘導(dǎo)的自噬也相應(yīng)的被削弱，其保護(hù)性作用降低，故綜合來(lái)看，細(xì)胞的程序性死亡進(jìn)程沒(méi)有受到太大的影響。

自噬起始因子Beclin l和抗凋亡蛋白Bcl-2在凋亡和自噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及相互作用中扮演了關(guān)鍵角色[11,17]。比如Beclin l可被Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax裂解成“C端片段”和“N端片段”而失去誘導(dǎo)自噬的能力，裂解的Beclin 1碎片可進(jìn)入線(xiàn)粒體內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[17]。Bcl-2可以通過(guò)BH3結(jié)構(gòu)域與Beclin1結(jié)合形成Bcl-2-Beclin 1復(fù)合體，該復(fù)合體被認(rèn)為是細(xì)胞程序性死亡進(jìn)程的“核心”和“總開(kāi)關(guān)”[18]。鑒于此，我們應(yīng)用siRNA來(lái)分別沉默其表達(dá)，探索其在RCE-4所誘導(dǎo)的凋亡和自噬互作中的作用。結(jié)果顯示，當(dāng)Beclin 1的表達(dá)被抑制之后，自噬流被阻斷，RCE-4誘導(dǎo)的凋亡率則顯著增強(qiáng)，表明Beclin 1在RCE-4誘導(dǎo)的凋亡中起著負(fù)調(diào)控作用，下調(diào)Beclin 1有利于凋亡的發(fā)生。而應(yīng)用Bcl-2 siRNA之后則明顯不同，抑制Bcl-2既明顯增強(qiáng)了自噬，也增強(qiáng)了RCE-4誘導(dǎo)的凋亡以及細(xì)胞死亡。推測(cè)其原因，可能是此時(shí)自噬處于過(guò)度活化的狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，從而導(dǎo)致RCE-4對(duì)Ca Ski細(xì)胞的抑制作用更為明顯。因此，Bcl-2在RCE-4誘導(dǎo)的自噬中也起著負(fù)調(diào)控作用，下調(diào)Bcl-2有助于凋亡和自噬的深度激活，從而增強(qiáng)Ca Ski細(xì)胞對(duì)RCE-4的敏感性。

綜上所述，本研究首次闡明了凋亡和自噬在RCE-4所誘導(dǎo)的Ca Ski細(xì)胞程序性死亡中的作用。在RCE-4誘導(dǎo)的Ca Ski細(xì)胞程序性死亡中，凋亡占據(jù)著主導(dǎo)地位，對(duì)觸發(fā)自噬起著重要作用，而自噬則起著保護(hù)細(xì)胞、拮抗凋亡的作用。自噬抑制劑Baf A1和RCE-4有最佳的協(xié)同作用，Beclin 1和Bcl-2在RCE-4誘導(dǎo)的Ca Ski細(xì)胞程序性死亡中起著關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用，可通過(guò)對(duì)其的抑制來(lái)增強(qiáng)Ca Ski細(xì)胞對(duì)RCE-4的敏感性，以降低RCE-4用藥劑量，提高其療效。

(致謝：本研究在三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，衷心感謝本研究的指導(dǎo)老師和各位參與者！)