砷及其代謝產(chǎn)物對A549 細(xì)胞cIAP1、cIAP2 和XIAP基因的影響

陳 倩，成會榮，黃 皓，楊 嬌，馮婉君，文衛(wèi)華*

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2. 云南省疾病預(yù)防控制中心，昆明 650022）

砷（As）是一種環(huán)境性污染物，主要存在于水體及食物鏈中。隨著工業(yè)、農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，砷主要通過開采和冶煉含砷礦物、半導(dǎo)體、除草劑等釋放到人類生活環(huán)境中，對全球約1.5 億人的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅〔1〕。流行病學(xué)調(diào)查顯示，長期砷暴露可導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，如皮膚癌、肺癌、膀胱癌和肝癌，以及認(rèn)知缺陷、心血管疾病、高血壓及糖尿病等〔2〕。流行病學(xué)將砷歸為危害人類健康的因素之一〔3〕。

許多研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡的失調(diào)和/ 或細(xì)胞的異常增殖在各種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用〔4〕。低劑量的亞砷酸鈉（NaAsO2）能激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（ERKs）信號通路，從而抑制p53 的激活，使人角質(zhì)細(xì)胞的凋亡受到抑制，從而發(fā)生癌變〔5〕。NaAsO2使肝細(xì)胞miR－155 表達水平增加，降低靶基因QKI 的水平，進而誘導(dǎo)細(xì)胞異常增殖，從而使肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化〔6〕。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展直接受到細(xì)胞內(nèi)部基因的影響，這些基因分為促凋亡基因（如：p53、Bax 等）和抗凋亡基因（如：Bcl－2、mcl－l 和IAPS 家族等）〔7〕。IAPS 是迄今唯一發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性caspase抑制劑家族，通過與caspase 結(jié)合，抑制其活性，阻止凋亡的發(fā)生、發(fā)展〔8〕。IAPS 家族中包含細(xì)胞凋亡抑制蛋白1（cellular IAP1，cIAP1）、細(xì)胞凋亡抑制蛋白2（cellular IAP2，cIAP2）和X 染色體連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked IAP，XIAP）等〔9〕。cIAP1 和cIAP2 通過直接與caspase－3 和caspase－7 結(jié)合，從而達到抑制二者的活性，最終達到抑制細(xì)胞凋亡的作用。XIAP 是IAPS 家族中最強抑制蛋白，直接抑制凋亡途徑的起始階段及持續(xù)階段〔10〕。

通常來說，促細(xì)胞凋亡因子和抗細(xì)胞凋亡因子之間的平衡是決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的關(guān)鍵〔11〕。當(dāng)細(xì)胞受到砷的刺激后，促細(xì)胞凋亡因子和抗細(xì)胞凋亡因子之間的這種平衡被打破，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，最后變成惡性細(xì)胞〔12〕。本研究探索了砷刺激作用 下，cIAP1、cIAP2 和XIAP 3 種 抗 凋 亡 基 因 的mRNA 表達情況，以此探索砷如何通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 CO2恒溫培養(yǎng)箱（Termo Forma 公司）；Fresco－17 型臺式高速低溫離心機（Termo Scientific 公司）；羅氏7900T 實時熒光定量PCR 儀；FastStart Universal SYBR Green Master 熒光定量試劑盒（上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）；Western bolt 裝置（Media Cybernetics）；人肺癌細(xì)胞（A549 細(xì)胞，中國科學(xué)院細(xì)胞庫）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（Corning公司）；胎牛血清（FBS，上海康晟生物科技有限公司）；青鏈霉素混合液（北京華越洋生物科技有限公司）；NaAsO2（純度≥95.0%，成都西亞試劑有限公司）；甲基胂酸（MMA，純度≥99%，AccuStandard 公司）；二甲次胂酸（DMA，純度≥99%，AccuStandard公司）；GreenNucTM活細(xì)胞Caspase－3 活性檢測試劑盒、胰蛋白酶和CCK-8 試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 將A549 細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基（含10% FBS和1%青鏈霉素混合液）置于37 ℃、5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d 更換1 次新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達到70%～80%時，用胰蛋白酶消化后進行傳代。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以8000 個/孔的細(xì)胞密度接種于96 孔板中，接種22 h后，參考文獻〔13〕，選擇濃度為0、20、40、50、60、80、100 μmol/L NaAsO2和60 μmol/L MMA、60 μmol/L DMA 進行A549 細(xì)胞染毒處理，染毒48 h后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，于酶標(biāo)儀（450 nm）檢測各組OD 值以判斷細(xì)胞活力變化并選擇后續(xù)染毒劑量。

1.2.3 細(xì)胞分組與處理 取處于對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞，以2.5 × 105個/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中?；诩?xì)胞活力檢測結(jié)果，22 h 后分別以濃度 為0、20、40、60 μmol/L NaAsO2和60 μmol/L MMA、60 μmol/L DMA 染毒。

1.2.4 細(xì)胞凋亡與壞死檢測 取處于對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞，以8000 個/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中，參照“1.2.3”項NaAsO2的濃度對A549 細(xì)胞進行染毒。染毒48 h 后棄去原培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1 次，用含5 μmol/L 新鮮培養(yǎng)基的GreenNucTM活細(xì)胞Caspase－3 活性檢測試劑盒對細(xì)胞進行染色，室溫避光孵育30 min，再用PBS 清洗1 次，加入50 μL PBS 于熒光顯微鏡下拍攝每組細(xì)胞情況，其凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈亮綠色。

1.2.5 細(xì)胞中總RNA 提取 收集砷及其代謝產(chǎn)物處理48 h 后的細(xì)胞，丟棄原培養(yǎng)基，并用PBS 輕柔洗細(xì)胞1 次，每孔加入1 mL Trizol 提取細(xì)胞總RNA，采用核酸蛋白測定儀檢測OD260/OD280（在260 nm 和280nm 吸光度比值），并利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.6 mRNA 表達水平的檢測 經(jīng)實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測各處理組cIAP1、cIAP2和XIAP mRNA 表達水平，以GAPDH 為內(nèi)參基因，采用2－ΔΔCt表示mRNA 表達水平。同一濃度設(shè)3 個重復(fù)試驗孔，引物序列見表1。

表1 cIAP1、cIAP2、XIAP 和GAPDH 引物序列

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)錄入，實驗數(shù)據(jù)用（±s）描述，多組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA）。方差不齊時，采用Games－Howell 檢驗；方差齊時，采用SNK 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力檢測 隨著NaAsO2染毒濃度的遞增，細(xì)胞活力逐漸下降，見圖1A。半致死濃度（LC50） 為63.4 μmol/L，包含在所選定的實驗劑量內(nèi)，見圖1B。砷代謝產(chǎn)物MMA、DMA 也使細(xì)胞活力呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1C。

圖1 細(xì)胞活力檢測結(jié)果

2.2 細(xì)胞凋亡與壞死檢測 利用GreenNucTM活細(xì)胞Caspase-3 活性檢測試劑盒對細(xì)胞凋亡和壞死情況進行檢測，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)亮綠色。結(jié)果顯示，在未加入NaAsO2的細(xì)胞中未出現(xiàn)明顯綠色亮點；加入20 μmol/L NaAsO2，細(xì)胞中出現(xiàn)3 個綠色亮點；加入40 μmol/L NaAsO2，細(xì)胞中出現(xiàn)6 個綠色亮點；加入60 μmol/L NaAsO2，細(xì)胞中出現(xiàn)21個綠色亮點。經(jīng)MMA 處理的細(xì)胞出現(xiàn)了2 個綠色亮點，而經(jīng)DMA 處理的細(xì)胞中綠色亮點不明顯。結(jié)果表明，隨NaAsO2濃度的增加，細(xì)胞凋亡和壞死比例逐漸增多；MMA 和DMA 處理后細(xì)胞也有少量凋亡壞死，但經(jīng)MMA 處理的細(xì)胞凋亡壞死數(shù)量多于DMA 處理的細(xì)胞。

2.3 不同劑量NaAsO2染毒A549 細(xì)胞對cIAP1、cIAP2 和XIAP mRNA 表達影響 不同濃度NaAsO2染毒A549 細(xì)胞cIAP1、cIAP2 和XIAP mRNA 表達水平與對照組（0 μmol/L NaAsO2）比較明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），并存在顯著劑量依賴關(guān)系。見圖2。

圖2 NaAsO2 對cIAP1、cIAP2 和XIAP mRNA 表達影響

2.4 MMA、DMA 染毒A549 細(xì)胞對cIAP1、cIAP2和XIAP mRNA 表達影響 MMA 染毒A549 細(xì)胞cIAP1、cIAP2 和XIAP mRNA 表達水平與對照組（0 μmol/L NaAsO2）比較明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 DMA 染毒A549 細(xì)胞cIAP1、cIAP2 和XIAP mRNA 表達水平與對照組（0 μmol/L NaAsO2）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 MMA、DMA 對cIAP1、cIAP2 和XIAP mRNA 表達影響

3 討論

砷是一種廣泛存在于自然界的微量元素，其代謝產(chǎn)物MMA 和DMA 極易溶于水。無機砷是國際癌癥中心確認(rèn)的人類A 類致癌物〔14〕，長期砷暴露可能導(dǎo)致膀胱癌、肺癌和肝癌等發(fā)生。目前砷致癌的機制尚不明確，就目前的研究分析來看，可能與氧化應(yīng)激、DNA 損傷、染色體異常和表觀遺傳變化等有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)NaAsO2通過誘導(dǎo)miR－145 的過度表達，促進DNA 損傷，從而誘發(fā)肝細(xì)胞癌〔15〕。

Li 等〔16〕指出腫瘤細(xì)胞具有十大標(biāo)志性指標(biāo)，其中之一是抑制細(xì)胞的凋亡。而細(xì)胞凋亡是一種維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的自主程序性死亡過程，即細(xì)胞程序性死亡〔17〕，其過程為細(xì)胞發(fā)生核皺縮，染色質(zhì)固縮，DNA 降解，形成凋亡小體，被周圍的吞噬細(xì)胞識別和吞噬〔18〕。正常細(xì)胞處于增殖與凋亡的動態(tài)平衡中，細(xì)胞通過凋亡清理處于過度增殖、具有過度增殖趨勢或具有潛在危險的細(xì)胞，避免機體自身的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為威脅內(nèi)環(huán)境平衡的惡性細(xì)胞，而當(dāng)細(xì)胞凋亡受到抑制時會促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔19〕。

研究表明，癌細(xì)胞中存在過量表達的cIAP1、cIAP2 和XIAP〔20〕。cIAP1、cIAP2 和XIAP 是重要的抗凋亡因子，當(dāng)在細(xì)胞中過量表達時，細(xì)胞的凋亡受到抑制，細(xì)胞的增殖與凋亡之間的動態(tài)平衡被打破，使細(xì)胞過度增殖，從而發(fā)生癌變，在細(xì)胞癌變過程中起到重要作用。有研究表明，NaAsO2通過抑制細(xì)胞凋亡途徑來抑制細(xì)胞的正常凋亡，致使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。XIAP 是最強的內(nèi)源性caspase 抑制劑，可以通過直接結(jié)合caspase，激活NF－кB 信號通路與其他信號通路等，抵抗細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔21〕。而cIAP1 和cIAP2 的C－末端攜帶具有E3 泛素連接酶功能的RING 結(jié)構(gòu)域，通過泛素蛋白酶體途徑降解目標(biāo)蛋白來發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用〔22〕。

本研究結(jié)果顯示，A549 細(xì)胞的cIAP1、cIAP2 和XIAP 基因在不同濃度NaAsO2下的mRNA 表達量與對照組（0 μmol/L NaAsO2）相比均下降。相關(guān)文獻表明，砷暴露可以使抗凋亡基因的表達下降〔23〕，本研究發(fā)現(xiàn)NaAsO2染毒后的A549 細(xì)胞cIAP1、cIAP2和XIAP 基因的mRNA 表達水平下降，與Zhao 等〔24〕研究結(jié)果一致。根據(jù)細(xì)胞凋亡途徑和實驗結(jié)果，可以推斷NaAsO2染毒后的A549 細(xì)胞cIAP1、cIAP2和XIAP 基因的mRNA 表達下降，可能是因為A549 細(xì)胞受到砷的刺激，產(chǎn)生了過量的活性氧（ROS），使NF－кB 的表達顯著下調(diào)，進一步使cIAP1、cIAP2 和XIAP 表達下降；也可能是過量的ROS 生成，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和蛋白激酶B （Akt） 的活性，從而使抗凋亡基因cIAP1、cIAP2 和XIAP 低表達。對這3 種基因來說，MMA 處理后的A549 細(xì)胞同對照組（0 μmol/L NaAsO2）相比，mRNA 的表達均下降，而DMA 處理的A549 細(xì)胞對這3 種基因mRNA 的表達無顯著影響，與Tan 等〔25〕關(guān)于砷的研究結(jié)果一致。MMA 是砷代謝的中間產(chǎn)物，砷進入體內(nèi)后生成亞砷酸，亞砷酸經(jīng)過酶的一系列反應(yīng)生成MMA，但MMA 卻不容易轉(zhuǎn)變成DMA〔26〕，所以MMA 能降低這3 種基因的mRNA 表達，而DMA 對這3 種基因的mRNA表達無顯著影響。因為DMA 是砷代謝的最終產(chǎn)物，砷代謝的過程也是解毒過程，它的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于無機砷〔27〕。

本研究首次探索了在不同濃度NaAsO2染毒下A549 細(xì)胞cIAP1、cIAP2 和XIAP mRNA 的表達情況，結(jié)果表明，無機砷可以抑制cIAP1、cIAP2 和XIAP 基因mRNA 的表達。本研究有利于進一步研究砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機制，為砷致癌的作用機制研究提供實驗依據(jù)。但是本研究存在一定的局限性，缺少流行病學(xué)數(shù)據(jù)，沒有人群中的相關(guān)分析，只研究了砷染毒下A549 細(xì)胞mRNA 的表達，但是單個細(xì)胞對砷的代謝是有限的，而砷在人體內(nèi)的毒性作用是多細(xì)胞參與共同作用的結(jié)果，因此砷在人體內(nèi)的作用機制及過程還需要更深一步的研究。