Xpert MTB/RIF 在肺結(jié)核病診斷及利福平耐藥性檢測(cè)中的驗(yàn)證性分析

張鏡蘭，陳 冉

（大理白族自治州疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)中心，云南大理 671000）

據(jù)報(bào)道， 利福平在多重耐藥（multidrug resistant，MDR）菌株中非常常見，其發(fā)生頻率超過(guò)95%，因此，利福平耐藥性可以用來(lái)作為耐多藥結(jié)核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR－TB）的一個(gè)非常重要的指征，而耐藥肺結(jié)核病已經(jīng)逐漸成為肺結(jié)核病有效防治和控制的障礙〔1〕。目前，傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）藥敏試驗(yàn)方法是我國(guó)基層實(shí)驗(yàn)室中常用的一種確認(rèn)耐藥肺結(jié)核的方法，也是判定耐藥肺結(jié)核病因的一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有耗時(shí)長(zhǎng)等特點(diǎn)，易延誤疾病的診斷和治療。Xpert MTB/RIF 作為一種基于實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（Real－time PCR）技術(shù)，是可同時(shí)實(shí)現(xiàn)MTB和利福平耐藥性指標(biāo)檢測(cè)的試劑盒平臺(tái)〔2-3〕。近年來(lái)，該技術(shù)已成為世界衛(wèi)生組織推薦使用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)〔4〕。本研究運(yùn)用該技術(shù)對(duì)MTB 和利福平耐藥的抗菌敏感性和特異性分別進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證，并與傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，驗(yàn)證其檢測(cè)的可行性與準(zhǔn)確性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2019年1月至12月大理白族自治州12 縣（市）定點(diǎn)醫(yī)院肺結(jié)核患者和疑似患者痰培養(yǎng)陽(yáng)性菌株，共546 株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 采用中國(guó)珠海貝索分枝桿菌藥敏羅氏培養(yǎng)基，4 ℃保存，均在有效期內(nèi)使用。

1.2.2 菌型聯(lián)合鑒定 操作方法嚴(yán)格參照《肺結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》，進(jìn)行對(duì)硝基苯甲酸（pnitrobenzoic acid medium，PNB） 培養(yǎng)基和噻吩－2－羧酸酰肼（thiophene 2 －carboxylic acid hydrazine medium，TCH） 培養(yǎng)基兩種不同鑒定菌型培養(yǎng)基的聯(lián)合生長(zhǎng)活性試驗(yàn)，初步確定MTB 和非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，ntm），進(jìn)一步對(duì)MTB 實(shí)施比例法藥敏試驗(yàn)〔5〕。

1.2.3 比例法藥敏試驗(yàn) 對(duì)利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星和卡那霉素6 種抗結(jié)核藥物分別進(jìn)行藥敏濃度試驗(yàn)，接種后培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)4 周后報(bào)告結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：耐藥率≥1%時(shí)，認(rèn)定為耐藥（R），＜1%時(shí)認(rèn)定為敏感（S）〔5〕。

1.2.4 質(zhì)量控制 嚴(yán)格按照文獻(xiàn)〔5〕進(jìn)行試驗(yàn)操作。H37Rv 作為質(zhì)控菌株，含藥物的培養(yǎng)基均不生長(zhǎng)，對(duì)照管菌落數(shù)＞20 個(gè)〔5〕。當(dāng)高含量稀釋劑濃度為10－4mg/mL 時(shí)，其對(duì)照管上發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)菌落數(shù)少于20 個(gè)時(shí)，應(yīng)重復(fù)1 次試驗(yàn)〔5〕。

1.2.5 診斷標(biāo)準(zhǔn) 嚴(yán)格按照文獻(xiàn)〔6〕執(zhí)行。按接受治療者的既往史進(jìn)行分類，即分為初治和復(fù)治。本次試驗(yàn)二線藥物選擇氧氟沙星和卡那霉素，作為廣泛耐藥結(jié)核的判定依據(jù)〔7〕。

1.2.6 Xpert MTB/RIF 檢測(cè)的判斷依據(jù) 嚴(yán)格按照說(shuō)明書上的要求進(jìn)行樣本的前處理和檢測(cè)操作。檢測(cè)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：Ct 值＞28，陽(yáng)性級(jí)別為＋，MTB 檢出程度為極低；22≤Ct 值≤28，陽(yáng)性級(jí)別為＋＋，MTB檢出程度為低；16≤Ct 值＜22，陽(yáng)性級(jí)別為＋＋＋，MTB檢出程度為中；Ct 值＜16，陽(yáng)性級(jí)別為＋＋＋＋，MTB 檢出程度為高。只有在MTB 檢出的前提下，才顯示利福平耐藥的檢測(cè)結(jié)果。RIF resistance 檢出：利福平耐藥（R）；RIF resistance 未檢出：利福平敏感（S）；RIF resistance 不確定：利福平耐藥結(jié)果無(wú)法判讀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，采用雙側(cè)水平檢驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)Xpert MTB/RIF 檢測(cè)和比例法兩種方法進(jìn)行一致性檢驗(yàn)。按Cohen′s Kappa 系數(shù)的大小分為6 個(gè)強(qiáng)度，Kappa 系數(shù)＜0.0 為極差；0.0≤Kappa 系數(shù)≤0.2為微弱；0.2＜Kappa 系數(shù)≤0.4 為弱；0.4＜Kappa 系數(shù)≤0.6 為適中；0.6＜Kappa 系數(shù)≤0.8 為良好；0.8＜Kappa 系數(shù)≤1.0 為最佳〔8〕。進(jìn)一步將Xpert MTB/RIF檢測(cè)和比例法對(duì)利福平藥敏的結(jié)果進(jìn)行McNemar檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05 時(shí)，表示兩種檢測(cè)強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌型分布 將收集到的546 株陽(yáng)性菌株進(jìn)行菌種鑒別試驗(yàn)和藥敏檢測(cè)。結(jié)果顯示，466 株確定為MTB （85.35%），80 株確定為ntm （14.65%）。Xpert MTB/RIF 檢測(cè)檢出MTB 466 株，檢出率為85.35%，兩種檢測(cè)方法對(duì)MTB 的檢出情況一致。

2.2 菌株耐藥情況 466 株MTB 檢出患者中，初治432 例，復(fù)治34 例，432 例初治患者的總耐藥率（3.01%）明顯低于復(fù)治患者（76.47%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；利福平耐藥率初治（2.31%）低于復(fù)治（11.76%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MDR的耐藥率初治（0.23%）明顯低于復(fù)治（38.24%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；復(fù)治病例中，總耐藥、MDR 和廣泛耐藥的病例總數(shù)和耐藥率明顯高于初治病例，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 傳統(tǒng)比例法篩查MTB 耐藥情況［n（%）］

2.3 兩種檢測(cè)方法對(duì)利福平藥敏的結(jié)果比較 以比例法的結(jié)果為主要衡量標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF 技術(shù)檢測(cè)結(jié)果得到的利福平藥敏耐藥性的靈敏性為97.50%、特異性為97.41%，陽(yáng)性藥敏預(yù)測(cè)值為78.00%，陰性藥敏預(yù)測(cè)值為99.75%。對(duì)兩種最佳檢測(cè)方法分別進(jìn)行Kappa 系數(shù)的分析，Kappa 系數(shù)＝0.853（95%CI 為0.771～0.935，P＜0.001），具有最佳檢測(cè)強(qiáng)度的數(shù)據(jù)一致性，對(duì)兩者進(jìn)行McNemar 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示P＝0.006＜0.05，兩者的檢測(cè)強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此說(shuō)明，采用Xpert MTB/RIF 技術(shù)檢測(cè)利福平耐藥性明顯優(yōu)于傳統(tǒng)比例法檢測(cè)。見表2。

表2 兩種檢測(cè)方法對(duì)利福平藥敏結(jié)果比較

3 討論

眾所周知，培養(yǎng)MTB 是目前臨床研究和診斷肺結(jié)核病的一個(gè)重要金標(biāo)準(zhǔn)〔9〕，普遍認(rèn)為MTB 的生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，一般2～6 周。因此，用培養(yǎng)確認(rèn)肺結(jié)核病的治療存在滯后性和延誤治療的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，藥物敏感性試驗(yàn)也是一種耐多藥肺結(jié)核病常用的診斷手段〔10〕，此種方法在臨床和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中要求比較高，且需要花費(fèi)大量的時(shí)間。所以，快速確認(rèn)肺結(jié)核病和耐多藥性肺結(jié)核病治療的手段成為當(dāng)前肺結(jié)核病防控工作的關(guān)鍵。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)或免疫學(xué)等研究方法的迅猛發(fā)展，Xpert MTB/RIF 實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織推薦使用。

利福平在MDR 致病菌株中非常常見，其發(fā)生頻率通常超過(guò)95%，利福平單耐藥的發(fā)生頻率相對(duì)較低，因此，利福平耐藥可以用來(lái)作為耐多藥結(jié)核的一個(gè)重要指標(biāo)性指征〔11〕。大理白族自治州12 縣（市） 定點(diǎn)醫(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室對(duì)肺結(jié)核病的病原學(xué)診斷主要是涂片和培養(yǎng)，難以實(shí)現(xiàn)肺結(jié)核病和耐藥肺結(jié)核病的早期診斷和及時(shí)治療。Xpert MTB/RIF技術(shù)可為臨床快捷地提供肺結(jié)核患者、耐藥性肺結(jié)核患者和可疑患者的診斷基礎(chǔ)依據(jù)，對(duì)肺結(jié)核和耐藥性肺結(jié)核的初期診斷，合理、規(guī)范治療提供依據(jù)，同時(shí)能夠快速地篩查出MTB、MDR－TB 和廣泛耐藥肺結(jié)核?。╡xtensive drug resistant tuberculosis，XDRTB）可疑者，為預(yù)防MDR－TB 和XDRTB 的疾病傳播提供了依據(jù)，特別是對(duì)新發(fā)耐藥肺結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)更有意義，對(duì)肺結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)耐藥患者管理和患者診療方案制定提供依據(jù)。

本研究以比例法藥敏試驗(yàn)作為參考，將Xpert MTB/RIF 技術(shù)與比例法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)Xpert MTB/RIF 技術(shù)在MTB 和利福平耐藥中的應(yīng)用價(jià)值。兩者結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，對(duì)MTB 的檢出率一致，均為85.35%，未進(jìn)一步采用一致性檢測(cè)。羅剛〔12〕的研究結(jié)果表明，Xpert MTB/RIF 技術(shù)對(duì)樣本的靈敏性為98.32%，陽(yáng)性藥敏預(yù)測(cè)值為93.75%；特異性為92.32%，與本研究結(jié)果相似。由此表明，Xpert MTB/RIF 檢測(cè)技術(shù)在快速診斷肺結(jié)核病和耐藥結(jié)核篩查中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，在檢測(cè)利福平耐藥方面，比例法藥敏試驗(yàn)中有11 例檢測(cè)結(jié)果為S 而Xpert MTB/RIF 的檢測(cè)結(jié)果為R，說(shuō)明Xpert MTB/RIF 有較高的靈敏性和特異性；同時(shí)Xpert MTB/RIF 檢出1 例利福平耐藥為新涂陽(yáng)肺結(jié)核患者，檢出率0.21%（1/466），對(duì)新發(fā)耐多藥結(jié)核患者的發(fā)現(xiàn)有較高價(jià)值；且其檢測(cè)報(bào)告時(shí)間只需2～3 h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于培養(yǎng)（2 個(gè)月）和藥敏試驗(yàn)（1 個(gè)月）的報(bào)告時(shí)間。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的臨床統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果可知：Xpert MTB/RIF 檢測(cè)和比例法藥敏試驗(yàn)具有最佳強(qiáng)度的一致性，McNemar 檢驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明檢測(cè)強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以比例法的結(jié)果作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)參考，Xpert MTB/RIF 技術(shù)檢測(cè)利福平耐藥性的靈敏性和特異性分別為97.50%、97.41%，與既往研究〔13-14〕結(jié)果基本一致。但是，Xpert MTB/RIF 技術(shù)并不能同時(shí)檢測(cè)到異煙肼，從而影響判定耐多藥。查閱相關(guān)資料可以得知，如果肺結(jié)核患者對(duì)異煙肼耐藥，但對(duì)利福平敏感的話，用一種傳統(tǒng)方法治療就會(huì)大幅度地降低肺結(jié)核患者的治愈率，增加了肺結(jié)核患者M(jìn)DR－TB 的發(fā)生概率〔15〕。

綜上所述，Xpert MTB/RIF 檢測(cè)MTB 和利福平耐藥等多個(gè)方面均表現(xiàn)出與比例法相同的檢測(cè)強(qiáng)度，一致性最佳，且與比例法相比試驗(yàn)簡(jiǎn)單易操作，檢測(cè)工作耗時(shí)短，可以迅速進(jìn)行MTB 和利福平耐藥篩查分析，自動(dòng)化設(shè)計(jì)，最大限度減少實(shí)驗(yàn)室人員的工作量，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件和生物安全要求級(jí)別低，適合基層實(shí)驗(yàn)室推廣，可為肺結(jié)核病的快速診斷、調(diào)整治療方案和公共衛(wèi)生防控提供科學(xué)依據(jù)，具有一定的使用前景。