對(duì)陰溝腸桿菌有強(qiáng)抑制活性乳酸菌的分離及鑒定

李亞飛，羅春雨，劉 奇

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）是一種條件致病菌，能在人和動(dòng)物的糞便、泥土或植物中檢出，屬于腸道正常菌種之一。自研究證明陰溝腸桿菌是造成肥胖的直接原因之一后〔1〕，掀起了一股對(duì)陰溝腸桿菌的研究熱潮。陰溝腸桿菌能夠引起人食源性疾病，現(xiàn)已被列為食品加工行業(yè)衛(wèi)生檢測(cè)指標(biāo)之一，經(jīng)常能從水、食品加工廠、大米、家禽產(chǎn)品和水產(chǎn)品中分離得到。若在食物加工過(guò)程中消毒不徹底，則有可能造成陰溝腸桿菌的污染，其產(chǎn)生的大量腐胺等有害物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致食物的腐敗。也有研究〔2〕表明，以陰溝腸桿菌為病原菌且常累及多個(gè)器官的細(xì)菌性感染疾病發(fā)病率逐年上升。由于其產(chǎn)生的酶具有很強(qiáng)的耐藥性，因此臨床治療有難度。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB） 是目前應(yīng)用最廣泛的益生菌之一，被認(rèn)為是對(duì)抗腸道病原體感染極有前途的一種替代品。對(duì)乳酸菌的研究發(fā)現(xiàn)，其代謝產(chǎn)物可防止許多機(jī)會(huì)性病原體的過(guò)度生長(zhǎng)，常見(jiàn)的有金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌、大腸埃希菌等。另外，乳酸菌通過(guò)發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生的大量乳酸對(duì)陰溝腸桿菌生物膜形成有抑制作用〔3〕。鑒于陰溝腸桿菌數(shù)量增多是造成肥胖的直接原因之一〔1〕，本實(shí)驗(yàn)以陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 700323 為目標(biāo)菌株，篩選大理地區(qū)泡菜樣本中分離出的對(duì)陰溝腸桿菌具有高抑制活性的乳酸菌，為研發(fā)具有潛在抑制肥胖功能的泡菜提供基礎(chǔ)，豐富傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品潛在的減肥功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 在云南省大理市收集居民家中自制的泡菜樣品共17 份，乳酸菌發(fā)酵乳1 份，樣本合計(jì)18 份。

1.1.2 主要試劑 陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 700323，由大理大學(xué)病原生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室提供；pGM－Simple－T Fast Cloning Kit（北京天根生化科技有限公司）；PCR Amplification Kit（寶生物工程（大連）有限公司）；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 主要儀器 Applied Biosystems PCR 熱循環(huán)儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）；蛋白凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio－Rad 公司）。

1.1.4 培養(yǎng)基制備 取BBL 瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)（青島博海生物科技有限公司）28 g，加400 μL 吐溫-80，用去離子水定容至400 mL，混合均勻。115 ℃高壓滅菌20 min，冷至50 ℃后平板分裝。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)分離 將收集到的18 份樣本分別在BBL 平板上分區(qū)劃線接種，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。

1.2.2 分離菌種的革蘭氏染色 對(duì)經(jīng)BBL 培養(yǎng)基分離培養(yǎng)得到的疑似為乳酸菌的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察記錄形態(tài)。

1.2.3 菌落PCR 鑒定 對(duì)分離培養(yǎng)得到的疑似菌落轉(zhuǎn)種過(guò)夜再培養(yǎng)，挑取新培養(yǎng)的單個(gè)菌落，對(duì)革蘭氏染色為陽(yáng)性的全部細(xì)菌基因組DNA 用乳酸菌特異性引物進(jìn)行菌落PCR 檢測(cè)，參照文獻(xiàn)〔4-5〕進(jìn)行。正向引物：5′-GTAGCGGTGAAATGCGTAGATA TATGGAA-3′，反向引物：5′-GTGATCCAGCCGCAG GTTCTCC-3′?？倲U(kuò)增體系20 μL，相關(guān)循環(huán)參數(shù)如下：94 °C 預(yù)變性5 min；95 °C 變性40 s，57 °C 退火30 s，72 °C 延伸100 s，循環(huán)30 次；72 °C 延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物取10 μL，進(jìn)行瓊脂糖凝膠（0.7%，W/V）電泳鑒定，目的條帶大小為800 bp 左右。

1.2.4 分離菌株對(duì)陰溝腸桿菌抑菌活性的分析參考文獻(xiàn)〔6-7〕，分析分離得到的乳酸菌對(duì)陰溝腸桿菌（ATCC 700323）的抑菌作用。用比濁法將陰溝腸桿菌稀釋（0.5 個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬鶆蛲坎加贐BL 培養(yǎng)基上。然后將菌落PCR 擴(kuò)增出的800 bp 條帶的菌株點(diǎn)種于已涂布好陰溝腸桿菌的平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀察所接乳酸菌周圍產(chǎn)生的抑菌圈大小，記錄結(jié)果，每個(gè)分離株重復(fù)3 次。

1.2.5 活性菌種目的條帶的切膠回收 將抑菌圈最大的菌株所對(duì)應(yīng)的800 bp 條帶再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒切膠回收備用。

1.2.6 質(zhì)粒構(gòu)建TA 克隆 參照說(shuō)明書(shū)，切膠回收800 bp 電泳條帶后，采用pGM-Simple-T Fast TA 克隆試劑盒構(gòu)建TA 克隆〔8〕。無(wú)菌PCR 反應(yīng)管中體系為：2 × RapiLigation Mix 5 μL，pGM -Simple -T Fast Vector（50 ng/μL）1 μL，1 μL 目的PCR 片段，重蒸水補(bǔ)足至10 μL。將轉(zhuǎn)化后的菌懸液用平板涂布法接種于含有20 μL 異丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactosside，IPTG，10 mmol/L）和10 μL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，X-gal） 的氨芐青霉素抗性平板上，經(jīng)藍(lán)白菌落篩選，37 ℃厭氧培養(yǎng)15～20 h，挑取白色菌落進(jìn)行菌落PCR 重復(fù)鑒定。

1.2.7 測(cè)序鑒定 利用美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）網(wǎng)站的Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具，對(duì)克隆片段測(cè)序比對(duì)，根據(jù)測(cè)序結(jié)果判斷PCR 分離的陽(yáng)性菌株是否為乳酸菌。

2 結(jié)果

2.1 革蘭氏染色 18 份標(biāo)本在BBL 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出的單個(gè)菌落經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，有17 份為紫藍(lán)色桿狀細(xì)菌，即為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，作為候選菌種進(jìn)行后續(xù)鑒定。

2.2 乳酸菌的PCR 鑒定 革蘭氏染色鑒定為紫藍(lán)色桿菌的菌落，經(jīng)PCR 鑒定，菌株1～2、4～18 擴(kuò)增出了800 bp 片段，與目的條帶一致。見(jiàn)圖1。

圖1 不同菌株的PCR 電泳圖

2.3 分離菌株對(duì)陰溝腸桿菌的抑菌活性 不同樣本中分離得到的乳酸菌對(duì)陰溝腸桿菌的抑制作用不同，產(chǎn)生的抑菌圈大小不同。見(jiàn)表1。其中8 號(hào)菌株產(chǎn)生的抑菌圈最大，直徑為（2.10±0.15）cm；其次是16 號(hào)菌株，抑菌圈直徑為（2.00±0.16）cm。結(jié)果表明8 號(hào)菌株對(duì)陰溝腸桿菌ATCC 700323 抑制活性最強(qiáng)，所以選擇8 號(hào)菌株作為目的菌株。

表1 不同菌株對(duì)陰溝腸桿菌的抑菌圈直徑（±s）

表1 不同菌株對(duì)陰溝腸桿菌的抑菌圈直徑（±s）

菌株號(hào) 抑菌圈直徑/cm 菌株號(hào) 抑菌圈直徑/cm 11.60±0.15111.40±0.2021.00±0.18121.40±0.2341.60±0.14131.40±0.1551.40±0.17141.80±0.1461.60±0.12151.60±0.1871.80±0.10162.00±0.1682.10±0.15171.80±0.1591.80±0.17180.40±0.16101.60±0.18

2.4 800 bp 條帶的切膠回收及擴(kuò)增 由于8 號(hào)菌株具有最強(qiáng)的抑制活性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)8 號(hào)菌株進(jìn)行TA 克隆構(gòu)建及測(cè)序鑒定。首先切取8 號(hào)菌株800 bp 擴(kuò)增條帶，經(jīng)切膠回收后，再次進(jìn)行重復(fù)大體系的擴(kuò)增。見(jiàn)圖2。

圖2 800 bp 條帶的大體系擴(kuò)增PCR 電泳圖

2.5 TA 克隆的構(gòu)建及菌落PCR 驗(yàn)證 將T 載體與8 號(hào)菌株大體系擴(kuò)增切膠回收后的800 bp DNA 連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選后，隨機(jī)挑取平板上8 個(gè)白色菌落，對(duì)其再次進(jìn)行菌落PCR 技術(shù)鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3。其中8 號(hào)菌株的8－1、8－5 為陽(yáng)性菌落。挑取菌落8－1、8－5 進(jìn)行搖菌擴(kuò)增后，取1 mL 菌液送昆明擎科生物科技有限公司測(cè)序。

圖3 TA 克隆的菌落PCR 鑒定結(jié)果圖

2.6 測(cè)序結(jié)果及比對(duì) 測(cè)序峰圖顯示，兩端引物結(jié)合的區(qū)域之間，峰圖無(wú)背景圖信號(hào)，測(cè)序結(jié)果質(zhì)量高，見(jiàn)圖4。序列內(nèi)容為：“GTAGCGGTGAAATGCG TAGATATATGGAAGAACCCCAGTGGCGAAGGCGG CTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAG TATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGA GGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATT AAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCT GAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAA GCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGC GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAA ATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATG GATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG CAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGG CACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGG AAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTA TGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTA CAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATC TCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGC AACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAAT CGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCG GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAA TTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTA GGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAG GGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACC TGCGGCTGGATCAC”。測(cè)序文件中，59～87 bp，889～910 bp 之間分別是F、R 引物的結(jié)合位點(diǎn)。其序列大小為852 bp，與電泳條帶大小吻合。將上述測(cè)得的序列結(jié)果用Blast 進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2。明確了8 號(hào)菌為乳桿菌科（Lactoba cillaceae）的植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus）或乳酸菌屬（Lactobacillus sp.），可以用作乳制品發(fā)酵及泡菜制作的菌種。

圖4 測(cè)序峰圖

表2 測(cè)序比對(duì)結(jié)果

3 討論

肥胖一直都是高血脂、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的常見(jiàn)影響因素，嚴(yán)重危害人類健康。如何控制肥胖，研究其機(jī)制，一直都是科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)。有研究〔9〕表明，陰溝腸桿菌是影響肥胖的關(guān)鍵因素，通過(guò)建立小鼠肥胖模型后發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)陰溝腸桿菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素脂多糖是導(dǎo)致宿主代謝紊亂和引起炎性反應(yīng)的重要原因之一。本團(tuán)隊(duì)之前也通過(guò)調(diào)查統(tǒng)計(jì)證明了大學(xué)生糞便中陰溝腸桿菌菌落數(shù)量與其BMI之間呈正相關(guān)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

乳酸菌能產(chǎn)生乳酸，可調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道正常菌群，維持機(jī)體微生態(tài)穩(wěn)定、抑制毒素，從而控制腸道內(nèi)腐敗菌大量繁殖及腐敗相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)生，對(duì)腸道進(jìn)行保護(hù)〔10〕。有研究證明對(duì)于陰溝腸桿菌誘導(dǎo)的高脂肪飲食喂養(yǎng)的動(dòng)物肥胖模型，植物乳桿菌具有很好的抗肥胖作用〔11〕。乳酸菌的物種多樣性和它在自然界分布廣、易獲取的特點(diǎn)，使其不論在學(xué)術(shù)研究還是生產(chǎn)生活中都具有重要的價(jià)值，廣泛應(yīng)用于微生物分類研究、食品加工業(yè)、醫(yī)學(xué)研究等重要領(lǐng)域。因而有許多科研人員聚焦于優(yōu)良乳酸菌的分離篩選及相關(guān)基因工程的改造研究〔12-13〕。現(xiàn)已有許多乳酸菌的鑒定方法，包括形態(tài)學(xué)鑒定、生化鑒定、基于基因水平上的鑒定等〔14〕，目前最主要的鑒定方法是基于基因水平的方法。Cocolin 等〔15〕首次通過(guò)PCRTGGE 技術(shù)擴(kuò)增細(xì)菌16Sr DNA 序列V3 可變區(qū)的233bp 片段，成功鑒定出了6 種乳酸菌。潘渠等〔5〕進(jìn)一步研究對(duì)比分析了已完成測(cè)序的14 種乳酸菌的16Sr DNA，設(shè)計(jì)出了一對(duì)乳酸菌特異性引物，且有較高的特異性。

云南省大理地區(qū)有著多年的食用泡菜傳統(tǒng)，泡菜制作最關(guān)鍵的因素就是乳酸菌，它是目前最主要的發(fā)酵菌劑。乳酸菌的發(fā)酵性能及安全性對(duì)人們健康至關(guān)重要。我們?cè)诖罄淼貐^(qū)收集了泡菜樣本和發(fā)酵乳制品18 份，旨在分離培養(yǎng)出對(duì)陰溝腸桿菌具有抑制優(yōu)勢(shì)的乳酸菌種。研究結(jié)果顯示，收集到的泡菜樣本中分離的乳酸菌對(duì)陰溝腸桿菌具有不同的抑制活性，通過(guò)革蘭氏染色、菌落PCR 鑒定、抑菌活性分析，選取了抑制活性最強(qiáng)的菌株，再通過(guò)條帶切膠回收、大量擴(kuò)增、TA 克隆構(gòu)建、測(cè)序比對(duì)等一系列步驟最終鑒定該菌株為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步對(duì)肥胖人群中的不同陰溝腸桿菌分離株進(jìn)行相關(guān)抑制活性測(cè)定。通過(guò)對(duì)該菌株的后續(xù)研究，有望使其成為泡菜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的純種菌株。