基于高通量測(cè)序技術(shù)的苗期抗條銹基因YrCHI 的遺傳定位

韓金妤，劉 丹，張 旭，吳啟蒙，韓德俊，吳建輝

（西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100）

小麥條銹病是由小麥條銹菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici）引起的一種氣流傳播性真菌病害，是世界范圍的重要病害之一，具有分布廣泛、大面積暴發(fā)流行等特點(diǎn)。我國(guó)是世界上規(guī)模最大的條銹病流行區(qū)系，常年發(fā)生面積400.0 萬～533.3 萬hm2，一般發(fā)生區(qū)可損失產(chǎn)量10%～20%，嚴(yán)重流行區(qū)可達(dá)30%以上，自20 世紀(jì)50 年代以來，發(fā)生4 次大流行，造成巨大產(chǎn)量損失[1-2]。21 世紀(jì)以來，由于條銹菌小種的變異導(dǎo)致新致病性小種不斷涌現(xiàn)，新小種發(fā)生頻率一直攀升，造成了西北、西南等小麥條銹病流行區(qū)連年成災(zāi)，且具有高發(fā)態(tài)勢(shì)，嚴(yán)重威脅著我國(guó)小麥安全生產(chǎn)[3-5]。因此，對(duì)小麥條銹病需加強(qiáng)防治以免小麥條銹病大區(qū)流行造成不可挽回的損失。而對(duì)于小麥條銹病的防治，目前主要有2 種途徑：化學(xué)農(nóng)藥和種植抗病品種。其中，化學(xué)殺菌劑的應(yīng)用在病害應(yīng)急防治中確實(shí)發(fā)揮了重要作用，但也帶來了一系列的“后遺癥”，大規(guī)模的不規(guī)范使用增加了生產(chǎn)成本，還造成了環(huán)境污染[6]。大量研究與生產(chǎn)實(shí)踐表明，抗病品種的選育和應(yīng)用是防治條銹病最具生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)安全的措施[3]。但由于小麥條銹菌小種變異頻繁，如最新出現(xiàn)的致病小種條中34（CYR34）及其V26 致病類群，導(dǎo)致我國(guó)當(dāng)前生產(chǎn)上大部分小麥品種“喪失”抗性[5]。因此，亟需從小麥材料中發(fā)掘和利用新的抗病基因資源以提高作物抗病性。

隨著新一代測(cè)序和芯片技術(shù)的成熟及快速發(fā)展，以單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）為標(biāo)志的第3 代標(biāo)記被人們大量開發(fā)出來，SNP 廣泛分布在各個(gè)基因組中，而且SNP 類型的標(biāo)記具有成本低、共顯性、易于實(shí)現(xiàn)高通量分析等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，因此，很快在水稻、玉米、小麥等作物的基因發(fā)掘與利用中大量使用[7]。目前利用測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用在小麥正向遺傳學(xué)研究中，如多樣性評(píng)估、QTL 定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析等。同時(shí)，針對(duì)SNP 的高通量檢測(cè)技術(shù)也相繼開發(fā)出來，如基于LGC Genomics 公司的競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP）標(biāo)記[8]、基于北京嘉誠(chéng)公司的等位基因特異的定量PCR 基因分型系統(tǒng)（AQP）標(biāo)記[9]，這類標(biāo)記可以更高效地實(shí)現(xiàn)基因分型。與凝膠電泳相比，KASP/AQP 標(biāo)記的使用節(jié)省了在SSR 標(biāo)記篩選、群體基因型分析上的時(shí)間，解放了人力，也極大地降低了單個(gè)標(biāo)記分析的成本，提升了技術(shù)的可適用性；同時(shí)，也為育種家們提供了高通量分子標(biāo)記輔助選擇的技術(shù)手段。

西北農(nóng)林科技大學(xué)植物免疫團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期從事小麥抗條銹病研究，其中小麥抗病遺傳與分子設(shè)計(jì)育種課題組前期從世界各地征集小麥5 000 余份，經(jīng)過多年多點(diǎn)的鑒定，篩選出數(shù)百份條銹病抗性優(yōu)良的種質(zhì)[10-18]。其中，來自美國(guó)農(nóng)業(yè)部USDA 的品種PI 90279 和國(guó)際玉米小麥改良中心（CIMMYT）的品種Chilero 自引進(jìn)我國(guó)后，一直對(duì)我國(guó)小麥條銹病保持良好的抗性[19-20]。特別是整個(gè)全生育期（苗期）針對(duì)當(dāng)前流行最廣泛的CYR34 小種都具有抗性，因此，發(fā)掘鑒定這類抗性基因?qū)τ谖磥響?yīng)用于抗病育種具有重要的意義。雖然Chilero 在墨西哥已經(jīng)保持抗病多年，且PONCE-MOLINA 等[24]對(duì)其成株期抗性進(jìn)行了遺傳定位，并分別在染色體1B、5D 和7B 上發(fā)現(xiàn)成株期抗性QTL位點(diǎn)Lr46/Yr29、QLr.cim-5DS/QYr.cim-5DS 和QYr.cim-7BL，但是Chilero 與PI 90279 一樣，苗期抗性的遺傳基礎(chǔ)一直尚未得到解析，苗期抗性與成株期抗性之間的關(guān)系也尚未得到分析。

本研究在前期研究基礎(chǔ)上，擬對(duì)2 個(gè)小麥品種條銹病全生育期（苗期）抗性進(jìn)行遺傳解析和分子作圖，以期完成對(duì)目標(biāo)遺傳位點(diǎn)的定位，并獲得與目標(biāo)位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。研究所發(fā)掘的條銹病基因及其連鎖標(biāo)記可用于分子輔助選擇育種，可為我國(guó)小麥條銹病抗性育種的改良提供重要材料和基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以澳大利亞感病品種Avocet S（AvS）為母本、抗病品種PI 90279 和Chilero 為父本，分別雜交構(gòu)建186 個(gè)F2家系和154 個(gè)重組自交系（RIL）的遺傳群體。銘賢169、Avocet S 和小偃22 為感病對(duì)照。

供試小麥條銹菌生理小種為CYR34（實(shí)驗(yàn)室代號(hào)V26-Lab），由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供，經(jīng)過鑒定、純化，隔離繁殖后備用。AvS/PI 90279的F2材料均由抗病遺傳與分子設(shè)計(jì)育種課題組保存，AvS/Chilero 的RIL 群體由河南科技大學(xué)王春平教授惠贈(zèng)。

1.2 條銹病苗期抗性鑒定與遺傳分析

小麥苗期抗性鑒定在西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病理研究所溫室進(jìn)行。將AvS、PI 90279、Chilero、感病對(duì)照以及遺傳群體種植在10 cm×10 cm×10 cm的塑料方盆中，對(duì)于親本和RIL 家系，每個(gè)材料7～8 粒，播種在方盆的4 個(gè)角，待小麥幼苗生長(zhǎng)至二葉完全伸展時(shí)（一般15 d 左右），采用抖粉法（條銹菌小種CYR34∶滑石粉≈1∶50（V/V））進(jìn)行接種[20]。接種后在9～11 ℃條件下避光保濕24 h，之后將小麥幼苗置于溫室中培養(yǎng)，溫度控制在18 ℃以下，光照強(qiáng)度為20 000 lx，16 h/8 h 光暗周期，相對(duì)濕度80%左右，待感病對(duì)照充分發(fā)病后（接種后15～18 d）記載AvS、PI 90279、Chilero 和后代遺傳群體的反應(yīng)型。反應(yīng)型（Infection type，IT）按0～9 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記載，其中，反應(yīng)型0～6 級(jí)為抗病型（R），7～9級(jí)為感病型（S）。每隔3 d 調(diào)查一次，最終結(jié)果以最高反應(yīng)型為準(zhǔn)。

根據(jù)親本以及后代群體的反應(yīng)型，在Excel 中用χ2法對(duì)調(diào)查獲得的分離比進(jìn)行適合性檢測(cè)，確定最適合的分離比率，明確供試品種對(duì)特定條銹病小種抗性的基因數(shù)目、互作方式及抗病特點(diǎn)，進(jìn)而明確抗條銹病基因的數(shù)目及其相互關(guān)系。

1.3 集群分離分析

待小麥生長(zhǎng)至3 葉期左右，采集各親本及單株/家系的第3 葉，利用CTAB 法進(jìn)行DNA 的提取。根據(jù)AvS×PI 90279 和AvS×Chilero 的F2和RIL 家系的條銹病抗性分離特點(diǎn)，采用混池分析法（bulked segregant analysis，BSA），分別選擇10 株極端抗病單株/家系和10 株極端感病單株/家系按照等量DNA 構(gòu)建2 組抗感池，經(jīng)質(zhì)檢無問題后，將構(gòu)建的抗感池和親本送往北京博奧生物技術(shù)有限公司（http：//www.capitalbiotech.com/），利用小麥最新660K SNP 芯片v2.0 進(jìn)行掃描。樣品下機(jī)后需進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)合格，然后通過GTC 軟件（Affymetrix 公司，http：//www.affymetrix.com/estore/）對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行SNP 分型和聚類分析。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性，依據(jù)以下過濾標(biāo)準(zhǔn)對(duì)SNP 標(biāo)記進(jìn)行剔除：無多態(tài)性及低質(zhì)量的、缺失值大于20%的、分群不明顯的、等位頻率低于5%的等等?；赟NP 所在的染色體物理位置，利用自編Perl 語言腳本確定AvS×PI 90279 和AvS×Chilero 群體抗感池間差異SNP主要集中的染色體區(qū)域，初步推斷目標(biāo)基因所在的染色體區(qū)域。

1.4 全基因組定位

前期利用DArT 標(biāo)記對(duì)AvS×Chilero 的RIL 群體中140 個(gè)家系進(jìn)行測(cè)序分型，并完成了該群體的全基因組范圍內(nèi)的連鎖圖譜的構(gòu)建，該數(shù)據(jù)同樣由河南科技大學(xué)王春平教授提供。利用IciMapping v4.1（Inclusive Composite Interval Mapping）軟件對(duì)該群體的苗期抗性表型進(jìn)行QTL 分析，LOD 閾值設(shè)為2.5，用表型變異解釋率PVE 描述發(fā)掘到的位點(diǎn)的效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期抗性鑒定與遺傳分析

苗期鑒定結(jié)果表明，Avocet S 對(duì)CYR34 表現(xiàn)為高度感病（IT＝9），而PI 90279 和Chilero 表現(xiàn)為高度抗?。↖T＝1）（圖1）。而在AvS×PI 90279 的F2和AvS×Chilero 的RIL 群體后代中，抗病個(gè)體/家系絕大多數(shù)集中在0～3 反應(yīng)級(jí)上。F2抗病株有53 株（IT 為0～6），感病株有133 株（IT 為7～9）（圖2-A），經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)（χ2＝0.58，P＝0.27＞0.05），符合1∶3 的期望比。AvS×Chilero 的154 個(gè)RIL 家系中，純合抗病家系數(shù)為68 個(gè)，純合感病株系數(shù)為84 個(gè)（有2 個(gè)家系未獲得表型）（圖2-B），經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)（χ2＝0.84，P＝0.19＞0.05），符合1∶1 的期望比。說明小麥抗病種質(zhì)PI 90279 和Chilero 苗期抗性分別由1 對(duì)主效基因控制。

2.2 AvS×PI 90279 和AvS×Chilero 群體的抗感池分析

利用小麥660K 芯片對(duì)2 個(gè)群體的抗感池分別進(jìn)行掃描，然后將抗感池間表現(xiàn)出純合差異的SNP進(jìn)行比較整合。其中在AvS×PI 90279 群體中，從660K 芯片掃描的結(jié)果統(tǒng)計(jì)抗感池間和親本共同的多態(tài)性SNP 有6 269 個(gè)，根據(jù)660K 的物理圖譜信息，發(fā)現(xiàn)分別有2 523、3 746 個(gè)SNP 分布在5B 和7B 上，約占總差異的75.71%，另有55 個(gè)SNP 未獲得定位信息，剩余SNP 落在其他染色體上且在各個(gè)染色體上數(shù)量不等（圖3-A）。以上結(jié)果說明，位于5B 和7B 染色體上的SNP 極有可能與抗病基因相關(guān)聯(lián)。同樣的，在AvS×Chilero 群體中，從660K 芯片掃描的結(jié)果統(tǒng)計(jì)抗感池間和親本共同的多態(tài)性SNP 有6 946 個(gè)，根據(jù)660K 的物理圖譜信息，發(fā)現(xiàn)分別有2 418、4528 個(gè)SNP 分布在5B 和7B 上，約占總差異的39.65%，另有719 個(gè)SNP 未獲得定位信息，剩余SNP 落在其他染色體上且在各個(gè)染色體上數(shù)量不等（圖3-B）。以上結(jié)果同樣說明，位于5B和7B 染色體上的SNP 極有可能與抗病基因相關(guān)聯(lián)。考慮到AvS 品種為5BL/7BL 易位系，因此，差異SNP 實(shí)際上是位于同一條染色體上。

進(jìn)一步根據(jù)5B 和7B 上的SNP 物理位置信息，統(tǒng)計(jì)每兆堿基（Mb）中含有的差異SNP 數(shù)量，結(jié)果顯示，AvS×PI 90279 群體中的7B 染色體上絕大部分SNP 都位于600～720 Mb 區(qū)間（圖3-C），同樣的，AvS×Chilero 群體中的7B 染色體上絕大部分SNP 也都位于600～720 Mb 區(qū)間（圖3-D），因此，初步推測(cè)該區(qū)間極有可能就是目標(biāo)基因或QTL所在的位置；而5B 染色體上的SNP 分布較為分散（未展示）。此外，將2 個(gè)群體的抗感池差異SNP 比較發(fā)現(xiàn)，2 個(gè)群體共同擁有的差異SNP 為2 062 個(gè)，其中，5B 上有728 個(gè)（圖3-E），7B 上有1 334 個(gè)（圖3-F）。綜合以上結(jié)果，AvS×PI 90279 和AvS×Chilero 群體中對(duì)于條銹菌小種CYR34 的抗性均由1 對(duì)基因控制，且位于同一染色體7B 同一區(qū)域，推斷二者很可能為同一個(gè)基因。

2.3 7B 染色體上目標(biāo)位點(diǎn)的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證上述混池分析的結(jié)果，進(jìn)一步利用AvS×Chilero 的RIL 群體的基于DArT 標(biāo)記的全基因組連鎖圖譜[24]對(duì)苗期抗性表型進(jìn)行QTL 定位（圖4），在7B 染色體的連鎖圖譜上成功定位出一個(gè)主效位點(diǎn)，暫命名為YrCHI，表型變異解釋率為82.38%，位于DArT標(biāo)記4404275 和1138630 之間，根據(jù)2 個(gè)標(biāo)記的序列，與中國(guó)春基因組比對(duì)后發(fā)現(xiàn)分別對(duì)應(yīng)于701.28、708.85 Mb，即YrCHI 位于701.28～708.85 Mb區(qū)間，該區(qū)間包含在混池分析所定位的區(qū)間（600～720 Mb），證實(shí)了混池分析的結(jié)果。

3 討論

3.1 定位在小麥7B 染色體上的條銹病抗性基因

小麥7B 染色體是一個(gè)富含抗病基因的染色體，前人已發(fā)掘定位出大量抗條銹病基因[21-23]，根據(jù)最新的7B 染色體物理圖譜，其中Yr6 和Yr63 位于7BS 上，其他基因均位于7BL 上，YrCHI 位于701～710 Mb 之間，其中，Yr79 和Yr39 距離YrCHI 超過300 Mb，Yr041133 距離YrCHI 約100 Mb，YrZM103位于700 Mb 左右，其他基因如YrKB、YrZH84、Yr59、Yr52、Yr67 和YrSui 等都集中在710～740 Mb 的區(qū)間。從物理位置看，只有YrZM103 和YrCHI 有重疊區(qū)域。從育種系譜上分析看，YrZM103 來源于品種鄭麥103，鄭麥103 的系譜為“周13/D8904-7-1//鄭004”，Chilero 系譜為“4777*2//FKN/Gabo 54/3/Ve ery#5/4/Buckbuck/Pavon F76”[24]，其中周麥13 的親本之一是周8425B，而周8425B 的親本之一是Nainari60，Nainari60 的系譜為“Supremo/Mentana//Gabo-55/3/Thatcher/Querearo//Kentana/5/Gabo-55”（http：//wheatpedigree.net/sort/sh-ow/43385），經(jīng)仔細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，鄭麥103 和Chilero 確實(shí)存在比較久遠(yuǎn)的共同親本“Gabo”，因此，有可能YrZM103 和YrCHI 為同一個(gè)基因，但需要更進(jìn)一步的等位性分析試驗(yàn)來確認(rèn)。而前人在Chilero 材料中7B 染色體上定位一個(gè)主效的成株期抗條銹病QTL 位點(diǎn)QYr.cim-7BL，該位點(diǎn)介于DArT 標(biāo)記100006719 和1112830 之間，與YrCHI 的兩翼標(biāo)記4404275 和1138630 相距10 Mb左右，因此認(rèn)為，控制成株期抗性的QTL 與苗期針對(duì)CYR34 小種的抗性位點(diǎn)YrCHI 屬于2 個(gè)不同的基因位點(diǎn)。

3.2 抗病基因的發(fā)掘是培育抗病品種的基礎(chǔ)

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的進(jìn)步和分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，大量的抗條銹病基因已被發(fā)現(xiàn)并且得到了命名。截至2021 年6 月，正式命名的小麥條銹病抗性基因有83 個(gè)，暫命名基因超過300 個(gè)[21，25]。雖然發(fā)掘的基因數(shù)目看似“可觀”，但條銹菌不斷變異，致使大部分抗條銹病基因已在我國(guó)“喪失”抗性，目前仍具有良好苗期抗性的基因有Yr5、Yr15、Yr50、Yr61、Yr69 等[26]。然而這些基因幾乎全部來自小麥近緣屬種、六倍體斯卑爾脫小麥（Triticum spelta album，Yr5）、野生二粒小麥（Triticum dicoccoides，Yr15），偃麥草屬（Thinopyrum，Yr50、Yr69）[27]。這些基因隨著外源滲入片段進(jìn)入普通小麥染色體中，往往還攜帶一些其他不良的性狀，即“連鎖累贅”，要想打破他們之間的緊密連鎖關(guān)系目前還是很困難，比如雖然黑麥1RS 染色體攜帶抗三銹基因Yr9、Lr26 和Sr31 以及抗白粉基因Pm8，但是1RS 染色體還攜帶黑麥堿（secalin）基因影響面包加工品質(zhì)。這類外源基因往往需要通過較長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)行選擇“改造”以提升其產(chǎn)量品質(zhì)等，才有可能被育種家利用。因此，發(fā)掘的新抗病基因不僅要滿足抗性強(qiáng)，抗譜廣，還要在產(chǎn)量、品質(zhì)、農(nóng)藝性狀等方面滿足要求，載體品種不能有重大缺陷，這樣才能很好地被育種利用。選育推廣的栽培品種是優(yōu)良基因的集合體，一般不存在連鎖累贅，往往不需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的改良即可利用[28]。如果能從普通小麥品種中發(fā)掘和利用抗條銹病基因，將有利于加快抗病育種進(jìn)程。西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥抗病遺傳與分子設(shè)計(jì)育種課題組前期從全世界范圍內(nèi)收集了大量種質(zhì)，并進(jìn)行了一系列的性狀鑒定評(píng)估。本研究從2 個(gè)種質(zhì)中鑒定出相同的針對(duì)CYR34 小種呈現(xiàn)抗性的苗期基因，PI 90279 雖為美國(guó)農(nóng)業(yè)部收集的種質(zhì)，但其來源地為中國(guó)，不存在適應(yīng)性的問題，其株高80 cm 左右，穗長(zhǎng)9 cm 左右，千粒質(zhì)量44.9 g，穗粒數(shù)53 個(gè)，籽粒為紅色，沉降值為29（數(shù)據(jù)未發(fā)表）；與對(duì)照小偃22 相比，開花期晚5～6 d，成熟期相當(dāng)。而Chilero為CIMMYT 推廣的品種，自引進(jìn)我國(guó)后，其生態(tài)適應(yīng)性良好，尚未發(fā)現(xiàn)不良性狀，其為春性小麥，且含有矮稈基因Rht2、抗葉銹病基因Lr13、高分子量谷蛋白亞基基因Glu-A1a、Glu-B1c、Glu-D1a（http：//wheatpedigree.net/sort/show/12452）；與對(duì)照小偃22 相比，開花期早6～7 d，成熟期早4～5 d。因此，2 個(gè)種質(zhì)在未來的抗病育種中一定具有良好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，利用混池分析結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)快速實(shí)現(xiàn)苗期抗條銹病基因YrCHI 的快速定位，發(fā)掘大量的SNP 可開發(fā)高通量的分子標(biāo)記用以輔助選擇，所發(fā)掘的YrCHI 及其分子標(biāo)記為小麥抗病育種提供良好的基因資源及其種質(zhì)資源，也為條銹病抗性改良奠定了基礎(chǔ)。

志謝：本研究特別感謝河南科技大學(xué)王春平教授贈(zèng)予的小麥Chilero 遺傳群體。