低溫脅迫下6 種馬鈴薯組培苗耐寒性評價

王明霞，梅 超，宋倩娜，王慧杰，吳雙艷，馮瑞云

（1.山西大學生命科學學院，山西太原 030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太原 030031）

馬鈴薯（Solanaceae tuberosum L.）是茄科茄屬，1 年生雙子葉植物，在山西乃至全國范圍內(nèi)大面積栽種，是一種良好的經(jīng)濟作物[1]。馬鈴薯是山西省部分地區(qū)主要脫貧產(chǎn)業(yè)，是保障山西省糧食安全及精準扶貧的重要產(chǎn)業(yè)。因此，選育優(yōu)良馬鈴薯品種對我國農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要作用[2]。溫度是影響作物生長發(fā)育及產(chǎn)量和品質(zhì)的重要環(huán)境因素，低溫脅迫是嚴重影響作物生長的非生物脅迫之一，因此，如何提高作物耐低溫脅迫能力是目前研究熱點之一[3]。馬鈴薯喜冷涼環(huán)境，不耐霜凍，0 ℃以下的低溫凍害和0 ℃以上的低溫冷害都會使馬鈴薯植物生長受到一定抑制。長期低溫會對苗期馬鈴薯植株發(fā)育造成損害，嚴重時會造成馬鈴薯結薯量下降甚至絕收[4]。馬鈴薯葉片在-4 ℃低溫下至少還可以存活5 d，具有一定的抗寒性[5]。馬鈴薯種間差異大，抗低溫脅迫能力具有一定差異。因此，選育抗寒能力較強的優(yōu)良馬鈴薯品種對減少凍害風險及促進馬鈴薯產(chǎn)業(yè)提質(zhì)、增收十分必要。

細胞作為植物體最基本的單位，低溫脅迫發(fā)生時，首先發(fā)生冷害的部位是細胞膜系統(tǒng)，植物細胞的細胞膜和細胞器膜先后遭到破壞，進而造成植株損害和死亡[6]。低溫脅迫會引起植物膜系統(tǒng)、細胞滲透壓、正常生理代謝和保護酶系統(tǒng)等發(fā)生一系列改變。研究表明，一些植物長期在低溫逆境中形成抗寒能力，如通過改變植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、酶活性等方式抵御低溫脅迫[7]。脯氨酸是一種親水性溶劑，低溫條件下植物體內(nèi)脯氨酸積累量越多，植物耐寒性越強，可緩解細胞因低溫脅迫植物脫水造成的滲透脅迫[4，8]。李飛等[9]研究表明，馬鈴薯抗寒性與脯氨酸含量具有一定相關性，低溫馴化馬鈴薯品系耐寒性強的品種脯氨酸含量高于耐寒性較弱的馬鈴薯品系。許娟等[10]研究發(fā)現(xiàn)，不同品種馬鈴薯受到低溫脅迫后，SOD、POD、CAT 等生理指標呈上升趨勢，但當?shù)蜏孛{迫時間延長以后，各個生理指標升降趨勢不一致。楊惠菊等[11]通過馬鈴薯苗期耐寒指標相關性分析得出，可溶性糖與過氧化物酶活性呈顯著相關性。

為了進一步綜合分析不同品種馬鈴薯耐寒性強弱，本研究以并薯6 號、克新1 號、費烏瑞它、晉薯16 號、冀張薯12 號和大西洋等脫毒組培苗為對象進行低溫脅迫處理，通過測定不同品種馬鈴薯組培苗中過氧化氫酶、過氧化物酶活性及可溶性糖、脯氨酸含量等生理生化指標，并采用隸屬函數(shù)法對其抗寒性進行綜合評價[12-15]，以期為抗寒性馬鈴薯品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料并薯6 號脫毒組培苗（山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院與太原市惠禾經(jīng)貿(mào)有限公司選育）、克新1 號脫毒組培苗（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院馬鈴薯研究所選育）、費烏瑞它脫毒組培苗（國外引進示范品種，低溫敏感）、晉薯16 號脫毒組培苗（山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院高寒區(qū)作物研究實驗室選育）、冀張薯12 號脫毒組培苗（河北省高寒研究所選育）、大西洋脫毒組培苗（國外引進示范品種）等6 個馬鈴薯品種，均由山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院馬鈴薯基因編輯實驗室提供。

1.2 試驗方法

參照黃先群等[16]的研究方法對材料進行處理，并略作改動。將供試材料組培苗在MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)28 d 后，選取生長狀態(tài)良好，長勢一致的脫毒組培苗用于試驗。對6 個不同品種馬鈴薯進行低溫脅迫處理，試驗在低溫光照培養(yǎng)箱中進行，采用4 ℃和-4 ℃共2 個溫度處理48 h，光照強度為2 500 lx左右，光照時間為12 h/d，每個處理重復3 次。-4 ℃處理組的馬鈴薯試驗材料，低溫處理之前進行為期5 d 的低溫馴化，馴化溫度為4 ℃。將常溫25 ℃作為對照處理，光照強度為2 500 lx 左右，光照時間12 h/d，設置3 次重復。

1.3 測定指標及方法

低溫脅迫處理后，取整株馬鈴薯組培苗用液氮研磨混勻后放入1.5 mL 離心管中，存放于-80 ℃超低溫冰箱中儲藏備用。POD、CAT 活性以及Pro、可溶性糖含量均采用生工Sangon Biotech 試劑盒測定。

1.4 采用隸屬函數(shù)法綜合分析馬鈴薯耐寒性

與抗寒性呈正相關的指標參數(shù)如下。

與抗寒性呈負相關的指標參數(shù)如下。

式中，U（Xij）表示各指標的隸屬度值，該數(shù)值的范圍在0～1，Xij中字母i 指的是不同品種的馬鈴薯，j 代表不同測定指標。將每個品種馬鈴薯的所有指標累加，求其平均數(shù)，平均數(shù)越大耐寒性越強。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理，采用GraphPad Prism 制作柱狀圖，采用SPSS 19.0 進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對馬鈴薯生理指標的影響

2.1.1 對游離脯氨酸（Pro）含量的影響 表1 和圖1 結果表明，低溫脅迫后，各品種馬鈴薯的脯氨酸含量整體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與對照組相比，均呈現(xiàn)增加。4 ℃時各品種馬鈴薯的脯氨酸含量存在顯著性差異，表現(xiàn)為并薯6 號的脯氨酸含量最大，其次依次是冀張薯12 號和晉薯16 號；-4 ℃時各品種馬鈴薯脯氨酸含量表現(xiàn)為冀張薯12 號＞晉薯16 號＞克新1 號＞并薯6 號＞大西洋＞費烏瑞它，與4 ℃相比，并薯6 號和費烏瑞它的降幅較大，且二者之間存在顯著性差異（P＜0.05），并薯6 號的脯氨酸含量較大，冀張薯12 號和晉薯16 號的脯氨酸含量之間差異不顯著，但是顯著高于其他4 個品種（P＜0.05）。并薯6 號在4 ℃時脯氨酸含量最高，其次依次是冀張薯12 號和晉薯16 號，具有較高的抗脅迫能力，冀張薯12 號和晉薯16 號在-4 ℃時脯氨酸依然保持較高水平，且二者之間不存在顯著性差異，但是顯著高于其他馬鈴薯品種（P＜0.05），表明其耐低溫能力更強?？诵? 號在低溫脅迫后脯氨酸含量也保持較高水平，從而抵抗低溫脅迫，大西洋在低溫脅迫后脯氨酸含量增加趨勢相對較穩(wěn)定但脯氨酸含量處于較低水平，不利于其抵抗低溫脅迫，費烏瑞它-4 ℃時的脯氨酸含量較4 ℃時脯氨酸含量降幅較大且脯氨酸含量處于較低水平，抗低溫脅迫能力較差。

2.1.2 對可溶性糖含量的影響 可溶性糖是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。由表1 和圖2 可知，處理前并薯6 號的可溶性糖含量最高，其次依次是冀張薯12 號和大西洋，費烏瑞它和克新1 號的可溶性糖含量相對較少。4 ℃處理后，不同品種馬鈴薯可溶性糖含量整體呈現(xiàn)增加的趨勢，說明了低溫脅迫下，6 種不同品種馬鈴薯在4 ℃條件下通過可溶性糖的合成與積累來抵抗低溫；此時，并薯6 號的可溶性糖含量最高，但是相較于對照組有少量的下降，其原因可能是由于此溫度未能達到對該品種馬鈴薯脅迫的水平，還未啟動應對低溫脅迫的生理機制；其余品種中的可溶性糖含量較對照組均有不同程度的增加，其中，大西洋和費烏瑞它的可溶性糖含量增幅較大，但費烏瑞它的可溶性糖含量仍較低。-4 ℃時，6 個不同品種馬鈴薯的可溶性糖含量繼續(xù)增加，說明在-4 ℃時各個品種的馬鈴薯仍能通過合成更高濃度的可溶性糖來抵抗低溫；此時，6 個不同品種馬鈴薯的可溶性糖含量大小表現(xiàn)為并薯6 號＞冀張薯12 號＞晉薯16 號＞克新1 號＞大西洋＞費烏瑞它，并薯6 號和克新1 號較4 ℃時的可溶性糖含量增幅較大，其次是冀張薯12 號和晉薯16 號，大西洋和費烏瑞它的增幅不明顯。并薯6 號在未處理時與低溫處理后可溶性糖含量均處于最高水平，具有一定的抗脅迫能力，冀張薯12 號與晉薯16 號在4、-4 ℃時可溶性糖含量表現(xiàn)出持續(xù)升高且維持在較高水平，具有較高的抗低溫脅迫能力，其次是大西洋和克新1 號，-4 ℃時費烏瑞它的可溶性糖含量最低，表明其抵抗低溫脅迫的能力較低。

2.1.3 對CAT 活性的影響 CAT 具有清除植物體內(nèi)過氧化氫的能力，是植物耐寒性鑒定的一個重要指標。從圖3 和表2 可以看出，處理前冀張薯12 號的CAT 活性最高，其次是大西洋，費烏瑞它的CAT活性最低。4 ℃處理后，6 種馬鈴薯的CAT 活性均呈現(xiàn)增加趨勢，此時晉薯16 號的CAT 活性最高，并薯6 號與晉薯16 號不存在顯著性差異，費烏瑞它的CAT 活性仍為最低。-4 ℃處理后，除并薯6 號CAT 活性較4 ℃有小幅度降低外，其余品種馬鈴薯組織CAT活性均呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢，冀張薯12 號CAT 活性最高，其次是晉薯16 號，顯著高于其余4 個品種（P＜0.05），大西洋與克新1 號CAT 活性存在顯著性差異，且大西洋CAT 活性顯著高于克新1 號（P＜0.05）。低溫脅迫可增強6 個不同品種馬鈴薯組織CAT酶活性，冀張薯12 號與晉薯16 號在4、-4 ℃均具有較高的CAT 酶活性，不同品種馬鈴薯的CAT 酶活性對低溫脅迫響應的方式存在差異。

表2 不同溫度下6 種馬鈴薯組織中保護酶活性變化

2.1.4 對過氧化物酶（POD）活性的影響 從圖4可以看出，POD 可以清除植物體內(nèi)過氧化物，可作為植物抗氧化能力的一個重要指標。未處理之前，晉薯16 號的POD 活性最高，冀張薯12 號與晉薯16 號之間不存在顯著性差異，其次是大西洋，并薯6 號和克新1 號的POD 酶活性較低，費烏瑞它的POD 酶活性最低。4 ℃處理后，克新1 號與并薯6 號的酶活性明顯增加，晉薯16 號和費烏瑞它的POD酶活性出現(xiàn)小幅增加，冀張薯12 號和大西洋POD酶活性出現(xiàn)小幅降低。-4 ℃處理后，冀張薯12 號、大西洋、晉薯16 號的POD 活性較對照處理明顯增強并達到峰值，表明低溫誘導可顯著增強POD 活性，增強上述3 個品種馬鈴薯耐低溫脅迫能力，并薯6 號和費烏瑞它的POD 酶活性與對照組相比出現(xiàn)了下降，難以更有效地清除組織內(nèi)過氧化物來適應低溫環(huán)境。低溫可使供試的6 個不同品種的馬鈴薯POD 酶活性出現(xiàn)增強，但是，不同品種馬鈴薯的POD 活性對低溫脅迫響應的方式不同。

2.2 馬鈴薯抗寒品種綜合評價

植物抗寒性是一個比較復雜的過程，用某個單一指標評價植物的耐寒性十分局限，采用多個指標綜合評價更能相對準確全面地反映植物的耐寒性[17]。參照王麗等[18]的研究方法，采用隸屬函數(shù)法對低溫脅迫下各品種馬鈴薯各項生理指標進行綜合分析，評價6 種馬鈴薯的抗寒性，可相對準確地反映植物抗寒的整體表現(xiàn)。

本研究采用隸屬函數(shù)的方法，對Pro 含量、可溶性糖含量、CAT 活性、POD 活性4 個冷脅迫響應相關指標進行了綜合分析，結果顯示（表3），6 個不同品種馬鈴薯耐寒性依次為冀張薯12 號＞并薯6號＞晉薯16 號＞克新1 號＞大西洋＞費烏瑞它。

表3 不同品種馬鈴薯耐寒性綜合評價

3 結論與討論

植物細胞中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物抵御冷脅迫中起著十分重要的作用，本研究選取了游離脯氨酸和可溶性糖2 個滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)作為6 個不同品種馬鈴薯脫毒組培苗抗寒性的指標。低溫脅迫時，植物可通過合成并積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)降低水勢，減少水分的散失從而提高耐寒能力。本研究結果顯示，低溫處理條件下，6 種馬鈴薯的脯氨酸和可溶性糖含量均有所增加，體現(xiàn)了對低溫脅迫的抗性[10]。不同品種馬鈴薯對低溫脅迫的響應有所不同，即脯氨酸和可溶性糖積累量的峰值出現(xiàn)時間不一致。低溫脅迫后，馬鈴薯幼苗組織游離脯氨酸的升降趨勢與白淼等[19]研究結果一致。馬英等[20]研究認為，低溫脅迫發(fā)生時，細胞滲透物積累量多的植物耐寒性相對較強，反之耐低溫能力較弱。本研究中，并薯6 號、冀張薯12 號、晉薯16 號在低溫脅迫條件下脯氨酸和可溶性糖含量均處于較高水平，表明這3 個馬鈴薯品種耐寒性相對較強。

CAT 和POD 這2 種抗氧化酶在植物體內(nèi)十分關鍵，可以對其體內(nèi)活性氧自由基進行有效的去除，以此來提高植物抵抗非生物脅迫即低溫脅迫[19]。本研究表明，低溫脅迫條件下，馬鈴薯的酶促防御系統(tǒng)啟動并活化，CAT 活性和POD 活性較對照組均出現(xiàn)不同程度的增加，4 ℃低溫脅迫時，耐寒品種冀張薯12 號、并薯6 號、和晉薯16 號的CAT 活性顯著高于不耐寒品種，這與秦文斌等[21]研究結果一致。-4 ℃低溫處理后，冀張薯12 號的2 種酶活性仍然保持最高水平，晉薯16 號的2 種酶活性也比較高，表現(xiàn)出較強的耐寒性。本研究結果顯示，低溫脅迫后，6 個馬鈴薯品種POD 活性整體上呈現(xiàn)先上升再下降或持續(xù)上升趨勢，未呈現(xiàn)一定的正相關或負相關，這與丁紅映等[22]研究結果一致。

植物耐低溫脅迫能力是多基因調(diào)控的復雜調(diào)控機制，僅靠酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等某個單一指標不能全面地評價6 種馬鈴薯抗寒性[20]。隸屬函數(shù)分析法是一種常用的植物抗逆性綜合評價方法，此法運用模糊數(shù)學原理對植物抗逆性進行綜合評價，目前已成功應用于馬鈴薯、高原喬木、葡萄等多種植物的抗逆性綜合評價[18-19]。本研究采用隸屬函數(shù)法對6 個不同品種馬鈴薯脫毒組培苗的4 種抗寒相關指標進行耐寒性綜合分析，得到耐寒性量化結果，6 個參試馬鈴薯耐寒性強弱排序依次為冀張薯12 號＞并薯6 號＞晉薯16 號＞克新1 號＞大西洋＞費烏瑞它。