“高粱不育系Tx623A×蘇丹草Sa”RIL 群體農(nóng)藝性狀的QTL 定位

王麗華，陸葉飛，陸以靜，劉言龍，李杰勤

（安徽科技學院農(nóng)學院，安徽鳳陽 233100）

高丹草作為高粱×蘇丹草雜交種（Sorghum bicolor×Sorghum sudanense），是一種以收獲莖稈、葉片為主的飼用作物[1]。我國高丹草遺傳研究從20 世紀90 年代陳才夫等[2]開始蘇丹草×擬高粱種間雜種的細胞學分析，到現(xiàn)在多個遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及性狀定位等[3-5]，已取得了一些成就。

株高、穗長、分蘗、莖粗、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量等性狀是與產(chǎn)量緊密相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀，這些性狀的QTL（Quantitative Trait Locus）定位已在水稻[6]、玉米[7]、小麥[8]、大豆[9]、油菜[10]、高粱[11]、花生[12]等作物中有相關(guān)研究，但高丹草相關(guān)農(nóng)藝性狀QTL 定位研究較少，于肖夏等[13]以170 個F2單株為作圖群體，利用50 對SSR 引物構(gòu)建了高丹草分子遺傳圖譜，并對莖粗、葉寬等8 個性狀進行QTL定位。石悅等[3-4]利用305 個F2分離單株和444 個AFLP 標記構(gòu)建了高丹草分子遺傳圖譜，并對莖粗、葉片數(shù)、分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀進行了QTL 定位分析。房永雨等[5]利用高丹草F2分離群體構(gòu)建了包含284 個AFLP 標記的分子遺傳圖譜，并對氫氰酸、單株干質(zhì)量、株高等10 個性狀進行QTL 定位分析。LU 等[14]利用248 株F2∶3單株構(gòu)建了包含178 個標記（170 個AFLP，8 個RAPD）的高丹草分子遺傳圖譜，并對株高、莖粗、葉片數(shù)等10 個農(nóng)藝性狀進行QTL定位。

本研究利用在親本間具有多態(tài)性的138 個SSR 標記對株高、莖粗、穗長、分蘗數(shù)、單株鮮質(zhì)量、單株干質(zhì)量6 個農(nóng)藝性狀進行QTL 定位，構(gòu)建高丹草RIL 群體遺傳圖譜，對高丹草分子標記輔助選擇育種具有指導意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以高粱不育系Tx623A 為母本、蘇丹草恢復系Sa為父本[15]和雜交F9的126 個RIL 群體為試驗材料。

1.2 試驗方法

試驗在安徽省鳳陽縣安徽科技學院進行。于2018 年5 月20 日種植，小區(qū)采用隨機區(qū)組排列，種植密度為50 cm×25 cm，每行10 株，3 次重復，常規(guī)田間管理。

1.2.1 農(nóng)藝性狀測定 植株成熟后親本和126 個RIL 群體株系分別隨機選取5 株測定株高、莖粗、穗長、分蘗數(shù)、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量[16]。

1.2.2 DNA 提取和SSR 標記分析 采用SDS（十二烷基硫酸鈉）法[17]提取父母本（各2 株）和126 株RIL群體株系的植株葉片，通過實驗室現(xiàn)有的1050 個SSR 標記對親本進行多態(tài)性篩選。PCR 反應(yīng)體系如表1 所示，PCR 程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min 結(jié)束。利用濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。銀染后讀膠，母本帶型記作“1”，父本帶型記作“2”，雜合帶型記作“3”，缺失記作“-”。

表1 PCR 擴增反應(yīng)體系

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過Joinmap 4.0 軟件來構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。第一步：建立數(shù)據(jù)文件，將Loc 文件轉(zhuǎn)到Joinmap 狀態(tài)下。第二步：利用LOD Groupings 命令分組，LOD 值默認為2～10。使用Greate Groups for mapping 命令作圖，通過Kosambi 函數(shù)計算遺傳圖譜的距離[18]，使用QTL IciMapping 4.0 軟件定位產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL 位點。QTL 命名方法：q+性狀英文首字母+所在染色體。

2 結(jié)果與分析

2.1 RIL 群體6 個農(nóng)藝性狀表型值分布特征

對親本和RIL 群體的6 個農(nóng)藝性狀表型進行比較分析（表2），RIL 群體的平均株高為（133.92±48.05）cm，高于母本Tx623A 的株高，但低于父本株高和雙親平均株高；莖粗的平均值為（14.72±2.58）mm，遠低于母本Tx623A，且低于雙親莖粗的平均值；單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量均低于雙親的單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量；穗長低于雙親穗長均值；分蘗數(shù)高于母本Tx623A，但遠低于雙親分蘗數(shù)均值。株高、莖粗、穗長、分蘗數(shù)、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量6 個農(nóng)藝性狀的偏度和峰度都不大，均呈連續(xù)性正態(tài)分布，適合進行QTL 定位分析。

表2 RIL 群體及親本農(nóng)藝性狀的測定結(jié)果

2.2 RIL 群體農(nóng)藝性狀相關(guān)性分析

對6 個農(nóng)藝性狀進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明（表3），除莖粗外，株高、穗長、分蘗數(shù)與其他4 個性狀均呈極顯著正相關(guān)。株高和單株鮮質(zhì)量、單株干質(zhì)量、穗長、分蘗數(shù)均呈極顯著正相關(guān)，其中，株高與單株鮮質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)最大（r＝0.645）；單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量、穗長、分蘗數(shù)呈極顯著正相關(guān)，其中，單株鮮質(zhì)量與單株干質(zhì)量相關(guān)系數(shù)最大（r＝0.571）；單株干質(zhì)量和穗長、分蘗數(shù)呈極顯著正相關(guān)。莖粗和株高、穗長、分蘗數(shù)呈負相關(guān)。

表3 RIL 群體6 個農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析

2.3 RIL 群體的分子遺傳圖譜構(gòu)建

用1 050 個SSR 標記進行親本間的多態(tài)性篩選。經(jīng)鑒定共有192 對引物能擴增出清晰的條帶且在2 個親本間表現(xiàn)多態(tài)，多態(tài)性比例為18.29%。以篩選出的多態(tài)性引物對RIL 群體進行PCR 擴增和檢測（圖1），其中138 對引物成功用于構(gòu)建連鎖圖譜。構(gòu)建的遺傳圖譜總長度為1 606.7 cM，標記間平均距離為11.6 cM（圖2）。1 號染色體上的標記最多，共有31 個；9 號染色體上的標記最少，僅有6 個。

2.4 重要農(nóng)藝性狀的QTL 分析

由表4 可知，本研究共檢測到60 個QTL 位點，解釋14.05%～68.58%的表型差異。其中，控制株高的QTL 位點有4 個，分別位于4、5、6 號染色體上，可以解釋24.75%～33.59%表型變異，LOD 值為4.56～5.60；qPH-5 位于5 號染色體，定位于S59-GS321 之間，其加性效應(yīng)為正值（5.47），表型貢獻率為27.02%，其他位點加性效應(yīng)均為負值。控制穗長的QTL 位點有27 個，單個QTL 解釋14.05%～68.58%表型變異，LOD 值為4.57～31.73。qEL-1 位于1 號染色體，定位于GS53-GS93 之間，加性效應(yīng)為正值，表型貢獻率為68.58%；qEL-5 位于5 號染色體，定位于S15-S56 之間，加性效應(yīng)為正值（11.88），表型貢獻率為29.40%?？刂品痔Y數(shù)的QTL 位點有1 個，位于5 號染色體，定位于S15-S56 之間，該位點表現(xiàn)出負加性效應(yīng)，表型貢獻率為30.39%。控制單株鮮質(zhì)量的QTL 位點有13 個，單個QTL 解釋17.69%～36.40%表型變異，LOD 值為4.52～8.18?？刂茊沃旮少|(zhì)量的QTL 位點有15 個，單個QTL 解釋20.32%～30.48%表型變異，LOD 值為5.15～9.77，單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量均表現(xiàn)負加性效應(yīng)。未檢測到控制莖粗的QTL 位點。

表4 RIL 群體的QTL 分析

續(xù)表4

更重要的是，8 個QTL 位點同時控制多個農(nóng)藝性狀。5 號染色體的S15-S56 區(qū)間控制穗長、分蘗數(shù)、單株干質(zhì)量和單株鮮質(zhì)量。3 號染色體的S248-S9 區(qū)間控制穗長、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量。3 號染色體的S250-S11 區(qū)間、8 號染色體的TXP354-RAD8-4 區(qū)間、10 號染色體的S79-TXP129 區(qū)間，均控制穗長和單株干質(zhì)量。1 號染色體的GS57-TXP204 區(qū)間控制單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量。5 號染色體的S56-GS325 區(qū)間控制株高和穗長。6 號染色體的S236-TXP104 區(qū)間控制株高和單株鮮質(zhì)量。

3 結(jié)論與討論

皖草3 號是由母本高粱不育系Tx623A 和父本恢復系蘇丹草Sa 雜交而成，它既有高粱抗旱、耐澇、耐鹽堿和產(chǎn)量高的特征，又有蘇丹草適口性好、抗逆性強、分蘗能力強、營養(yǎng)價值高的特點[19]。皖草3 號根系發(fā)達，莖稈粗壯，穗形松散，草質(zhì)柔軟，氰化物含量低，單株長勢強，適應(yīng)范圍廣，是通過全國牧草品種審定委員會審定的品種[15]，在農(nóng)區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中具有很好的應(yīng)用前景[20]。

SSR 標記因其數(shù)量豐富，提供信息量大等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建與目標基因定位等研究中[18，21-23]。利用SSR 標記構(gòu)建高粱遺傳圖譜及QTL定位已有成功應(yīng)用，董維等[24]利用T70×P607 雜交F6的RIL 群體和81 對SSR 標記構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，并在第1、2、4、5、6 號染色體上檢測到7 個與分蘗數(shù)相關(guān)的QTL。王成等[25]利用63 對SSR 標記和TAM428×Tx622B 的220 個F2單株構(gòu)建了高粱抗蚜性狀的遺傳連鎖圖，并發(fā)現(xiàn)了1 個主效QTL。盧峰等[26]利用98 個SSR 標記和28 個INDEL 標記，定位了19 個與甜高粱莖汁混合錘度、莖稈質(zhì)量和出汁率性狀的相關(guān)QTL。但高丹草作為一種優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強的牧草，利用SSR 標記進行高丹草遺傳圖譜構(gòu)建和QTL 定位的相關(guān)研究很少，于肖夏等[13]利用50 對SSR 引物建立了包含10 個連鎖群，總長度為803.13 cM的高丹草遺傳連鎖圖；石悅等[27]利用10 對SSR 引物和11 對SRAP 引物構(gòu)建了包括10 個連鎖群，總長度為1 273.4 cM的遺傳連鎖圖。本研究利用138 對SSR 引物對Tx623A、Sa雜交的F9126 個RIL 群體構(gòu)建的高丹草遺傳連鎖圖譜包含10 個連鎖群，總長度為1 606.7 cM，標記間平均距離為11.6 cM的高丹草遺傳圖譜，共定位了60 個與株高、莖粗、穗長、分蘗數(shù)、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量相關(guān)的QTL。

其中控制株高的QTL 主要分布于4、5、6 號染色體上，與于肖夏等[13]和LU 等[14]定位的株高QTL相比，本研究定位的5、6 號染色體上的3 個位點均為新位點，其表型貢獻率均較高（分別為24.75%、27.02%和27.76%），可能為該性狀的主效位點。本研究中控制分蘗數(shù)的QTL 位于5 號染色體上，與于肖夏等[13]研究結(jié)果一致。穗長QTL 在10 條染色體均有分布，其中1 號染色體位于GS53-GS93 區(qū)間的QTL 位點貢獻率達68.58%，說明該位點為該性狀的主效位點，可進一步進行驗證和功能研究。單株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量QTL 在除4 號染色體的9 條染色體上均有分布，而LU 等[14]只在1、3、6、7、9 號染色體上檢測到相關(guān)QTL 12 個。莖粗性狀可能由于標記數(shù)量較少或標記分布不夠均勻，QTL 定位并沒有關(guān)聯(lián)到相關(guān)位點，在后續(xù)研究中將加大標記密度或根據(jù)參考基因組設(shè)計新的引物再次定位。本研究中5 號染色體的S15-S56 區(qū)間為多效性位點，同時控制株高、穗長、分蘗數(shù)、單株干質(zhì)量和單株鮮質(zhì)量5 個性狀。在1、3、8、10 號染色體上也存在多效性位點，這可能是“一因多效”或多個基因間緊密連鎖造成的[28]。本研究中60 個QTL 位點只有3 個是正向加性效應(yīng)，說明RIL 群體的這6 個農(nóng)藝性狀的雜種優(yōu)勢主要來自于父本Sa。

本研究構(gòu)建了“高粱×蘇丹草”SSR 分子遺傳圖譜，總長度為1 606.7 cM，包含10 個連鎖群，標記間平均距離為11.6 cM。對株高、莖粗、穗長、分蘗數(shù)、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量性狀進行QTL 定位分析；共定位了60 個QTL 位點，控制株高的4 個QTL，對表型的貢獻率為24.75%～33.59%，控制穗長的27 個QTL 對表型的貢獻率為14.05%～68.58%，控制分蘗數(shù)的1 個QTL 對表型的貢獻率為30.39%，控制單株鮮重的13 個QTL 對表型的貢獻率為17.69%～36.40%，控制單株干重的15 個QTL 對表型的貢獻率為20.32%～30.48%，旨在為分子標記輔助高丹草高產(chǎn)育種奠定基礎(chǔ)。