大車前苷對(duì)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)小鼠急性高尿酸血癥模型的影響

楊海艷，曾慶雅，歐陽(yáng)香，王 陸，郭敏俠，李娜芝，程虹毓，朱繼孝

(江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心，江西 南昌 330004)

高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)是尿酸生成增加或者排泄減少?gòu)亩鴮?dǎo)致體內(nèi)尿酸高于正常值的代謝性疾病[1]，是導(dǎo)致痛風(fēng)的主要原因。誘發(fā)HUA的因素主要有兩個(gè)，(1)尿酸來(lái)源增加，這主要與黃嘌呤氧化酶、次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶等物質(zhì)有關(guān)；(2)尿酸排出減少，主要與腎臟組織的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體有關(guān)[2]。氧嗪酸鉀(postassium oxonate,OA)是一種典型的尿酸酶抑制劑，可通過(guò)抑制尿酸酶活性來(lái)阻斷尿酸降解，從而導(dǎo)致血尿酸水平升高[3]。現(xiàn)階段，治療HUA的藥物主要包括以下幾類，分別為黃嘌呤氧化酶抑制劑(別嘌呤醇、非布索坦等)、尿酸氧化酶類似物(拉布立酶等)、URAT1抑制劑(丙磺舒、苯溴馬隆等)，其中別嘌呤醇和非布索坦被認(rèn)為是治療普通痛風(fēng)患者的一線藥物[4]。雖療效較佳，但其易引起肝腎損害等毒副作用，不適合長(zhǎng)期服用[5]，因此，尋找更為安全有效的抗HUA藥物已成為世界醫(yī)藥科技研究者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

大量文獻(xiàn)報(bào)道，大車前苷PMS(plantamajoside,PMS)具有很高的藥用價(jià)值及廣泛的藥理作用，如可通過(guò)抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)而抑制LPS的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[6]，還可通過(guò)抑制肝星狀細(xì)胞的活化而在肝臟中發(fā)揮抗纖維化作用[7]，近期研究表明PMS還可通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平及PI3K/AKT信號(hào)通路的激活來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。課題組前期研究[9]表明藏藥短穗兔耳草提取物能降低高尿酸血癥小鼠尿酸水平，并對(duì)藏藥短穗兔耳草的化學(xué)成分進(jìn)行了探索，短穗兔耳草經(jīng)一系列萃取處理后，從中鑒定出PMS[10]，且分別對(duì)17個(gè)批次短穗兔耳草進(jìn)行了含量測(cè)定，PMS含量最高可達(dá)1.29%，平均含量為0.75%，PMS是藏藥短穗兔耳草的主要有效成分之一，因此本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上基于TLR/MyD88/NF-κB和NLRP3信號(hào)通路和腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的變化，檢測(cè)小鼠腎組織轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT9、OAT1、URAT1水平以及肝臟“TLR/MyD88/NF-κB”信號(hào)通路中蛋白TLR4、TLR2、MyD88、NF-κB和NOD樣信號(hào)通路中受體蛋白NLRP3及炎癥因子IL-1β的表達(dá)水平，以期獲得短穗兔耳草降尿酸可能的活性成分與作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性昆明種小鼠60只，體質(zhì)量(18-22)g，合格證號(hào)：SCXK(贛)2018-0003，購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心。自由進(jìn)水進(jìn)食，飼養(yǎng)室溫度為25 ℃左右，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑大車前苷(成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)PRF20081722，98%)；Allopurinol(Sigma公司，批號(hào)081M1112V)；Allantoxanic Acid Potassium Salt(Sigma公司，批號(hào)ST-BD5759V)；羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)F20101222)；尿酸、尿素氮、腺苷脫氨酶、黃嘌呤氧化酶檢測(cè)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20200921、20200909、20200924、20201023)；小鼠IL-1β、TNF-α ELISA測(cè)試盒(欣博盛生物有限公司，批號(hào)如下：M2010001-001a、M2010003-102a)；MyD88、NF-κB、NLRP3、TLR2、IL-1β、TLR4、Anti-OAT1、Anti-GLUT9抗體(英國(guó)abcam公司，批號(hào)分別為ab2064、ab16502、ab214185、ab213676、ab9772、ab217274、ab135924、ab223470)；Anti-URAT1一抗(武漢proteintech公司，批號(hào)為14937-1-AP)；二抗(武漢proteintech公司，批號(hào)為SA00001-2)；GAPDH(武漢proteintech公司，批號(hào)10494-1-AP)。

1.4 動(dòng)物分組、造模及給藥選取60只昆明種雄性小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)均分為6組：空白組：0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，模型組：450 mg·kg-1OA(混懸于0.5% CMC-Na)，陽(yáng)性組：450 mg·kg-1OA+10 mg·kg-1別嘌呤醇(混懸于0.5% CMC-Na)，PMS低劑量組：450 mg·kg-1OA+15 mg·kg-1PMS，PMS中劑量組：450 mg·kg-1OA+30 mg·kg-1PMS、PMS高劑量組：450 mg·kg-1OA+60 mg·kg-1PMS(PMS溶于水，使用超純水配制)，給予普通飼料、純水，自由飲食。本實(shí)驗(yàn)采用預(yù)防性給藥聯(lián)合造模后給藥方式，以上各組連續(xù)給藥7 d，每天1次，最后一次給藥之前0.5 h注射450 mg·kg-1OA至小鼠腹腔造成HUA模型，并禁食。造模1 h后，小鼠眼眶采血，于5 000 r·min-1離心10 min，取其上清液置于4 ℃冰箱待用，立即于冰臺(tái)上取出小鼠一側(cè)腎臟和肝臟，-80 ℃冰箱貯存待測(cè)，摘取小鼠另一側(cè)全腎組織，用4%多聚甲醛溶液固定。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1血清尿酸的測(cè)定 參照小鼠尿酸試劑盒使用說(shuō)明，檢測(cè)各組小鼠血清中尿酸表達(dá)水平。

1.5.2血清尿素氮的測(cè)定 參照小鼠尿素氮試劑盒使用說(shuō)明，檢測(cè)各組小鼠血清中尿素氮表達(dá)。

1.5.3血清腺苷脫氨酶活性的測(cè)定 根據(jù)小鼠腺苷脫氨酶試劑盒使用說(shuō)明，檢測(cè)各組小鼠血清中腺苷脫氨酶活性。

1.5.4肝組織黃嘌呤氧化酶活性的測(cè)定 參照小鼠黃嘌呤氧化酶試劑盒操作說(shuō)明，檢測(cè)各組小鼠肝組織中黃嘌呤氧化酶活性。

1.5.5ELISA法檢測(cè)血清中IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平 參照小鼠IL-1β、TNF-α試劑盒使用說(shuō)明，檢測(cè)各組小鼠血清中IL-1β 和TNF-α 水平。

1.5.6Western blot法檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)小鼠腎組織GLUT9、URAT1、OAT1蛋白的表達(dá)與肝組織TLR4、TLR2、NLRP3、NF-κB、MyD88、IL-1β蛋白的表達(dá)。

1.5.6.1 腎臟組織蛋白提取 提取小鼠腎臟皮質(zhì)刷狀緣膜(BBMV)蛋白及腎臟皮層蛋白，于1.5 mL EP管中，加入2% SDS 裂解液1 mL，制成腎組織勻漿室溫放置20 min待裂解充分，室溫1 000×g離心15 min，得上清液，100 ℃變性15 min，測(cè)定所有樣本的蛋白濃度(BCA試劑盒)，計(jì)算濃度并稀釋一致后，制備樣品進(jìn)行常規(guī)上樣電泳(電泳條件80 V、30 min，120 V、1 h)，電泳完后于有轉(zhuǎn)膜液的轉(zhuǎn)膜槽中轉(zhuǎn)膜(250 mA，90 min)，轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜浸泡于5%的脫脂牛奶中室溫?fù)u床封閉2 h，洗膜3次(使用1×TBST)，共30 min，浸沒(méi)于一抗中，于4 ℃冰箱搖床孵育過(guò)夜，一抗的稀釋比例如下(TLR2，1 ∶1 000；TLR4，1 ∶1 000；NLRP3，1 ∶1 000；NF-κB，1 ∶2 000；MyD88，1 ∶1 000；IL-1β，1 ∶1 000；GAPDH，1 ∶5 000)，所有抗體用3% BSA稀釋，d 2取出洗膜后于水平搖床上二抗(稀釋比1 ∶5 000)孵育1 h，洗膜，ECL顯色。

本研究以海南11家高星級(jí)酒店為研究對(duì)象，從酒店經(jīng)營(yíng)者的角度出發(fā)，探討社交媒體營(yíng)銷對(duì)高星級(jí)酒店的影響。根據(jù)采訪數(shù)據(jù)顯示，酒店經(jīng)營(yíng)者普遍認(rèn)為社交媒體的出現(xiàn)和發(fā)展是互聯(lián)網(wǎng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的必然產(chǎn)物，將社交媒體納入到酒店?duì)I銷體系里能為酒店的經(jīng)營(yíng)帶來(lái)極大的好處。大多數(shù)受訪者認(rèn)為社交媒體平臺(tái)在酒店和消費(fèi)者之間創(chuàng)造了一種紐帶關(guān)系。而這種紐帶關(guān)系又為將來(lái)的購(gòu)買關(guān)系打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。如果紐帶關(guān)系和購(gòu)買關(guān)系能夠一直保持良性循環(huán)，那么酒店顧客將有可能成為“意見(jiàn)領(lǐng)袖”，自愿為酒店代言，幫助酒店銷售其產(chǎn)品。

1.5.6.2 肝臟組織蛋白提取 剪60 mg小鼠肝臟放置1.5 mL的EP管內(nèi)，加1 mL 2%SDS裂解液，組織勻漿儀磨碎后室溫條件下靜置20 min充分裂解，然后于1 000×g離心15 min后取其上清液，后續(xù)操作同“1.5.6.1”，一抗的稀釋比例為(GLUT9，1 ∶1 000；URAT1，1 ∶1 000；OAT1，1 ∶500；GAPDH，1 ∶5 000)，二抗(稀釋比1 ∶5 000)。

1.5.7小鼠腎臟HE染色病理組織學(xué)檢測(cè) 把腎臟從4%多聚甲醛溶液中轉(zhuǎn)移出，切成小方塊，置于包埋盒內(nèi)，使用流水沖洗2 h，用梯度乙醇進(jìn)行脫水處理、石蠟浸蠟、包埋、切片、HE染色等步驟，于顯微鏡下觀察，采集圖像分析腎臟損傷情況。

2 結(jié)果

2.1 各組藥物對(duì)高尿酸血癥小鼠尿酸、尿素氮、腺苷脫氨酶水平的影響與正常組比較，模型組小鼠尿酸、尿素氮、腺苷脫氨酶水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性組小鼠尿酸水平明顯降低(P<0.01)，PMS中、高劑量組小鼠尿酸水平明顯降低(P<0.05)，PMS低、中劑量組小鼠尿素氮水平明顯下調(diào)(P<0.01)，PMS高劑量組小鼠尿素氮水平明顯降低(P<0.05)，陽(yáng)性組與PMS低劑量組小鼠腺苷脫氨酶水平明顯降低(P<0.01)，PMS中、高劑量組小鼠腺苷脫氨酶水平明顯降低(P<0.05)；與陽(yáng)性組比較，PMS低、中、高劑量組小鼠尿酸水平明顯上升(P<0.01)，正常組小鼠尿素氮水平明顯降低(P<0.05)，PMS低、中劑量組小鼠尿素氮水平明顯降低(P<0.01)，PMS低、中、高劑量組小鼠腺苷脫氨酶水平明顯上升(P<0.01或P<0.05)，見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Effects of different groups of drugs on serum UA,BUN, and ADA levels in hyperuricemia

2.2 各組藥物對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影響與正常組比較，模型組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，PMS中劑量組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶水平明顯降低(P<0.05)，陽(yáng)性組、PMS低劑量組、PMS高劑量組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶水平明顯降低(P<0.01)；與陽(yáng)性組比較，除模型組外，其他各組黃嘌呤氧化酶水平差異均無(wú)顯著性，見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Effects of different groups of drugs on liver XOD level

2.3 各組藥物對(duì)高尿酸血癥小鼠IL-1β、TNF-α的影響與正常組比較，模型組小鼠IL-1β、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性組、PMS低、中、高劑量組小鼠IL-1β明顯降低(P<0.05或P<0.01)，陽(yáng)性組、PMS中劑量組小鼠TNF-α水平明顯降低(P<0.05)；與陽(yáng)性組比較，除模型組外，各組IL-1β、TNF-α水平差異均無(wú)顯著性，見(jiàn)Tab 3。

Tab 3 Effects of different groups of drugs on liver IL-1β and TNF-α levels in hyperuricemia

2.4 腎臟病理組織學(xué)檢測(cè)選取各組小鼠的腎組織進(jìn)行病理切片檢查，結(jié)果如Fig 1所示，正常組腎小球結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯炎癥反應(yīng)；模型組腎小管周圍間質(zhì)有增生現(xiàn)象，有炎癥細(xì)胞發(fā)生聚集，腎小管出現(xiàn)擴(kuò)張現(xiàn)象；陽(yáng)性組腎小管的上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，腎小管擴(kuò)張的情況有所改善；PMS低劑量組腎小管間質(zhì)增生，有炎癥細(xì)胞聚集、腎小管出現(xiàn)擴(kuò)張；PMS中劑量組腎小管部分間質(zhì)增生，部分炎癥細(xì)胞聚集、部分腎小管擴(kuò)張有所改善；PMS高劑量組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，部分間質(zhì)輕微增生，少量炎癥細(xì)胞聚集、腎小管擴(kuò)張有所改善，圖中箭頭指出主要炎癥部位。

Fig 1 Renal tissue pathological sections of each drug group(×400)A:Normal;B:Model;C:Allopurinol;D:PMS-L (15 mg·kg-1);E:PMS-M (30 mg·kg-1);F:PMS-H (60 mg·kg-1)

2.5 大車前苷對(duì)高尿酸血癥小鼠TLR/MyD88/NF-κB、NLRP3信號(hào)通路及腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響如Fig 2所示，小鼠肝臟組織中，與正常組比較，模型組中的TLR4、TLR2、NLRP3、NF-κB、MyD88、IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性組、PMS低、中、高劑量組中的TLR4、TLR2、NLRP3、NF-κB、MyD88、IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01)。小鼠腎臟組織中，與正常組比較，模型組中的GLUT9、URAT1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，OAT1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性組、PMS低、中、高劑量組中的GLUT9蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05),OAT1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)，與陽(yáng)性組比較，PMS低劑量組中的NF-κB、IL-1β、OAT1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，PMS中劑量組中的OAT1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)，PMS高劑量組中的NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)、OAT1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)。

Fig 2 Expression of TLR4,TLR2,NLRP3,NF-κB,MyD88,and IL-1β proteins in liver tissues and GLUT9,URAT1,and OAT1 proteins in kidney tissues of mice in each groupA:Normal;B:Model;C:Allopurinol;D:PMS-L(15 mg·kg-1);E:PMS-M(30 mg·kg-1);F:PMS-H(60 mg·kg-1);#P<0.05,##P<0.01 vs normal;*P<0.05,**P<0.01 vs model.ΔP<0.05,ΔΔP<0.01 vs Allopurinol.

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要通過(guò)促進(jìn)尿酸的排泄和抑制尿酸生成兩個(gè)方面對(duì)治療痛風(fēng)做了大有裨益的研究。尿酸生成量異常增加會(huì)導(dǎo)致HUA，尿酸的排泄主要經(jīng)過(guò)腎臟組織，當(dāng)尿素氮水平升高時(shí)，通常反應(yīng)腎臟功能出現(xiàn)損傷，尿酸的排泄也會(huì)受到一定的影響[11]。腺苷脫氨酶在腺苷平衡及嘌呤代謝過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，可以間接調(diào)控尿酸的生成。當(dāng)腺苷脫氨酶活性增強(qiáng)時(shí)會(huì)造成尿酸的合成速度加快；相反，腺苷脫氨酶活性降低時(shí)可減少尿酸的生成[12]。尿酸主要是由于黃嘌呤與次黃嘌呤被黃嘌呤氧化酶催化而產(chǎn)生，則黃嘌呤氧化酶直接影響尿酸的生成[13]，此外，尿酸水平的升高會(huì)引起多種炎癥因子的改變，經(jīng)治療后，尿酸水平降低，炎癥因子也逐漸恢復(fù)正常[14]。

目前認(rèn)為，TLR-NLRP3信號(hào)通路和尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在痛風(fēng)方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體可增加尿酸的排泄[15]，“TLR/MyD88/NF-κB”信號(hào)通路系統(tǒng)和NLRP3信號(hào)通路是機(jī)體防御疾病的重要通路之一，其可以識(shí)別病原體相關(guān)模式從而介導(dǎo)非特異性免疫和獲得性免疫而參與炎癥、免疫等多種疾病的發(fā)生。其中，TLRs和MyD88對(duì)急性痛風(fēng)性炎癥反應(yīng)過(guò)程中是必需的[16]，尿酸鈉結(jié)晶可同時(shí)激活TLRs、IL-1R，然后與MyD88結(jié)合成復(fù)合物并活化相關(guān)激酶，使NF-κB等激活并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)后啟動(dòng)一系列炎性因子、趨化因子、粘附因子(如IL-1β、TNF-α等)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[17]；此外，NLRP3蛋白和caspase-1之間的連接體是凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)，研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3蛋白與ASC相互作用，可刺激caspase-1，形成炎性復(fù)合體，誘導(dǎo)其下游產(chǎn)物caspase-1、IL-1β、TNF-α的釋放，TLRs/MyD88/NF-κB信號(hào)通路與NLRP3炎性體可協(xié)同促進(jìn)IL-1β的表達(dá)，加速炎癥反應(yīng)[18]。

本研究在此基礎(chǔ)上基于TLR/MyD88/NF-κB、NLRP3信號(hào)通路及腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的變化，研究PMS抗HUA作用機(jī)制，結(jié)果顯示：PMS中、高劑量組能使小鼠尿酸水平降低(P<0.05)；PMS各劑量組均能明顯下調(diào)小鼠血清中尿素氮、腺苷脫氨酶水平及小鼠肝組織中黃嘌呤氧化酶水平(P<0.05或P<0.01)，表明PMS可通過(guò)下調(diào)尿酸、尿素氮、腺苷脫氨酶表達(dá)水平及小鼠肝組織中黃嘌呤氧化酶活性改善小鼠HUA；此外，PMS各劑量組小鼠血清中IL-1β明顯降低(P<0.05或P<0.01)，PMS中劑量組小鼠血清中TNF-α水平明顯降低(P<0.05)。表明PMS可以通過(guò)抑制IL-1β、TNF-α水平改善小鼠HUA。本實(shí)驗(yàn)還釆用Western blot檢測(cè)HUA小鼠腎臟組織GLUT9、URAT1、OAT1蛋白的表達(dá)與肝臟組織TLR4、TLR2、NLRP3、NF-κB、MyD88、IL-1β蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示PMS各劑量組均能明顯降低小鼠肝臟中TLR4、TLR2、NLRP3、NF-κB、MyD88、IL-1β水平(P<0.05或P<0.01)；PMS各劑量組均能明顯降低小鼠腎臟中GLUT9水平(P<0.05),可明顯升高OAT1水平(P<0.01)，結(jié)果表明PMS可通過(guò)降低腎組織尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT9水平、升高OAT1水平、下調(diào)TLR/MyD88/NF-κB、NLRP3信號(hào)通路中TLR4、TLR2、NLRP3、NF-κB、MyD88、IL-1β蛋白表達(dá)水平而起到降尿酸作用。

綜上所述，PMS對(duì)OA誘導(dǎo)的急性HUA小鼠會(huì)產(chǎn)生一定保護(hù)作用，其發(fā)揮作用的分子機(jī)制與調(diào)節(jié)腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和TLR/MyD88/NF-κB、NLRP3炎癥通路密切相關(guān)。