二十五味肺病丸改善斑馬魚微血管功能障礙及機(jī)制的探究*

強(qiáng)巴 ，郭勝亞 ，陳倫舉 ，徐懿喬 ，李峰

（1.西藏奇正藏藥股份有限公司，拉薩 850030；2.杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，杭州 310051）

1954年第一屆國(guó)際微循環(huán)會(huì)議正式提出了“微循環(huán)”這一概念[1]，是指微動(dòng)脈和微靜脈之間的血液循環(huán)。健全的微循環(huán)功能是機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)的重要前提。微血管的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、功能和血流動(dòng)力學(xué)的破壞如血栓、血管內(nèi)皮受損、心輸出量病理性減少等危險(xiǎn)因素發(fā)生時(shí)，可導(dǎo)致微循環(huán)功能障礙，造成各器官組織營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)減少，代謝廢物的積累，引起細(xì)胞損傷和器官功能異常，嚴(yán)重者可危及生命。大量研究表明，微血管的功能異常導(dǎo)致的微循環(huán)功能障礙與肥胖、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等密切相關(guān)[2-4]。

二十五味肺病丸是始載于《四部醫(yī)典》的經(jīng)典名方，其主要成分為獐牙菜、紅花、檀香、牛黃、懸鉤木、沙棘膏、訶子等25味藥材，是傳統(tǒng)藏藥理論與現(xiàn)代制藥技術(shù)相結(jié)合研發(fā)出的新型藏藥，藥物性質(zhì)更加穩(wěn)定，具有口服順應(yīng)性好，生物利用度高的特點(diǎn)。主要用于各種肺病引起的咳嗽，胸脅痛，呼吸急促，等呼吸道疾病[5-8]。有研究表明，二十五味肺病丸能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能、增強(qiáng)腸道蠕動(dòng)等作用[9]。二十五味肺病丸中含有紅花等具有止血、養(yǎng)血、促進(jìn)新組織再生的成分，并且能夠全面消除肺部毒素，修復(fù)呼吸道損傷，因此在肺部炎癥改善方面有較好的療效，考慮到心血管系統(tǒng)尤其是微循環(huán)在改善炎癥和組織新生中的關(guān)鍵作用，推測(cè)二十五味肺病丸是否參與改善微血管功能。本研究發(fā)現(xiàn)，二十五味肺病丸能夠增加血栓斑馬魚心輸出量和血流速度，改善斑馬魚辛伐他汀誘發(fā)的微血管缺失，促進(jìn)微血管再生，并且能夠減少內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，降低血栓的發(fā)生率，為二十五味肺病丸的臨床應(yīng)用提供了藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 野生型AB品系斑馬魚，轉(zhuǎn)基因血管熒光斑馬魚，以上斑馬魚均飼養(yǎng)于28℃的養(yǎng)魚用水中，以自然成對(duì)交配方式進(jìn)行繁殖，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2012-0171，飼養(yǎng)管理符合國(guó)際AAALAC認(rèn)證的要求。

1.2 藥物與試劑 二十五味肺病丸［奇正（北京）傳統(tǒng)藏醫(yī)藥外治研究院有限公司，批號(hào)160901］；花生四烯酸（上海晶純實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)F1418031）；辛伐他?。|京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)04RUCQP）；普納替尼（美國(guó)Med Chem Express公司，批號(hào)13771）；阿司匹林，黃芪甲苷［阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號(hào) G1220028，G1325036］；二甲基亞砜，鄰聯(lián)茴香胺（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)D2650，D9143）。

1.3 儀器 AZ100電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（Nikon公司）；CP214精密電子天平（奧豪斯公司）；PB2084C型心跳血流分析系統(tǒng)SZX7（發(fā)過Viewpoint公司）；SZX7型解剖顯微鏡；TK-C1481EC型顯微鏡相連的相機(jī)（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 斑馬魚血栓模型及檢測(cè) 隨機(jī)選取180尾受精后3天（3dpf）的野生型AB系斑馬魚置于六孔板中（30尾/孔）。正常對(duì)照組給予溶劑對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照組給予阿司匹林（25 mg/L）；給藥組給予二十五味肺病丸27.8、83.3和250 μg/mL，其后除正常對(duì)照組外其余各組給予花生四烯酸干預(yù)1 h建立血栓模型，每組隨機(jī)取10尾斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)下錄制斑馬魚血流視頻，分析統(tǒng)計(jì)斑馬魚心輸出量（O）和血流速度（V），評(píng)價(jià)心輸出量增加作用和血流速度增加作用，以心輸出量和血流速度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分別評(píng)價(jià)其對(duì)花生四烯酸誘導(dǎo)血栓模型斑馬魚血流動(dòng)力學(xué)的改善作用。其微血管血流動(dòng)力學(xué)改善作用計(jì)算公式如下：

1）對(duì)心輸出量的影響：

2）對(duì)血流速度的影響：

2.2 微血管缺失模型及檢測(cè) 隨機(jī)選取180尾受精后24 h的轉(zhuǎn)基因血管熒光斑馬魚，置于六孔板中（30尾/孔）。正常對(duì)照組給予溶劑對(duì)照，模型組給予辛伐他?。?5 mg/mL）處理后，陽(yáng)性對(duì)照組給予黃芪甲苷（23.5 μg/mL），藥物組給予二十五味肺病丸27.8、83.3和250 μg/mL，處理2天后，每組隨機(jī)取10條斑馬魚在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚腸下血管、拍照并保存圖片。用尼康NIS-Elements D 3.10高級(jí)圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算斑馬魚腸下血管面積（S），以腸下血管面積的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義評(píng)價(jià)藥物對(duì)辛伐他汀誘發(fā)的斑馬魚微血管缺失的再生作用。對(duì)斑馬魚微血管缺失的再生作用計(jì)算公式如下：

2.3 斑馬魚血管內(nèi)皮損傷模型及檢測(cè) 隨機(jī)選取180尾5dpf轉(zhuǎn)基因血管熒光斑馬魚（30尾/孔）。正常對(duì)照組給予溶劑對(duì)照，模型組給予普納替尼處理后，陽(yáng)性對(duì)照組給予阿司匹林（45 μg/mL），藥物組給予二十五味肺病丸 27.8、83.3 和 250 μg/mL，24 h 后每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，拍照部位統(tǒng)一選取泄殖孔上方對(duì)應(yīng)的三根血管，利用尼康NIS-Elements D 3.10高級(jí)圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算斑馬魚體節(jié)間血管直徑（D）。以體節(jié)間血管直徑的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義評(píng)價(jià)不同藥物對(duì)普納替尼誘發(fā)的斑馬魚血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用。對(duì)斑馬魚血管內(nèi)皮損傷（直徑減?。┑谋Ｗo(hù)作用計(jì)算公式如下：

用鄰聯(lián)茴香胺染料進(jìn)行染色，每組斑馬魚在解剖顯微鏡下觀察記錄血栓發(fā)生尾數(shù)并拍照，計(jì)算各組斑馬魚血栓發(fā)生率（%），以血栓發(fā)生率評(píng)價(jià)不同藥物誘發(fā)的血管內(nèi)皮損傷所致血栓的保護(hù)作用。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間對(duì)比采用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 確定斑馬魚對(duì)二十五味肺病丸的最大耐受濃度 斑馬魚血栓建模成功后[10]，給予不同濃度的二十五味肺病丸，觀察斑馬魚的死亡情況。二十五味肺病丸濃度為125和250μg/mL時(shí)，斑馬魚未產(chǎn)生任何明顯的不良反應(yīng)，也未引起斑馬魚死亡，在500和1 000 μg/mL濃度下均誘發(fā)100%（30/30）斑馬魚心率和血流減慢，在1 500、2 000 μg/mL濃度下分別誘發(fā) 26.7%（8/30）和 100%（30/30）斑馬魚死亡（見表1）。因此確定血栓模型斑馬魚對(duì)二十五味肺病丸對(duì)的最大耐受濃度為250 μg/mL。

3.2 二十五味肺病丸改善斑馬魚微循環(huán)血流動(dòng)力學(xué) 與正常對(duì)照組（0.36 nL/s）相比，模型對(duì)照組斑馬魚心輸出量（0.11 nL/s）顯著下降，提示模型建立成功。與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照藥阿司匹林25 μg/mL濃度組、二十五味肺病丸27.8 μg/mL濃度組斑馬魚心輸出量明顯增加（0.11 vs 0.30 nL/s，P<0.001；0.11 vs 0.19 nL/s，P<0.05），心輸出量增加作用為76%和32%。通過進(jìn)一步檢測(cè)了二十五味肺病丸對(duì)血栓斑馬魚模型的血流速度的作用，與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照藥阿司匹林25 μg/mL濃度組、二十五味肺病丸27.8和83.3 μg/mL濃度組斑馬魚心輸出量明顯增加（398 vs 978 μm/s，P<0.001；398 vs 693 μm/s，P<0.001；398 vs 594 μm/s，P<0.05），血流速度增加百分比分別為74%、37%和25%，以上結(jié)果提示二十五味肺病丸能夠增加血栓斑馬魚心輸出量，加快血流速度，改善微循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)。見表2。

表2 二十五味肺病丸處理后斑馬魚血流動(dòng)力學(xué)定量結(jié)果

3.3 二十五味肺病丸促進(jìn)微血管再生 確定該模型中二十五味肺病丸的最大耐受濃度后[10]，進(jìn)一步檢測(cè)了二十五味肺病丸對(duì)微血管再生的影響。與正常組比較，微血管缺失模型組腸下血管面積明顯減少（P<0.001）。與模型對(duì)照組相比，二十五味肺病丸濃度為 0.11 μg/mL、0.33 μg/mL 和 1 μg/mL 組斑馬魚腸下血管面積顯著升高（P<0.001），對(duì)微血管再生的促進(jìn)作用分別為75%、78%和91%（P<0.001，見圖1、表3）。以上結(jié)果提示二十五味肺病丸能夠改善微血管損傷，促進(jìn)微血管的再生。

圖1 二十五味肺病丸對(duì)微血管再生的促進(jìn)作用表型圖

3.4 二十五味肺病丸改善血管內(nèi)皮損傷 確定最大耐受濃度和建模成功后[10]，進(jìn)一步檢測(cè)了各組斑馬魚節(jié)間血管直徑和血栓形成情況。與模型組（8.7像素）相比，二十五味肺病丸0.11、0.33和1μg/mL組節(jié)間血管直徑分別為10.2、11.5和11.8像素，對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用分別為29%、56%和61%（P>0.05、P<0.001、P<0.001，見表4）；同樣，與模型組血栓發(fā)生率（87%）相比，濃度為 28、83和 250 μg/mL 的二十五味肺病丸斑馬魚血栓發(fā)生率分別為73%、50%和33%，與模型對(duì)照組比較，各組P>0.05、P<0.01、P<0.001（見表5）。以上結(jié)果提示二十五味肺病丸能夠?qū)Π唏R魚血管內(nèi)皮損傷具有保護(hù)作用。

表4 二十五味肺病丸對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用-節(jié)間血管直徑

表5 二十五味肺病丸對(duì)血管內(nèi)皮損傷所致血栓的保護(hù)作用

4 討論

正常的微循環(huán)功能是保證體內(nèi)重要臟器維持正常功能的重要前提，微血管的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，以及血流動(dòng)力學(xué)的完整性是保障微循環(huán)功能正常的重要條件。在血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、心輸出量病理性減少、血栓發(fā)生等危險(xiǎn)因素發(fā)生時(shí)，微循環(huán)嚴(yán)重受損，直接危害機(jī)體健康[11-12]。大量研究表明微血管功能障礙誘發(fā)微循環(huán)功能失調(diào)，是高血壓、肥胖和糖尿病及許多神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管等疾病的重要發(fā)病因素[13-14]。目前關(guān)于改善微循環(huán)的藥物多樣，治療效果參差不齊，不良反應(yīng)明顯，總體而言效果不盡人意，尋找新的靶向微循環(huán)功能改善的藥物迫在眉睫[15]。

二十五味肺病丸是始載于《四部醫(yī)典》的經(jīng)典明方，其主要成分為獐牙菜、紅花、檀香、牛黃、懸鉤木、沙棘膏、訶子等25味藥材，其中紅花、牛黃等主要成分已經(jīng)被證明能夠增強(qiáng)心肌興奮性、促進(jìn)血液循環(huán)等改善心血管功能的效用[16]，并且二十五味肺病丸對(duì)肺部炎癥有較好的療效，局部微循環(huán)的功能和炎癥改善息息相關(guān)，因此二十五味肺病丸能否改善微循環(huán)功能障礙值得探究。本研究選用了斑馬魚作為模式動(dòng)物模型[17]，探討了二十五味肺病丸在斑馬魚花生四烯酸誘導(dǎo)的血栓模型、普納替尼以及辛伐他汀誘導(dǎo)的微血管損傷模型和血管內(nèi)皮損傷模型中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二十五味肺病丸首先能夠改善微循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)二十五味肺病丸能夠增加斑馬魚25%的血流速度，最大增加32%血栓斑馬魚的心輸出量，這表明二十五味肺病丸能夠通過調(diào)節(jié)心肌收縮能力，促進(jìn)心臟泵血，從而增加微血管血壓，保障微循環(huán)充盈壓，有助于改善病變局部的物質(zhì)交換。炎癥發(fā)生時(shí)，組織局部的脈管系統(tǒng)常常受損，因此微循環(huán)血管損傷的改善和血管新生在改善炎癥中起到重要作用，二十五味肺病丸組斑馬魚節(jié)間血管直徑明顯增大，表明二十五味肺病丸能夠有效地保護(hù)斑馬魚節(jié)間血管，減少血管內(nèi)皮損傷，并且二十五味肺病丸斑馬魚腸下血管面積顯著增加，提示二十五味肺病丸促進(jìn)了斑馬魚血管的新生。因此，二十五味肺病丸能夠改善微循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)，促進(jìn)組織局部的物質(zhì)交換，并且減少微血管內(nèi)皮損傷，促進(jìn)微血管新生，極大限度地保障了微血管功能的行使，進(jìn)而減少血栓生成，起到改善微循環(huán)并促進(jìn)其恢復(fù)功能的作用。

綜上所述，二十五味肺病丸可以顯著減少血管內(nèi)皮損傷，促進(jìn)其再生，改善微血管血流動(dòng)力學(xué)作用，減少血栓生成，改善微血管功能障礙。二十五味肺病丸改善微血管功能的研究發(fā)現(xiàn)為其在臨床上微循環(huán)功能障礙性疾病中的應(yīng)用提供了藥理基礎(chǔ)，也為臨床治療微循環(huán)功能障礙提供了潛在的治療藥物。但考慮斑馬魚非哺乳動(dòng)物，其具體藥效和詳細(xì)的分子機(jī)制有待在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。