原花青素對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、遷移及TLR4/MyD88通路的影響

楊 靖，謝 群

（襄陽(yáng)市中心醫(yī)院整形美容科 湖北 襄陽(yáng) 441000）

瘢痕疙瘩是皮膚傷口愈合的病理反應(yīng)，其特征是成纖維細(xì)胞的異常增殖和膠原的過(guò)度沉積，臨床表現(xiàn)為創(chuàng)面邊緣外的持續(xù)性腫瘤樣增生和鄰近組織侵犯。瘢痕疙瘩的復(fù)發(fā)率高，許多治療方法包括切除和病灶內(nèi)注射皮質(zhì)類(lèi)固醇療效不令人滿意。因此，亟需尋找有效治療瘢痕疙瘩的藥物。原花青素是從植物中提取出的生物類(lèi)黃酮，具有強(qiáng)抗炎和抗氧化作用，最早作為抗肝纖維化的藥物進(jìn)行研究，但對(duì)瘢痕疙瘩的作用研究尚未報(bào)道。在纖維化的發(fā)病過(guò)程中，靜息狀態(tài)下的造血干細(xì)胞在外界因素的刺激下被激活轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，并合成和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)成分(Extracellular matrix components，ECM)，導(dǎo)致纖維化。臨床研究表明，纖維化通常伴有血清炎性細(xì)胞因子水平升高。此外，越來(lái)越多的研究表明，脂多糖激活的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)信號(hào)通路在纖維化中起重要作用。TLR4可通過(guò)髓樣分化因子88（MyD88）蛋白激活核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。而炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加，使細(xì)胞凋亡紊亂，進(jìn)一步促進(jìn)纖維化的發(fā)展。因此，本研究檢測(cè)原花青素對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(Keloid fibroblasts，KFs)增殖和遷移的影響，并探討TLR4/MyD88通路在整個(gè)過(guò)程中的作用，為原花青素治療瘢痕疙瘩提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 主要試劑與儀器：原花青素（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）；KFs細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）；四噻唑藍(lán)（MTT）（美國(guó)Amresco公司）；（Annexin）V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；白介素-23（Interleukin-23，IL-23）、白介素-17A（Interleukin-17A，IL-17A）和白介素-6（Interleukin-6，IL-6）(南京建成生物工程研究所）；Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]；RIPA裂解液（北京索萊寶生物技術(shù)公司）；TLR4、MyD88、NF-κB和β-actin抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；ECL化學(xué)發(fā)光液（美國(guó)GE公司）；CO細(xì)胞培養(yǎng)箱和NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測(cè)儀（美國(guó)Thermo公司）；HBS-1096B酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Real-time PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司）；流式細(xì)胞儀和垂直電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和原花青素的半數(shù)抑制濃度的確定：在37℃、5%CO的條件下用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)KFs細(xì)胞，當(dāng)KFs細(xì)胞貼壁達(dá)到70%左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將KFs細(xì)胞接種于96孔板中（5×10個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁后用不同濃度的原花青素（0、5、10、20、40、80、160mg/L）干預(yù)KFs細(xì)胞干預(yù)20h后加入MTT（20微摩爾/孔），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心棄上清液，每孔加入200μl二甲基亞砜，振蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖率[細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD值）/（對(duì)照組OD值-空白孔OD值）]，確定原花青素的半數(shù)抑制濃度。

1.3 細(xì)胞分組：實(shí)驗(yàn)將96孔（5×10個(gè)/孔）已培養(yǎng)好的KFs細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、原花青素低劑量組、原花青素中劑量組和原花青素高劑量組,每組24孔（5×10個(gè)/孔）。對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行處理；原花青素低、中、高劑量組分別用終濃度為25、50、100mg/L的原花青素干預(yù)KFs細(xì)胞，24h后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：將KFs細(xì)胞接種于6孔板中（1×10個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁后按1.3干預(yù)KFs細(xì)胞24h后收獲細(xì)胞，分別加入5μl膜聯(lián)蛋白（Annexin）V-FITC與碘化丙啶，充分混勻后室溫避光孵育20min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：將KFs細(xì)胞接種于6孔板中（1×10個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁后，使用100μL移液管的尖端刮擦每個(gè)培養(yǎng)板中的細(xì)胞層，以劃出傷口；將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，PBS）沖洗劃痕，參照1.3中所述干預(yù)KFs細(xì)胞24h后從每個(gè)劃痕傷口中隨機(jī)選擇5個(gè)視野，用顯微鏡下拍照，用圖像分析儀測(cè)量劃痕寬度。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）檢測(cè)細(xì)胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平：將KFs細(xì)胞接種于6孔板中（1×10個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁后參照1.3中所述干預(yù)KFs細(xì)胞24h后收獲細(xì)胞，加入2ml磷酸鹽緩沖液，用細(xì)胞超聲破碎儀處理30s，離心取上清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平。

1.7 實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-time fluorescence -PCR，RTPCR）檢測(cè)細(xì)胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表達(dá)：將KFs細(xì)胞接種于6孔板中（1×10個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁后按1.3干預(yù)KFs細(xì)胞24h后收獲細(xì)胞，加入TRIzol進(jìn)行總RNA提取，根據(jù)mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，將總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明，用制備20ul反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性40s；93℃變性10s，62℃退火1min，72℃延伸45s，共循環(huán)50次，最后一個(gè)循環(huán)后72℃延長(zhǎng)7min，采用2法計(jì)算TLR4、MyD88和NF-κB mRNA的相對(duì)表達(dá)量（以β-actin作為內(nèi)對(duì)照）。

1.8 Western Blot法檢測(cè)KFs細(xì)胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)：將KFs細(xì)胞接種于6孔板中（1×10個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁后按1.3干預(yù)KFs細(xì)胞24h后收獲細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，加入RIPA 裂解液（100μl），裂解2h（4℃）離心取上清，得到總蛋白，采用BIO-RAD濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)SDS-PAGE 膠進(jìn)行電泳（20微克/孔），切膠、轉(zhuǎn)膜、封膜后將膜與TLR4（1∶200）、MyD88（1∶400）、和NF-κB（1∶500）進(jìn)行孵育，過(guò)夜（4℃），用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG（1∶5 000）在室溫下孵育（30min），滴加ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色，采集圖像進(jìn)行分析（以β-actin作為內(nèi)對(duì)照）。

2 結(jié)果

2.1 原花青素對(duì)KFs細(xì)胞增殖的影響：隨著原花青素濃度增加，KFs細(xì)胞增殖率降低，與0μmol/L比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。當(dāng)原花青素濃度為40mg/L時(shí)，KFs細(xì)胞增殖率為41.53%，當(dāng)原花青素濃度為80mg/L時(shí)，KFs細(xì)胞增殖率為30.68%，故選50mg/L作為半數(shù)抑制濃度（見(jiàn)圖1）。

圖1 原花青素對(duì)KFs細(xì)胞增殖的影響

2.2 原花青素對(duì)KFs細(xì)胞凋亡和遷移的影響：與對(duì)照組比較，其余各組細(xì)胞遷移距離降低，細(xì)胞凋亡率依次增加，且隨著原花青素劑量增加，各原花青素劑量組細(xì)胞凋亡率和遷移距離呈劑量反應(yīng)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）(見(jiàn)表1，見(jiàn)圖2～3)。

表1 原花青素對(duì)KFs細(xì)胞凋亡和遷移的影響 （）

圖2 原花青素對(duì)KFs細(xì)胞凋亡的影響

圖3 原花青素對(duì)KFs細(xì)胞遷移的影響

2.2 原花青素對(duì)KFs細(xì)胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平的影響：與對(duì)照組比較，其余各組細(xì)胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平降低，且隨著原花青素劑量增加，各原花青素劑量組細(xì)胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平呈劑量反應(yīng)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）(見(jiàn)表2)。

表2 原花青素對(duì)KFs細(xì)胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平的影響（）

2.3 原花青素對(duì)KFs細(xì)胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平的影響：與對(duì)照組比較，其余各組細(xì)胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平降低，且隨著原花青素劑量增加，各原花青素劑量組細(xì)胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平呈劑量反應(yīng)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）(見(jiàn)表3)。

表3 原花青素對(duì)KFs細(xì)胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平的影響（）

2.4 原花青素對(duì)KFs細(xì)胞中TLR4、MyD88和NF-κB 蛋白水平的影響：與陰性對(duì)照組比較，其余各組細(xì)胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平降低，且隨著原花青素劑量增加，各原花青素劑量組細(xì)胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平呈劑量反應(yīng)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）(見(jiàn)表4，圖4)。

表4 原花青素對(duì)KFs細(xì)胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平影響（）

圖4 原花青素對(duì)KFs細(xì)胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平影響

3 討論

創(chuàng)傷組織修復(fù)涉及多種病理機(jī)制，包括炎癥、組織形成和組織重塑。盡管瘢痕疙瘩是一種良性疾病，但它會(huì)侵襲鄰近的正常組織，甚至破壞其正常功能，被認(rèn)為是良性增生性皮膚腫瘤。KFs細(xì)胞在細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中表現(xiàn)異常，并逃避細(xì)胞凋亡，在ECM中不成比例地積聚，是臨床治療瘢痕疙瘩的主要難題。炎癥微環(huán)境是腫瘤相關(guān)炎癥的一個(gè)標(biāo)志。慢性炎癥誘導(dǎo)DNA損傷和突變，導(dǎo)致腫瘤的形成和進(jìn)展。IL-23是IL-12家族成員，是一種異源二聚體促炎細(xì)胞因子，主要由炎性髓細(xì)胞產(chǎn)生。IL-23在IL-6和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）存在的情況下，刺激T細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞，能夠產(chǎn)生另一種促炎細(xì)胞因子IL-17A。IL-17A招募中性粒細(xì)胞，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟，并刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），然后誘導(dǎo)和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。越來(lái)越多的研究表明IL-23/IL-17A軸參與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，IL-23/IL-17A軸可減少CD8+細(xì)胞在腫瘤中的浸潤(rùn)，增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制活性。研究表明，瘢痕疙瘩是慢性炎癥長(zhǎng)期作用的結(jié)果。原花青素具有抗炎、抗氧化和抑制血管生成等藥理作用，具有廣泛的應(yīng)用前景，但其藥效學(xué)基礎(chǔ)尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，原花青素顯著抑制KFs細(xì)胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平，同時(shí)抑制KFs細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

TLR4作為一個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，在多種類(lèi)型的人類(lèi)癌癥中過(guò)度表達(dá)，如乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌。TLR4通過(guò)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(Pathogen associated pattern molecules，PAMPs)，如LPS，從而誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的分泌并激活先天免疫系統(tǒng)，抑制TLR4/MyD88通路激活可減弱TLR4與LPS的結(jié)合，從而下調(diào)下游信使分子和相關(guān)炎癥基因的表達(dá)。同時(shí)，TLR4/myd88通路的激活促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，原花青素干預(yù)能劑量依賴(lài)性地抑制了KFs細(xì)胞中TLR4和MyD88的表達(dá)，表明原花青素的抗炎作用與TLR4/MyD88通路有關(guān)。

慢性炎癥與纖維化密切相關(guān)。在纖維化患者中發(fā)現(xiàn)LPS水平升高，LPS激活TLR4通路被證明參與了纖維化的發(fā)展。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活1(Transforming growth factor β-activated kinase 1，TAK1)蛋白是TLR4通路中的關(guān)鍵蛋白，可激活NF-κB信號(hào)通路。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB通路一直被認(rèn)為是一種典型的促炎信號(hào)通路，其主要作用在于上調(diào)促炎基因的表達(dá)。NF-κB p65和p50亞基組成一個(gè)異源二聚體，由LPS等刺激激活通常被定義為典型的NF-κB通路。NF-κB p65/p50異二聚體通常被NF-κB抑制劑（IκBα）隔離在細(xì)胞漿中，在LPS刺激下，IκBα被磷酸化和降解，釋放p65/p50異源二聚體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核并結(jié)合NF-κB共識(shí)位點(diǎn)，激活炎癥反應(yīng)。TLR4/MyD88通路介導(dǎo)NF-κB的激活以及隨后的促炎性細(xì)胞因子（包括IL-1β、IL-6和TNF-α）的產(chǎn)生。這些細(xì)胞因子刺激髓樣樹(shù)突細(xì)胞分泌IL-23，從而促進(jìn)Th17細(xì)胞的增殖和分化。IL-23由p19和p40單元組成，而p19的誘導(dǎo)呈TLR依賴(lài)性。本研究結(jié)果顯示，TLR4/MyD88通路調(diào)節(jié)KFs細(xì)胞中NF-κB表達(dá)水平，從而調(diào)控IL-23和IL-17A的表達(dá)水平。

綜上所述，原花青素可能通抑制TLR4/MyD88通路的激活，降低KFs細(xì)胞中炎癥因子水平，抑制KFs細(xì)胞增殖和遷移，同時(shí)促進(jìn)KFs細(xì)胞凋亡，為原花青素治療瘢痕疙瘩提供了一種新的策略。但仍需進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)其臨床應(yīng)用治療瘢痕疙瘩的有效性和安全性。