鐵皮石斛銹病病原鑒定及藥劑篩選

羅 凱，李澤生，姜 艷，賈 敏，高 燕，耿秀英，李桂琳

(云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，云南 瑞麗 678600)

鐵皮石斛(Dendrobium officinale)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生草本植物，是我國特有的藥用植物，獨特的生長環(huán)境造就其非凡的品質(zhì)，具有“養(yǎng)陰生津、潤喉護嗓、溫胃明目、補腎益力、延年益壽”等功效[1]，藥材應(yīng)用歷史悠久，是《中國藥典》(2015版)收載的4種石斛之一[2]。鐵皮石斛其有性繁殖結(jié)實率低，蒴果雖然具有很多粒微小種子，但是它的種子缺乏胚乳，需要特殊的共生菌提供營養(yǎng)才能萌發(fā)[3—5]。由于人類過度采挖和毀林開荒導(dǎo)致鐵皮石斛原生境喪失，其野生種群數(shù)量急劇減少，已被納入中國物種紅色名錄，屬于瀕危物種[6]。隨著組培技術(shù)的快速發(fā)展[7]，栽培水平不斷提高，人工大棚種植的鐵皮石斛種植面積不斷增加，單一大面積種植、高溫高濕的大棚環(huán)境導(dǎo)致了鐵皮石斛病害的發(fā)生，鐵皮石斛輪紋病、根腐病、黑斑病、軟腐病、銹病相繼報道[8—12]。近年來，鐵皮石斛銹病在云南省德宏州大面積發(fā)生，嚴重影響鐵皮石斛的正常生長。為更好掌握鐵皮石斛銹病的發(fā)生情況，開展病害防治工作，筆者對該種植區(qū)發(fā)生的銹病及其發(fā)病規(guī)律進行調(diào)查，對病原菌種類進行鑒定，篩選防治藥劑，為生產(chǎn)中防治該病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及材料

試驗地點位于云南省德宏州瑞麗市勐秀鄉(xiāng)鐵皮石斛種植基地，選擇葉面干凈，銹菌孢子堆明顯，病斑單一的銹病樣品進行采集。選擇生產(chǎn)上常用的防治藥劑(表1)。

表1 供試殺菌劑Table 1 Fungicides for test

1.2 病原菌鑒定

選擇鐵皮石斛葉銹病癥狀明顯的病組織，將其孢子堆做成玻片，觀察孢子形態(tài)和顏色，測量孢子大小，對病原菌進行鑒定[13—14]。將銹病病菌樣品送昆明碩擎生物有限公司進行分子測序，在NCBI網(wǎng)站進行序列比對分析。

1.3 發(fā)病規(guī)律

2018年3月至2020年3月對鐵皮石斛銹病進行定點觀察，記錄發(fā)病時間，危害癥狀、危害程度，觀察鐵皮石斛葉銹病孢子及孢子堆。

1.4 藥效試驗

選擇4種藥劑設(shè)5個處理，即430 g·L-1戊唑醇懸浮劑 375 mL·hm-2、 42.8% 氟菌·肟菌酯懸浮劑450 mL·hm-2、10%苯甲·丙環(huán)唑懸浮劑 450 mL·hm-2、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑 300 g·hm-2、清水空白對照(CK)。每處理3次重復(fù)，共設(shè)15個小區(qū)，小區(qū)面積18 m2、采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，各試驗小區(qū)四周設(shè)保護行隔離，每處理噴霧等量藥液或清水。每7 d施藥一次，正常藥量，共施藥3次，于2018年8月5日、12日、19日各施藥1次，正常藥量。施藥后 7 d調(diào)查各小區(qū)病害發(fā)生情況，采取對角線5點取樣，每點調(diào)查20叢，每叢調(diào)查5個葉片，計算各處理病情指數(shù)及防治效果。病情分級標準為：0級，無病斑；1級，病斑面積≤1/10葉面積；2級，病斑面積≤1/5葉面積；3級，病斑面積≤1/2葉面積；4級，病斑面積≤3/4葉面積；5級，病斑面積＞3/4葉面積。計算病情指數(shù)和相對防效，公式如下：

病情指數(shù)=∑(病級數(shù)值×該病級葉數(shù))/(病級最高值×調(diào)查葉數(shù))×100；

相對防效(%)=1-(藥后對照區(qū)病情指數(shù)×藥后防治區(qū)病情指數(shù))/(藥前對照區(qū)病情指數(shù)×藥前防治區(qū)病情指數(shù))×100%

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS V19.0.0軟件作單因素分析及Duncan氏新復(fù)極差法檢驗差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛銹病病原菌形態(tài)與分子鑒定

采集的鐵皮石斛銹病夏孢子呈黃色，近圓形或不規(guī)則橢圓形，直徑 20～30 μm，后期顏色逐漸變深(圖1)；冬孢子呈紅褐色，短棒形或不規(guī)則形狀，孢子長50～140 μm。鐵皮石斛銹病病原菌形態(tài)鑒定為擔子菌亞門(Basidiomycota)冬孢菌綱(Teliomycetes)銹菌目(Uredinales)鞘銹菌科(Coleosporaceae) 鞘銹菌屬真菌(Coleosporiumsp.)。通過NCBI網(wǎng)站對所獲得的石斛銹菌的ITS序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛銹病病原菌種類與形態(tài)鑒定種類結(jié)果一致，同為真菌鞘銹菌(Coleosporiumsp.)。

圖1 鐵皮石斛銹病病原菌夏孢子形態(tài)Fig. 1 Urediospores of Dendrobium officinale rust disease

2.2 鐵皮石斛銹菌發(fā)病規(guī)律

鐵皮石斛銹病的發(fā)生期為2～11月，主要危害鐵皮石斛葉片。2月隨著氣溫升高，鐵皮石斛銹病病菌從葉片背面侵染，發(fā)病初期葉片出現(xiàn)淺黃色、水漬狀小斑，葉片被侵染部位逐漸退綠，周圍有淺綠色暈染，此時在體式顯微鏡下可觀察到淺黃色的粉狀孢子堆(圖2: A)，在初期病斑周圍形成一圈深紅色病斑，不久即發(fā)展成為塊狀孢子堆，一片葉上可形成一個或多個病斑，為黃色或暗紅色。繼而葉面的黃色斑點逐漸擴大呈深黃色和深褐色，葉背黃斑擴大呈環(huán)狀(圖2: B)，在體式顯微鏡下可觀察到大量附著的深黃色的孢子(圖2: C)，危害嚴重時所有葉片干枯脫落，莖尖停止生長，鐵皮石斛假鱗莖縮水變干，降低產(chǎn)量和品質(zhì)。10月中旬冬孢子開始形成，病斑呈紅褐色，環(huán)狀(圖2: D)，鐵皮石斛銹病以冬孢子越冬，翌年春季侵染葉片。7～9月是鐵皮石斛葉銹病發(fā)病高峰期，雨季的高溫高濕環(huán)境有利于孢子囊形成和孢子萌發(fā)，孢子可借風(fēng)、雨、昆蟲傳播，侵染健康葉片及鄰近植株葉片，并迅速繁殖和擴散傳播，造成多次侵染，導(dǎo)致病害蔓延。無降雨季節(jié)，病害發(fā)展較慢，但人工噴灌澆水也會促進病害發(fā)展。

圖2 鐵皮石斛銹病癥狀Fig. 2 Symptoms of Dendrobium officinale rust disease

2.3 供試藥劑對鐵皮石斛銹病的田間防效

施藥后均未發(fā)生藥害，表明4種藥劑處理對銹病均有一定的防效(表2)。4個藥劑處理在施藥3次后，鐵皮石斛銹病的病情指數(shù)逐漸降低、防效逐漸增加，第3次藥后7 d病情指數(shù)最低、防效最好。430 g·L-1戊唑醇懸浮劑 375 mL·hm-2和 42.8%氟菌·肟菌酯懸浮劑450 mL·hm-2處理的平均防效分別在45.91%～70.61%、44.72%～66.10%之間，病害程度中等偏輕；10%苯甲·丙環(huán)唑懸浮劑 450 mL·hm-2和75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑300 g·hm-2處理的平均防效分別在55.59%～82.16%、47.53%～82.88%之間，病害程度偏輕；而空白對照的平均病指在24.56～32.46之間，病害程度偏重，且略有加重趨勢。第1次施藥后7 d，4個藥劑處理的防效差異均不顯著；第2次施藥后7 d，42.8%氟菌·肟菌酯懸浮劑與 75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑處理的防效差異顯著，75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、10%苯甲·丙環(huán)唑懸浮劑與的防效差異不顯著；第3次施藥后7 d，430 g·L-1戊唑醇懸浮劑與42.8%氟菌·肟菌酯懸浮劑的防效差異顯著，42.8%氟菌·肟菌酯懸浮劑與 10%苯甲·丙環(huán)唑懸浮劑、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑處理的防效差異顯著；3次防效試驗調(diào)查中，10%苯甲·丙環(huán)唑懸浮劑處理與 75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑處理的防效均沒有顯著差異。由此可知，10%苯甲·丙環(huán)唑懸浮劑與 75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑防效一樣，在第3次施藥后7 d時防效達最高，分別為82.16%和82.88%，防效較好。

表2 不同藥劑處理對鐵皮石斛銹病的防治效果Table 2 Disease index and control effect of different treatments on Dendrobium officinale rust disease

3 結(jié)論與討論

病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，鐵皮石斛銹病病原菌為鞘銹菌屬真菌(Coleosporiumsp.)，鞘銹菌屬真菌通常引起松針銹病，其冬孢子對寄主植物的選擇并不十分嚴格，寄主范圍廣泛，一種植物上通常有多種鞘銹菌，而同一種鞘銹菌也可以寄生不同的植物[13]，使得鞘銹菌屬真菌鑒定較為困難，本研究與席剛俊等[12]研究結(jié)果一致，鐵皮石斛銹病的病原菌同為鞘銹菌屬真菌，是否由花椒鞘銹菌(Coleosporium zanthoxyli)引起，需進一步研究確定。胡永亮等[15]鑒定了齒瓣石斛(Dendrobium devonianum)銹病的病原為柄銹菌屬真菌(Puccinia sp.)，趙桂華等[16]報道齒瓣石斛銹病的病原為雞矢藤鞘銹菌(Coleosporium paederiae)。

鐵皮石斛銹病防治藥劑篩選試驗表明，75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑與 10%苯甲·丙環(huán)唑懸浮劑的防治效果較佳。75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑由戊唑醇和肟菌酯復(fù)配而成，肟菌酯主要作用于真菌的線粒體呼吸鏈中的細胞色素 bcl復(fù)合體，阻止電子傳遞從而抑制真菌生長[17]，戊唑醇作用機理是抑制麥角甾醇中間體的氧化脫甲基反應(yīng)，從而間接地對甾醇混合物的組成產(chǎn)生影響，導(dǎo)致病原菌不能形成細胞膜而死亡[18]。75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑最高防效為82.88%。10%苯甲·丙環(huán)唑懸浮劑由苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑復(fù)配而成，苯醚甲環(huán)唑是甾醇脫甲基化抑制劑，抑制甾醇的生物合成，阻止真菌生長，丙環(huán)唑影響甾醇生物合成，破壞病原菌細胞膜功能，最終導(dǎo)致細胞死亡[19]。10%苯甲·丙環(huán)唑懸浮劑最高防效為82.16%，也顯著高于單劑430 g·L-1戊唑醇懸浮劑的防效。同時也表明混配不同作用機理的殺菌劑不僅提高了防效，而且使病原菌不易產(chǎn)生抗藥性。

鐵皮石斛銹病的發(fā)生期為2～11月，發(fā)病時間較長，其發(fā)生發(fā)展與當?shù)貧夂驐l件、種植園區(qū)環(huán)境密切相關(guān)。高溫高濕環(huán)境有利于銹病發(fā)生，此外銹孢子可借風(fēng)、雨、昆蟲傳播，人工噴灌澆水等農(nóng)事操作也會促進病害發(fā)生。鐵皮石斛栽培場所應(yīng)保持種植園區(qū)通風(fēng)，保持環(huán)境衛(wèi)生，經(jīng)常檢查葉片背面，發(fā)現(xiàn)病葉及時剪除和清除，減少侵染菌源。合理輪換或混用不同作用機理的殺菌劑，對有效控制病害、減少用藥量及減緩病菌抗藥性都有重要意義。生產(chǎn)中可交替使用 10%苯甲·丙環(huán)唑懸浮劑和 75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑防治鐵皮石斛銹病。