響應面法優(yōu)化養(yǎng)顏玉肌膏提取工藝

李菁 ，耿萌萌 ，余靚 ，盧美彤 ，于佳琳 ，張頌揚，王小平，2*

（1.陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西咸陽 712046；2.陜西省中藥原料質量監(jiān)測技術服務中心，陜西咸陽 712046）

養(yǎng)顏玉肌膏是在《醫(yī)宗金鑒》收載的五味消毒飲的基礎上加減而成，主要由金銀花、野菊花、三色堇及玫瑰花組成，金銀花（Lonicera japonicaFlos）味甘、性寒，歸肺、心、胃經，具有清熱解毒、疏散風熱，消腫、治瘡之功效[1-3]，為方中主藥；野菊花（ChrysanthemiindiciFlos）味苦、辛，性微寒，歸肝、心經，具有清熱解毒、瀉火平肝等功效[1]；三色堇為堇菜科三色堇（Viola tricolorL.）的干燥全草，《中華本草》記載味苦、性寒，歸肺經，具有清熱解毒、去瘡消腫之功效，野菊花和三色堇均為佐藥；玫瑰花（Rosae rugosaeFlos）味甘、微苦，性溫，具有行氣解郁、活血止痛等功效[1，4]，為使藥。各藥合用，其清熱解毒之功效較佳。中醫(yī)研究表明，痤瘡與風熱外襲、肺經郁熱、胃腸積熱、血熱偏盛有關[5]。本研究在五味消毒飲的基礎上進行加減，旨在研制一款治療痤瘡的膏劑——養(yǎng)顏玉肌膏。綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C是金銀花、野菊花和玫瑰花的主要成分之一，具有解熱抗炎、抗菌、抗氧化、抗抑郁、抗焦慮等藥理作用[6-10]，因此，本研究以綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 為評價指標，采用響應面法優(yōu)化養(yǎng)顏玉肌膏的提取工藝，為養(yǎng)顏玉肌膏的制備及后續(xù)的開發(fā)奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

賽默飛Ultimate 3000 全自動高效液相色譜儀（賽默飛世爾上海儀器有限公司）；Direct-Q3 UV 純水超純水一體機（美國Millipore 公司）；HⅩ-25 電熱恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度：0.01 mg，量程：81 g/220 g～0.01 g/0.1 mg）；DHG-9075A 干燥箱（上海恒科有限公司）；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

金銀花（Lonicera japonica Flos）、三色堇（Viola tricolor L.）、野菊花（Chrysanthemi indici Flos）和玫瑰花（Rosae rugosae Flos）飲片，購自嵐皋縣和平大藥房有限責任公司且經陜西中醫(yī)藥大學白吉慶教授鑒定為忍冬（Lonicera japonicaThunb.）、三色堇（Viola tricolorL.）、野菊（Chrysanthemum indicumLinnaeus）和玫瑰（Rosa rugosaThunb.）的干燥花，金銀花、野菊花和玫瑰花經檢驗均符合2020 年版《中國藥典》標準；綠原酸（HPLC≥98%，批號B20782），異綠原酸A（HPLC≥98%，批號B21539）和異綠原酸C（HPLC≥98%，批號B21539）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司，磷酸、乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 有效成分質量分數(shù)測定方法的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品、異綠原酸A對照品、異綠原酸C對照品適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，制成每1 mL 含0.285 mg 綠原酸、0.151 mg 異綠原酸A、45 μg 異綠原酸C 的儲備液。分別精密吸取上述3 種儲備液各135 μL，置2 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 分別取金銀花、野菊花、三色堇、玫瑰適量，粉碎成粗粉，按照質量比4∶4∶1∶1，稱取上述4 種粗粉共10 g，精密稱定，加入10 倍量50%（體積分數(shù)，下同）乙醇回流1.0 h，冷卻，過濾，取續(xù)濾液1 mL，置100 mL 量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.1.3 陰性溶液的制備 取三色堇粗粉1 g，精密稱定，加入10 倍量50%乙醇回流1.0 h，冷卻，過濾，取續(xù)濾液1 mL，置100 mL 量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液即為陰性溶液。

2.1.4 色譜條件 色譜柱為Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脫（0～8 min，14%～19%A；8～14 min，19%A；14～34 min，19%～31%A；34～35 min，31%～90%A；35～40 min，90%A）；流速為1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長為327 nm；進樣量為10 μL。3 種酚酸類成分的色譜峰分離良好，陰性無干擾。結果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Figure 1 High performance liquid chromatography chart

2.2 方法學考察

2.2.1 標準曲線的繪制 取“2.1.1”項的混合對照品溶液，按“2.1.4”項色譜條件依次進樣1、2、4、6、8、10 μL，測定3 種成分的峰面積，以質量（μg）為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），計算回歸方程見表1。

表1 3種酚酸類成分線性范圍Table 1 Linear range of three phenolic acids

2.2.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，按“2.1.4”項色譜條件連續(xù)進樣6次，結果綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積的RSD 值依次為0.13%、0.18%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復性試驗 取同一批藥材粉末，按“2.1.2”項方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1.4”項色譜條件分析，結果測得綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 質量分數(shù)的RSD 值依次為1.79%、1.38%、0.62%，表明方法重復性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1.4”項色譜條件，分別在0、1、2、4、8、12、24 h 進樣，綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積的RSD 值依次為1.25%、0.98%、1.13%，表明供試品溶液中上述3種成分在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 按照質量比4∶4∶1∶1，分別取金銀花、野菊花、三色堇、玫瑰粗粉共5 g，精密稱定，平行6 份，按照1∶1 分別加入一定量的對照品，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，依法測定，結果綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 的加樣回收率分別為95.45%、97.81%、98.25%，均在95%～105%之間且RSD 值均小于3%，表明方法的加樣回收率符合要求。

2.3 單因素試驗

根據文獻報道和預實驗結果，分別考察料液比、提取時間、乙醇體積分數(shù)、提取次數(shù)對綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C提取量的影響。

2.3.1 料液比 按照質量比4∶4∶1∶1，分別取金銀花、野菊花、三色堇、玫瑰粗粉共10 g，精密稱定，依次按料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（每個料液比平行3份）加入70%的乙醇溶液，回流提取1.5 h，提取1 次，測定3種酚酸類成分的峰面積，并計算3種成分總質量分數(shù)，結果見圖2。可見，綜合考慮3種成分質量分數(shù)及能耗等因素[11]，選定料液比（g∶mL）為1∶8。

圖2 不同料液比對3種成分總質量分數(shù)的影響Figure 2 Effect of different solid-liquid ratio on total contents of three components(n=3)

2.3.2 提取時間 按照質量比4∶4∶1∶1，分別取金銀花、野菊花、三色堇、玫瑰粗粉共10 g，精密稱定，加入70%的乙醇80 mL，依次提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h（每個提取時間平行3 份），提取1 次，測定3 種酚酸類成分的峰面積，并計算其質量分數(shù)，結果見圖3?？梢姡崛r間1.0 h 時，3 種成分總質量分數(shù)最大，故選定提取時間為1.0 h。

圖3 不同提取時間對3種成分總質量分數(shù)的影響Figure 3 Effects of different extraction time on total contents of three components(n=3)

2.3.3 乙醇體積分數(shù) 按照質量比4∶4∶1∶1，分別取金銀花、野菊花、三色堇、玫瑰粗粉共10 g，精密稱定，按照料液比為1∶8，分別加入30%、50%、70%、90%（每個體積分數(shù)平行3份）的乙醇，回流提取1.0 h，提取1 次，測定3 種酚酸類成分的峰面積，并計算其質量分數(shù)，結果見圖4。可見，乙醇體積分數(shù)為50%時，3 種成分總質量分數(shù)最大，故選定乙醇體積分數(shù)為50%。

圖4 不同乙醇體積分數(shù)對3種成分總質量分數(shù)的影響Figure 4 Effects of different alcohol concentrations on the total contents of three components(n=3)

2.3.4 提取次數(shù) 按照質量比4∶4∶1∶1，分別取金銀花、野菊花、三色堇、玫瑰粗粉共10 g，精密稱定，加入體積分數(shù)為50%的乙醇溶液80 mL，回流提取1.0 h，分別提取1、2、3次（每個次數(shù)平行3份），測定3種酚酸類成分的峰面積，并計算其質量分數(shù)，結果見圖5?？梢?，提取次數(shù)為1次時，3種成分總質量分數(shù)最大，故選定提取次數(shù)為1次。

圖5 不同提取次數(shù)對3種成分總質量分數(shù)的影響Figure 5 Effect of different extraction times on the total contents of the three components(n=3)

2.4 響應面法優(yōu)化提取工藝

2.4.1 響應面法實驗設計 從單因素考察結果，初步確定料液比（g∶mL）為1∶8，乙醇體積分數(shù)為50%，回流提取時間為1.0 h，提取1 次較為合適，在此基礎上，以料液比（A）、提取時間（B）、乙醇體積分數(shù)（C）為影響因素，3種成分含量總和（mg/g）為評價指標，采用Design-Expert 11軟件，根據Box-Behnken設計原理，進行3 因素3 水平17 個實驗點Box-Behnken 設計-響應面分析實驗。因素水平見表2，試驗安排及結果見表3。

表2 響應面試驗的因素與水平Table 2 Factors and Levels of response surface method

2.4.2 數(shù)學模型的建立及分析 使用Design Expert軟件對表3數(shù)據進行二次響應面擬合分析，得到編碼回歸方程為Y=31.93-0.091 2A+0.373 0B+0.258 8C+0.612 5AB+0.194 0AC+0.793 5BC-7.98A2-4.08B2-8.34 C2，R2=0.962 8，接近1，說明通過二次回歸得到綜合評分模型與試驗擬合較好。方差分析結果見表4。

表3 響應面試驗設計與結果Table 3 Design and results of response surface method

表4 回歸模型方差分析結果Table 4 Variance analysis results of regression model

由表4可知，模型極顯著（P=0.003），失擬項不顯著（P=0.429 5），說明此模型有統(tǒng)計學意義。各因素對3種成分總質量分數(shù)的影響由大到小的順序B＞C＞A，即提取時間＞乙醇體積分數(shù)＞料液比，其中二次項A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01）。

2.4.3 響應面交互作用 分析響應面圖可以直觀地反映各因素間的交互作用對響應值的影響程度，3D圖坡度越陡表示兩因素交互作用越大，等高線的形狀反應因素間的交互作用，等高線為橢圓形表明兩者的交互作用顯著[12-14]。由圖6可見，料液比與乙醇體積分數(shù)之間的曲線最陡峭、提取時間次之，說明料液比與乙醇體積分數(shù)之間的交互作用對響應值（3 種成分總質量分數(shù)）的影響更顯著，也與表4 中BC（P=0.447 2）＞AB（P=0.554 0）＞AC（P=0.849 5）相對應。

圖6 各因素交互作用的曲面圖與等高線圖Figure 6 Curved surface and contour maps of interaction effects of various factors on total phenolic acid content

2.4.4 驗證試驗 經Design-Expert 10.0.7 軟件計算得到養(yǎng)顏玉肌膏的最佳提取工藝為：料液比（g∶mL）為1∶8，乙醇體積分數(shù)為50%，提取時間為1 h，預測值為31.926 mg/g。采用最佳提取工藝，3 批供試品中3種成分總質量分數(shù)為（30.763±1.53）mg/g（n=3），與預測值31.926 mg/g接近，表明方法穩(wěn)定可行。

3 討論

中藥常用的提取方法有浸漬法、煎煮法、超聲提取法、回流提取法和連續(xù)回流提取法等[15]，而回流法對綠原酸等成分的提取率相對較高[16-19]。提取工藝優(yōu)化常用的設計方法有響應面法、正交試驗和均勻設計等，均勻設計適用于水平數(shù)較多，且各因素水平數(shù)不等的情況；正交試驗具有試驗組數(shù)少的優(yōu)點，但不能很好地考察因素間的交互作用且回歸模型的精度與預測性較差[20]，不能用于連續(xù)變量的優(yōu)化等，常用于初步篩選；而響應面法可全面考察影響因素之間的交互作用，適用于連續(xù)變量的優(yōu)化，得到高精度的回歸方程，改善正交試驗設計中存在的不足[21-22]。因此，本研究選用響應面法優(yōu)化養(yǎng)顏玉肌膏回流提取工藝。

通過前期的預實驗，考察了料液比、乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取次數(shù)4個因素，對綠原酸、異綠原酸A 和異綠原酸C 3 種成分提取的影響，根據單因素試驗結果，設置響應面法的因素水平，以上述3 種成分總質量分數(shù)為評價指標，進一步優(yōu)化養(yǎng)顏玉肌膏的提取工藝，得到最優(yōu)工藝為料液比（g∶mL）為1∶8，乙醇體積分數(shù)為50%，提取時間1 h，驗證實驗與預測值相接近，說明響應面法優(yōu)化回流提取工藝的結果準確、可靠，工藝穩(wěn)定、可行，為養(yǎng)顏玉肌膏的制備及開發(fā)提供實驗依據。

現(xiàn)代科學研究表明，綠原酸具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利膽等多種藥理作用，異綠原酸A 有較強的抗氧化作用[23-24]。2020 年版《中國藥典》規(guī)定金銀花中綠原酸質量分數(shù)不得少于1.5%，綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 總量不得少于3.8%，經測定本研究所用金銀花中綠原酸質量分數(shù)為（6.132 3±1.72）mg/g（＞1.5%），上述3 種成分總質量分數(shù)為（15.765 6±2.35）mg/g（＞3.8%），符合《中國藥典》標準；而養(yǎng)顏玉肌膏中綠原酸含量為（17.026 6±2.09）mg/g，上述3 種成分總質量分數(shù)為（30.763±1.53）mg/g，遠遠高于金銀花中的含量，這可能與野菊花、玫瑰花中含有綠原酸有關，與文獻報道一致[8-12]，也可能是處方中的其他成分對上述成分的助溶作用有關，有待進一步研究。