基于Notch1/ROR-γt信號通路研究芹菜素對自身免疫性甲狀腺炎小鼠的保護(hù)作用

李澤壟，李智奇，喻濤

（深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院甲乳外科，廣東深圳 518109）

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）是一種臨床上常見的自身免疫功能紊亂所引起的甲狀腺疾病[1]。其病因復(fù)雜且臨床癥狀多樣，有研究報(bào)道AIT 的致病機(jī)制涉及炎癥、凋亡和氧化損傷等[2-3]。AIT 患者的主要臨床癥狀有甲狀腺腫大、功能減退以及纖維化等[4]。特別是近年來隨著生活方式的逐漸改善以及生活環(huán)境的惡化，AIT 的發(fā)病率有明顯上升的趨勢[5]。臨床使用抗AIT 藥物品種較多，如糖皮質(zhì)激素、左旋甲狀腺素、雷公藤多苷片等。雖然AIT 病患可獲得某些癥狀的改善，但存在藥物使用的其他問題不容忽視，如服后不良反應(yīng)多和斷藥易復(fù)發(fā)等[6]。故開發(fā)新的替代藥物仍是當(dāng)務(wù)之急。

芹菜素，別稱為芹黃素或洋芹素，是一種廣泛存在于各種水果和蔬菜、豆科植物以及茶葉中的黃酮類化合物，其中在芹菜中的含量最高，已有較多的研究[7]表明芹菜素具有良好的抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗病毒等多種生物活性?；谝陨咸匦?，芹菜素是否對自身免疫性甲狀腺炎具有良好的保護(hù)作用目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠自身免疫性甲狀腺炎模型，從炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡角度，探討其對自身免疫性甲狀腺炎的影響。

1 材料

1.1 動物

60只SPF的雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCⅩK（粵）2019-0002。

1.2 藥品與試劑

芹菜素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，陜西慧科植物開發(fā)有限公司）；雷公藤多苷片（10 mg/片，貴州漢方藥業(yè)有限公司）；PTg、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑（Sigma公司）；碘化鈉（NaI，金錦樂化學(xué)有限公司）；小鼠TPOAb 化學(xué)發(fā)光試劑盒、小鼠TGAb 化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海安妍生物有限公司）；TNF-α、IL-1βELISA 檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；SOD、MDA 試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；Bcl-2、Bax單克隆抗體（北京博奧生物）。

1.3 主要儀器

800TS 吸收光酶標(biāo)儀（美國Biotek 伯騰公司）；IⅩ71 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；JYD-325型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（金華市宇典醫(yī)療器械廠）；WD-9413C型凝膠成像分析系統(tǒng)（福州申輝化工儀器設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 小鼠自身免疫性甲狀腺炎模型構(gòu)建

參照文獻(xiàn)[8]方法構(gòu)建動物AIT 模型，將PTg 與完全弗氏佐劑按體積比1∶1 制成油包水乳劑，制備質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的溶液。按50 μg/只的劑量從動物背部皮下選取多個注射點(diǎn)注射上述自制的乳劑，給藥1 次/周，給藥周期為2 周。從第3 周開始注射由不完全弗氏佐劑聯(lián)合PTg 乳化的油包水乳劑，制備質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL 的溶液，給藥劑量和頻次同上，給藥周期為3周，每周的注射部位分別為背部皮下、頸部皮下以及腹腔，每日正常自由飲用高碘水，質(zhì)量濃度為0.63 mg/mL，構(gòu)建小鼠AIT模型。

2.2 分組與給藥

實(shí)驗(yàn)分為6 組：空白對照組、模型組、雷公藤多苷片組、芹菜素低、中、高劑量組，每組10 只。造模后灌胃給藥，其中雷公藤多苷片組給藥劑量為5 mg/（kg·d），芹菜素低、中、高劑量組的給藥劑量分別為[15、30、60 mg/（kg·d）]，而空白對照組和模型組給予等量0.9%NaCl 溶液，1 次/d，共14 d。

2.3 檢測指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)完成后，小鼠摘眼球取血，靜置4 ℃冰箱2 h，3 500 r/min 4 ℃冷凍離心5 min，小心分離血清并-80 ℃保存?zhèn)溆?。酶?lián)免疫法分別檢測血清中TGAb、TPOAb的水平。ELISA酶聯(lián)免疫法檢測TNF-α和IL-1β水平?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測血清SOD 活性和MDA 含量。小心分離小鼠甲狀腺組織，10%（φ）中性甲醛溶液浸泡固定左側(cè)甲狀腺組織，用于石蠟包埋、切片和HE 染色，觀察甲狀腺病理學(xué)變化。Western blot 法檢測右側(cè)甲狀腺組織勻漿Bcl-2和Bax的蛋白含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 17.0 軟件，計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠血清TGAb和TPOAb水平

與空白對照組比較，模型組小鼠血清TGAb 和TPOAb水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素給藥組小鼠血清TGAb 和TPOAb水平均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與芹菜素低劑量組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素高劑量組小鼠血清TGAb 和TPOAb 水平明顯降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠血清TGAb和TPOAb水平Figure 1 Levels of TGAb and TPOAb in serum of mice in each group()

3.2 各組小鼠血清SOD活性和MDA含量

與空白對照組比較，模型組小鼠血清SOD 活性明顯降低（P＜0.01），MDA 含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素給藥組小鼠血清SOD 活性明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA含量明顯降低（P＜0.01）。與芹菜素低劑量組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素高劑量組小鼠血清SOD活性明顯升高（P＜0.05），MDA 含量明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠血清SOD活性和MDA含量Figure 2 SOD activity and MDA content in serum of mice in each group()

3.3 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平

與空白對照組比較，模型組小鼠血清TNF-α和IL-1β水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素給藥組小鼠血清TNF-α和IL-1β水平均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與芹菜素低劑量組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素高劑量組小鼠血清TNF-α和IL-1β水平明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠血清TNF-α和IL-1β水平Figure 3 Levels of TNF-α and IL-1β in serum of mice in each group()

3.4 各組小鼠甲狀腺組織病理學(xué)觀察

空白對照組小鼠甲狀腺組織中腺泡呈立方狀，間質(zhì)厚度正常，無炎癥細(xì)胞浸潤，腺泡腔內(nèi)的膠質(zhì)分布均勻（圖4A）。模型組小鼠甲狀腺結(jié)構(gòu)異常，濾泡間隔厚薄不一，大量炎癥細(xì)胞浸潤（圖4B）。相對模型組，雷公藤多苷片組和芹菜素給藥組以上癥狀有不同程度的改善，可見甲狀腺濾泡間隔變薄，炎癥細(xì)胞浸潤減輕，其中芹菜素高劑量組和雷公藤多苷片組改善效果最好（圖4C-F）。

圖4 各組小鼠甲狀腺組織病理學(xué)觀察（HE染色，200×）Figure 4 Histopathological observation of thyroid tissue of mice in each group(HE staining,200×)

3.5 各組小鼠甲狀腺組織Bcl-2、Bax、Notch1 和ROR-γt蛋白的表達(dá)水平

與空白對照組比較，模型組小鼠甲狀腺組織Bcl-2 蛋白的相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），而Bax、Notch1 和ROR-γt 蛋白的相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素給藥組小鼠甲狀腺組織Bcl-2 蛋白的相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），而Bax、Notch1和RORγt 蛋白的相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與芹菜素低劑量組比較，芹菜中，高劑量組Bax相對表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01）。與芹菜素低劑量組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素高劑量組小鼠甲狀腺組織Bcl-2 蛋白的相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），而Notch1 和ROR-γt 蛋白的相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組小鼠甲狀腺組織Bcl-2、Bax、Notch1和ROR-γt蛋白的表達(dá)水平Figure 5 Expression levels of Bcl-2,Bax,Notch1 and ROR-γt in Thyroid tissues of mice in each group()

4 討論

AIT 是免疫系統(tǒng)功能紊亂、環(huán)境以及遺傳等多種因素綜合作用所引起的一種自身免疫性疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)除免疫功能紊亂外，炎癥、氧化損傷和凋亡等機(jī)制共同參與該病的發(fā)生發(fā)展。目前，以動物皮下多點(diǎn)注射豬甲狀腺球蛋白聯(lián)合高碘水的方法建立的AIT 動物模型較為常見，該模型不僅能較好地模擬AIT的主要癥狀，而且操作簡單、模型復(fù)現(xiàn)性好，受到較多的科研工作者青睞[9]。近年來，隨著中醫(yī)藥研究的不斷深入，特別在抗AIT藥物發(fā)掘方面取得了一定的進(jìn)展。如雷公藤多苷片，其主要用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病的治療，最近研究表明其可能通過抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及抗氧化損傷等作用對AIT 具有良好的療效[10]。因此，本研究選取雷公藤多苷片作為陽性對照藥，比較芹菜素對小鼠AIT模型的作用。

芹菜素是一種廣泛存在于各種水果和蔬菜、豆科植物以及茶葉中的黃酮類化合物，其具有良好的抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗病毒等多種生物活性，本研究探討其對小鼠AIT模型的作用及機(jī)制。TGAb 和TPOAb 作為AIT 的兩種特征性自身抗體，是臨床診斷AIT 的重要指標(biāo)之一[11]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組血清TGAb 和TPOAb 水平較空白對照組明顯升高，甲狀腺損傷嚴(yán)重，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，血清TNF-α和IL-1β水平明顯升高，提示小鼠AIT模型構(gòu)建成功。給予雷公藤多苷片和芹菜素后，小鼠血清TGAb、TPOAb、TNF-α和IL-1β水平明顯降低，明顯改善甲狀腺組織炎癥細(xì)胞浸潤程度，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其中以雷公藤多苷片組和芹菜素高劑量組效果最優(yōu)。SOD 和MDA 是現(xiàn)代研究機(jī)體氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)之一。SOD 作為機(jī)體重要的抗氧化酶，對自由基具有消除作用，可防御機(jī)體的氧化損傷[12]。MDA 作為機(jī)體氧化損傷后產(chǎn)物，其水平與機(jī)體氧化損傷程度成正比[13]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組的血清SOD 活性較空白對照組明顯降低，而MDA 含量明顯升高。給予雷公藤多苷片和芹菜素后血清SOD 活性明顯升高，MDA 含量明顯降低。其中以雷公藤多苷片組和芹菜素高劑量組效果最優(yōu)。Bcl-2 是機(jī)體內(nèi)一種重要的凋亡抑制基因，能遏制多種有害因素導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。相反，Bax 是機(jī)體內(nèi)一種重要的凋亡促進(jìn)基因，可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠甲狀腺組織Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平較空白對照組明顯下調(diào)，而Bax 蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)。給予雷公藤多苷片和芹菜素后，小鼠甲狀腺組織Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，Bax 蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)。其中以雷公藤多苷片組和芹菜素高劑量組效果最優(yōu)。近年來，研究表明Notch1和ROR-γt除了參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用外，還參與調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)，與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)芹菜素和雷公藤多苷片可抑制小鼠甲狀腺組織Notch1 和ROR-γt 蛋白的表達(dá)水平，其中以芹菜素高劑量組和雷公藤多苷片組效果最優(yōu)。提示芹菜素可能通過Notch1/RORγt信號通路改善自身免疫性疾病的凋亡和炎癥。

綜上所述，芹菜素可通過降低小鼠AIT 特征性自身抗體TGAb、TPOAb水平，減輕炎癥細(xì)胞浸潤程度和氧化應(yīng)激損傷，以及抑制細(xì)胞凋亡，對AIT具有較好的保護(hù)作用。