天竺葵素抑制肺癌進展的作用和機制研究

靳彩玲，姬穎華，王犖楠，楊軍，張清琴，牛紅蕊

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南新鄉(xiāng) 453000）

肺癌是所有癌癥中發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，是嚴重的世界公共衛(wèi)生問題[1]。目前，肺癌的具體發(fā)病機制尚不完全清楚，抑制肺癌細胞惡性生長是肺癌治療的主要研究方向。天竺葵素（pelargonidin，PEL）是天然的花青素單體，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等生理活性[2]。大量研究報道，不同來源的PEL 對肺癌、胃癌、肝癌等均有一定的抑制作用[3-5]。但PEL 在肺癌中的具體作用機制尚不完全清楚。本研究擬通過網(wǎng)絡藥理學分析PEL在肺癌中的潛在治療靶點，并通過相關功能實驗進行驗證，旨在探討PEL 治療肺癌的分子機制，為其臨床應用開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與實驗動物來源 人肺癌細胞NCIH1975、NCI-H292 購自上海中科院細胞庫；16 只BALB/c裸鼠，SPF級，雄性，6周齡，體質(zhì)量16～20 g，購自河南省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCⅩK（豫）2017-0001。

1.1.2 藥品 PEL 購自美國Sigma，質(zhì)量分數(shù)＞98%，取3.07 mg PEL 溶于10 mL 無菌水中，配制為100 mmol/L 母液，再梯度稀釋為10、20、25、40、50、80、100μmol/L的溶液。

1.1.3 試劑與儀器 干擾KIF11（shKIF11）慢病毒載體及雜序的短發(fā)卡RNA 陰性對照（shNC）、pcDNAKIF11 質(zhì)粒及其陰性對照物（Vector）由北京閱微基因技術股份有限公司提供；脂質(zhì)體2000 試劑盒（美國Invitrogen）；細胞計數(shù)（CCK-8）試劑（美國GLPBIO）；Transwell 小室、基質(zhì)膠（美國BD）；正常山羊血清、生物素化山羊抗兔、細胞裂解液（上海碧云天生物科技有限公司）；兔抗細胞增殖抗原Ki67、KIF11 抗體（美國Abcam）；iMARK 酶標儀（美國Bi-Rad）；CⅩ21BIM-SET5顯微鏡（日本OLYMPUS）。

1.2 PEL潛在靶點的預測和篩選

在PubChem 中獲取PEL 的SMILES 號，并導入SwissTarget 和TargetNet 數(shù)據(jù)庫，獲取PEL 的預測作用靶點；下載TCGA_LUSC 數(shù)據(jù)矩陣，利用生信人工具采用t-檢驗統(tǒng)計學方法進行差異基因分析，篩選出在肺癌患者中表達上調(diào)的基因；下載TCGA_LUSC 臨床信息，將肺癌患者分為臨床分期I期和Ⅱ～Ⅳ期兩組以及T1期和T2～T4期兩組，進行差異基因分析，篩選出在臨床分期Ⅱ～Ⅳ期/T2～T4期組中表達上調(diào)的基因。對PEL 潛在靶點、表達上調(diào)基因以及在臨床分期Ⅱ～Ⅳ期/T2～T4 期組中高表達的基因取交集。進一步分析共同基因表達水平與淋巴結轉(zhuǎn)移（N 分期）之間的關系，篩選出目標基因KIF11。

1.3 實驗分組

（1）添加不同濃度PEL處理細胞（NCI-H1975：10、25、50、100 μmol/L，NCI-H292：10、20、40、80 μmol/L），并設置空白對照（Control，不含藥物的培養(yǎng)基），觀察PEL 對NCI-H1975、NCI-H292 細胞活性及KIF11表達的影響；（2）選取細胞生存率約50%的PEL 濃度（NCI-H1975：50 μmol/L、NCI-H292：40 μmol/L）為實驗濃度處理細胞，并設置空白對照（Control），觀察PEL對NCI-H1975、NCI-H292 細胞惡性生物學行為的影響；（3）構建肺癌裸鼠荷瘤模型，分為Control組和PEL 組，觀察PEL 對裸鼠腫瘤生長的影響；（4）參照脂質(zhì)體2000 試劑盒操作，以shKIF11 慢病毒載體及shNC 轉(zhuǎn)染細胞，分為shNC 組、shKIF11 1#組和shKIF11 2#組，觀察KIF11低表達對NCI-H1975、NCI-H292 細胞惡性生物學行為的影響；（5）以pcDNA-KIF11 質(zhì)粒及Vector 轉(zhuǎn)染細胞，分為Vector 組和KIF11 組，檢測KIF11 蛋白的表達；（6）將細胞分為Contorl 組、PEL 組 和PEL+KIF11 組，觀 察PEL、KIF11 對NCI-H1975、NCI-H292 細胞惡性生物學行為的影響。

1.4 CCK-8檢測細胞活性

取各組細胞以1×105密度接種于96 孔板，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d，隔天更換新鮮培養(yǎng)基，添加含有10%（φ）CCK-8試劑的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于450 nm處檢測各孔吸光度（A）值，以吸光度值表示細胞活性。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移

取各組細胞以1×106密度接種于6孔板，待細胞貼壁后，用200 μL 微量槍頭垂直于孔底劃痕，拍照記錄0 h 劃痕寬度，培養(yǎng)24 h，再次拍照記錄24 h 劃痕寬度。

1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲

預先用基質(zhì)膠包被小室上室，取各組細胞以2×105密度接種于小室上室，下室添加含有10%（φ）胎牛血清培養(yǎng)基作為趨化物，培養(yǎng)48 h，取出小室輕輕拭去基質(zhì)膠和上室內(nèi)細胞，固定于冰甲醛溶液，結晶紫染色，顯微鏡下觀察并計數(shù)侵襲細胞。

1.7 肺癌裸鼠荷瘤模型的建立

正常培養(yǎng)NCI-H1975 細胞，制備為5×106/L 細胞懸液，取0.2 mL 接種于裸鼠右腋部背側皮下，接種5～10 d 后觀察到接種部位可觸及腫瘤結節(jié)表明建模成功。將荷瘤模型裸鼠分為兩組：Control組和PEL 組，每組8 只，PEL 組隔天腹腔注射3 mg/kg PEL[6]，Control 組以等體積生理鹽水替代，測量腫瘤長、短徑，計算其體積，藥物注射第14 天時處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤組織，測量體積及質(zhì)量后置于中性甲醛溶液中固定，制備石蠟切片。

1.8 免疫組化檢測腫瘤組織中增殖抗原標記物Ki67的表達

取出腫瘤組織石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后，滴加3%（φ）H2O2溶液滅活10 min，高溫修復抗原15 min，分別添加正常山羊血清、Ki67 一抗（稀釋比1∶100）、生物素化山羊抗兔（稀釋比1∶500），終止反應后進行二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染，脫水、透明后封片，顯微鏡下觀察陽性染色細胞（棕黃色顆粒），利用Image-ProPlus 軟件測定陽性細胞平均吸光度值（A）。

1.9 蛋白印跡檢測細胞中KIF11表達

添加細胞裂解液提取各組細胞中總蛋白，測定濃度后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，待蛋白完全分離后停止電泳，冰上轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入一抗KIF11（稀釋比1∶1 000），4 ℃下孵育過夜，再加入二抗（稀釋比1∶5 000），37 ℃孵育1 h，最后化學發(fā)光顯影。以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，計算KIF11的相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PEL潛在靶點的預測和篩選

如圖1，韋恩分析結果顯示，SwissTarget 數(shù)據(jù)庫與TargetNet數(shù)據(jù)庫預測PEL 的靶點，二者取并集得112 個靶點；下載TCGA_LUSC 數(shù)據(jù)矩陣和臨床信息，對PEL 潛在靶點、表達上調(diào)基因以及在臨床分期Ⅱ～Ⅳ期/T2～T4 期組中高表達的基因取交集，結果發(fā)現(xiàn)有KIF11和周期素依賴性激酶1（CDK1）2 個共同基因。進一步分析KIF11和CDK1基因表達水平與淋巴結轉(zhuǎn)移之間的關系，結果表明N1 期組肺癌患者中KIF11表達水平更高（P＜0.05）。因此，KIF11作為目標基因進一步研究。

圖1 PEL潛在靶點的預測和篩選Figure 1 Prediction and screening of PEL's potential targets

2.2 PEL對肺癌細胞惡性生物學行為的影響

如圖2，與Control組比較，10、25、50、100 μmol/L PEL 處理后NCI-H1975 細胞活性明顯降低，10、20、40、80 μmol/L PEL 處理后NCI-H292 細胞活性明顯降低（P＜0.05），50 μmol/L/40 μmol/L PEL 處理NCIH1975/NCI-H292 細胞后，細胞的存活率均在50%左右，因此選取50 μmol/L 和40 μmol/L PEL 干預NCI-H1975、NCI-H292 細胞做后續(xù)功能實驗。與Control 組比較，PEL 組細胞活性、遷移能力及侵襲數(shù)明顯降低（P＜0.05）。

圖2 PEL對肺癌細胞惡性生物學行為的影響Figure 2 Effects of PEL on malignant biological behaviors of lung cancer cells

2.3 PEL對肺癌裸鼠荷瘤模型腫瘤生長的影響

如圖3，與Control組比較，PEL組裸鼠腫瘤組織體積、質(zhì)量及Ki67陽性表達明顯降低（P＜0.05）。

圖3 PEL對肺癌裸鼠荷瘤模型腫瘤生長的影響Figure 3 Effects of PEL on the growth of lung cancer in tumor-bearing nude mice models

2.4 PEL對肺癌細胞中KIF11表達的影響

如圖4，與Control 組比較，10、25、50、100 μmol/L PEL 處理后NCI-H1975 細胞中KIF11表達明顯降低，10、20、40、80 μmol/L PEL處理后NCI-H292細胞中KIF11表達明顯降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。50 μmol/L和40 μmol/L PEL分別處理NCI-H1975和NCI-H292 細胞12、24、48 h，NCI-H1975、NCI-H292細胞中KIF11表達明顯降低（P＜0.05），呈時間依賴性。

圖4 PEL對肺癌細胞中KIF11表達的影響Figure 4 Effects of PEL on the expression of KIF11 in lung cancer cells

2.5 低表達KIF11 對肺癌細胞惡性生物學行為的影響

如圖5，與shNC組比較，shKIF11 1#組和shKIF11 2#組KIF11表達、細胞活性、遷移能力及侵襲數(shù)明顯降低（P＜0.05）。

圖5 低表達KIF11對肺癌細胞惡性生物學行為的影響Figure 5 Effects of low-expression KIF11 on malignant biological behaviors of lung cancer cells

2.6 PEL 靶向KIF11 對肺癌細胞惡性生物學行為的影響

如圖6，與Vector 組比較，KIF11 組KIF11表達明顯升高（P＜0.05）；與PEL 組比較，PEL+KIF11 組KIF11表達、細胞活性、遷移能力及侵襲數(shù)明顯升高（P＜0.05）。

圖6 PEL靶向KIF11對肺癌細胞惡性生物學行為的影響Figure 6 Effects of PEL on the malignant biological behaviors of lung cancer cells by targeting KIF11

3 討論

近年來，植物天然產(chǎn)物在阻止、逆轉(zhuǎn)或延緩癌癥進展方面有重要作用，已成為腫瘤學領域的研究熱點[7]。研究表明，食用富含類黃酮的食物可能降低癌癥風險[8]。黃酮類化合物是植物中常見的一類次生代謝產(chǎn)物，可存在于植物葉子、花、種子、莖等多個部位，具有豐富的生物活性，如抗癌、抗氧化、抗病毒等[9-10]。PEL 是一種類黃酮前體化合物合成的花青素，也表現(xiàn)出一定的抗癌活性[11]。Chen 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PEL 對骨肉瘤細胞U2OS 有明顯的抑制作用，可能與阻滯PI3K/AKT 信號通路有關。本研究通過檢測細胞惡性生物學行為能力，發(fā)現(xiàn)PEL 可抑制肺癌細胞NCI-H1975、NCI-H292 的增殖、遷移及侵襲能力，同時構建肺癌裸鼠荷瘤模型，通過腫瘤生長曲線、體積、質(zhì)量及腫瘤組織中增殖抗原標記物Ki67的表達，結果顯示PEL在體內(nèi)也表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性。但PEL 抗肺癌的具體分子機制尚不清楚。

本研究應用網(wǎng)絡藥理學分析PEL 的潛在靶點，初步篩選出112 個靶點，進一步下載TCGA_LUSC數(shù)據(jù)矩陣和臨床信息，最終確定KIF11為靶基因進行后續(xù)驗證實驗。驅(qū)動蛋白超家族（KIFs）是調(diào)控細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的一類蛋白，不僅可控制細胞形態(tài)，還在高級生物功能中有重要作用[13]。近期報道結果顯示，KIFs 還參與人類癌癥的發(fā)生發(fā)展[14]。KIF11作為成員之一，主要參與紡錘體的形成及其動力學的維持，在多種癌癥中存在異常表達[15]。Zhou 等[16]利用生物信息學軟件篩查乳腺癌中差異表達基因，發(fā)現(xiàn)KIF11可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的潛在致癌基因，與其不良預后密切相關。Yang 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，KIF11、KIF4A、FOXM1等基因在卵巢癌中異常表達，與疾病進展有關，可用于治療卵巢癌潛在靶向藥物的開發(fā)。李蓉等[18]研究顯示，非小細胞肺癌中KIF11高表達，對于患者臨床診治和預后預測有較好前景。本研究結果顯示，KIF11在肺癌組織中異常高表達，且與患者臨床分期、T 分期及N 分期等臨床病理特征有關，提示KIF11高表達可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。敲低KIF11表達后，肺癌細胞增殖、遷移與侵襲能力明顯降低，證實KIF11在肺癌中發(fā)揮促癌因子作用。Hu[19]、Li[20]等基礎研究結果也顯示，KIF11可促進肝癌、肺腺癌細胞增殖、遷移與侵襲。另外，PEL 處理細胞后，KIF11表達明顯降低，增強細胞中KIF11表達后，可逆轉(zhuǎn)PEL 對肺癌細胞的抑制作用，表明PEL 抑制肺癌細胞增殖、遷移與侵襲，是通過靶向抑制KIF11表達實現(xiàn)的。

綜上所述，PEL可抑制肺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，其作用機制可能與靶向抑制KIF11表達有關。但PEL 在肺癌中是否還存在其他作用途徑，仍需要深入分析和研究。