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    張氏消腫定痛膏透皮吸收物質(zhì)基礎(chǔ)研究

    2021-12-14 06:01:10徐長瓊李然任秋蕓梅君黎珊黃會保夏麗瓊
    廣東藥科大學(xué)學(xué)報 2021年6期
    關(guān)鍵詞:張氏消腫酚酸

    徐長瓊 ,李然 ,任秋蕓 ,梅君 ,黎珊 ,黃會保,夏麗瓊

    (1.岳陽市婦幼保健院科研所,湖南岳陽 414000;2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廣東汕頭 515000;3.岳陽市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,湖南岳陽 414000)

    “岳陽張氏正骨術(shù)”由張瑞林創(chuàng)立,歷經(jīng)百余年理論發(fā)展及實(shí)踐驗(yàn)證,成為湖湘中醫(yī)正骨的主流學(xué)派,2012 年被國家中醫(yī)藥管理局確定為第一批全國十三大骨傷學(xué)術(shù)流派傳承工作室建設(shè)項目,2017 年獲評“湖南省非物質(zhì)文化遺產(chǎn)代表性項目”[1-4]。

    “岳陽張氏正骨術(shù)”提倡內(nèi)外相合用藥,百余年來積累了多種有效秘方,自擬自制過張氏消腫定痛膏、接骨止痛膠囊等10 余種院內(nèi)制劑,用于治療急慢性軟組織損傷,臨床療效顯著,安全性良好。然而,張氏消腫定痛膏治療骨傷科疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)研究及其外用透皮吸收物質(zhì)基礎(chǔ)研究均未見文獻(xiàn)報道,本項目擬使用大鼠離體皮膚,制備張氏消腫定痛膏透皮滲透液,通過UPLC-MS/MS和自建數(shù)據(jù)庫等廣泛靶向代謝組學(xué)研究平臺,研究張氏消腫定痛膏透皮吸收物質(zhì)基礎(chǔ),了解藥物透皮吸收成分及相對含量,明確張氏消腫定痛膏發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

    1 儀器與試劑

    超高效液相色譜(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A);串聯(lián)質(zhì)譜(Applied Biosystems 6500 QTRAP);BSA224S-CW 型電子分析天平[(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司];ⅩMTD-7000 磁力攪拌器(天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠);甲醇、乙腈、乙醇為Merck 色譜純試劑;標(biāo)準(zhǔn)品(BioBio-Pha/Sigma-Aldrich);張氏消腫定痛膏由岳陽市中醫(yī)院骨傷科提供。

    2 方法

    2.1 供試品的制備

    張氏消腫定痛膏原藥提取物的制備:取各張氏消腫定痛膏原藥0.5 g,置15 mL 離心管中,加甲醇10 mL,超聲提取1 h,加甲醇至刻度,搖勻,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過,即得。

    張氏消腫定痛膏透皮成分的制備:健康SD 大鼠處死后剃毛,剝離大鼠背部皮膚,剔除皮下脂肪以及粘連物,剪成適當(dāng)大小,-20 ℃保存;用時解凍,生理鹽水浸潤,自制滲透池,角質(zhì)層面敷貼張氏消腫定痛膏,真皮層面向接受室,接受池中加10 mL預(yù)熱生理鹽水,37 ℃恒溫攪拌,每隔2 h從接受池吸取滲透液后再補(bǔ)加預(yù)熱生理鹽水,重復(fù)以上步驟至12 h,即得透皮滲透液(制備過程見圖1)。待測液高速離心后取上清液,0.22 μm 微孔濾膜濾過,UPLCMS/MS測定主要成分含量??瞻捉M不加藥,用以排除大鼠皮膚及裝置物質(zhì)干擾。

    圖1 張氏消腫定痛膏透皮滲透液的制備Figure 1 Preparation of osmotic solution of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

    2.2 測定條件

    液相條件:色譜柱為Agilent SBC18柱(1.8 μm,2.1 mm×100 mm);以超純水(加入0.1%的甲酸)為流動相A相,乙腈為B相,洗脫梯度(0.00 min,5%B;9.00 min 內(nèi),95%B,維持1 min;10.00~11.10 min,5%B;并以5%平衡至14 min);流速為0.35 mL/min;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為2 μL。

    質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)溫度550 ℃,質(zhì)譜電壓5 500 V,簾氣(curtain gas,CUR)206.85 kPa,碰撞誘導(dǎo)電離(collision-activated dissociation,CAD)參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級桿(QQQ)中,每個離子對是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(declustering potential,DP)和碰撞能(collision energy,CE)進(jìn)行掃描檢測。

    2.3 定性定量分析方法

    2.3.1 定性分析 基于自建數(shù)據(jù)庫MWDB(metware database),根據(jù)二級譜信息進(jìn)行定性,分析時去除同位素信號,含K+離子、Na+離子、NH4+離子的重復(fù)信號,以及本身是其他更大分子量物質(zhì)的碎片離子的重復(fù)信號。

    2.3.2 定量分析 利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring,MRM)分析完成。MRM 模式中,四級桿首先篩選目標(biāo)物質(zhì)的前體離子(母離子),排除其他分子量物質(zhì)對應(yīng)的離子以初步排除干擾;前體離子經(jīng)碰撞室誘導(dǎo)電離后斷裂形成很多碎片離子,碎片離子再通過三重四級桿過濾選擇出所需要的一個特征碎片離子,排除非目標(biāo)離子干擾。獲得不同樣本的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后,用MultiaQuant軟件打開樣本下機(jī)質(zhì)譜文件,進(jìn)行色譜峰的積分和校正工作,每個色譜峰的峰面積(Area)代表對應(yīng)物質(zhì)的相對含量,并對其中同一化合物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正。

    2.4 樣本質(zhì)控分析

    質(zhì)控樣本(QC)由樣本提取物混合制備而成,用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性。在儀器分析的過程中,每10 個檢測分析樣本中插入1 個質(zhì)控樣本,以監(jiān)測分析過程的重復(fù)性。

    2.5 數(shù)據(jù)處理

    分類比較透皮吸收物質(zhì)總數(shù)量;將所有檢測到的化合物總峰面積相加為100%,然后將每個成分單獨(dú)色譜峰峰面積/總峰面積,得該峰所對應(yīng)化合物相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%),根據(jù)相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)值比較每一類化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)和該類化合物分布;每類物質(zhì)列出相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.01%或最高的20種化合物。

    3 結(jié)果

    3.1 數(shù)據(jù)結(jié)果評估

    利用軟件Analyst 1.6.3 處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。圖2 為樣品、混樣質(zhì)控QC 樣本的總離子流圖(Total ions current,TIC)及MRM 代謝物檢測多峰圖(多物質(zhì)提取的離子流譜圖,ⅩIC)。通過對不同質(zhì)控QC 樣本質(zhì)譜檢測分析的總離子流圖進(jìn)行重疊展示分析,可見代謝物提取和檢測重復(fù)性、儀器穩(wěn)定性良好,數(shù)據(jù)可靠。

    圖2 張氏消腫定痛膏UPLC-MS/MS離子流圖Figure 2 UPLC-MS/MS ion flow map of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

    3.2 張氏消腫定痛膏及其滲透液中的化學(xué)成分

    張氏消腫定痛膏中總共檢測到542 種化合物(圖3,ZSZG),其中黃酮類化合物122 種,酚酸77種,氨基酸及其衍生物42 種,萜類40 種,木脂素和香豆素40 種,有機(jī)酸34 種,生物堿33 種,核苷酸及衍生物26 種,脂質(zhì)25 種,醌類12 種,鞣酸9 種,維生素8種,糖及醇類5種,其他69種。

    張氏消腫定痛膏滲透液中總共檢測到422種化合物(圖3,ZSZG-D),其中酚酸71種,黃酮類化合物75 種,萜類37 種,木脂素和香豆素38 種,有機(jī)酸31種,生物堿27 種,氨基酸及其衍生物28 種,醌類10種,核苷酸及衍生物16 種,脂質(zhì)12 種,鞣酸6 種,其他71種。

    圖3 張氏消腫定痛膏(ZSZG)及透皮滲透液(ZSZG-D)中化合物分類及數(shù)量Figure 3 Classification and quantity of compounds in Zhang's antiswelling (ZSZG) and relieving pain ointment and dialysate(ZSZG-D)

    3.3 張氏消腫定痛膏滲透液中化合物的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)

    將同類物質(zhì)相對百分比相加,計算該類化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)(圖4),其中生物堿占(6.33±2.10)%,酚酸占(37.83±9.23)%,有機(jī)酸占(7.91±2.22)%,黃酮占(5.61±0.60)%,萜類占(3.20±0.92)%,木脂素和香豆素占(3.31±1.03)%,氨基酸及衍生物占(9.99±1.20)%,醌類占(2.05±0.91)%,核苷酸及衍生物占(7.78±1.29)%,脂質(zhì)占(3.48±0.10)%,鞣酸占(0.13±0.09)%,其他化合物占(12.39±2.91)%。

    圖4 張氏消腫定痛膏滲透液中化合物分類及總相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)Figure 4 Classification and total relative content of compounds in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

    將同類物質(zhì)相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行統(tǒng)計(圖5),其中酚酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,但各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大,最高的化合物為綠原酸*(*代表同分異構(gòu)體,下同)。

    圖5 張氏消腫定痛膏滲透液中化合物分類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布Figure 5 Classification and content distribution of compounds in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

    3.4 張氏消腫定痛膏的主要透皮成分

    將每類物質(zhì)相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行排序,選取相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的20 種或大于0.01%的化合物列表。可見氨基酸及其衍生物、酚酸、黃酮、木脂素和香豆素、生物堿、萜類、有機(jī)酸、核苷酸及其衍生物、脂質(zhì)、醌類和鞣質(zhì)中,質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的化合物依次為L-精氨酸(表1)、綠原酸*(表2)、6-羥基山柰酚-3,6-O-二葡萄糖苷-7-O-葡萄糖醛酸(表3)、5-甲氧基-8-羥基補(bǔ)骨脂素(表4)、去甲麻黃堿(表5)、獐牙菜苷(表6)、氨基丙二酸(表7)、N6-琥珀酰腺苷(表8)、十六烷基鞘胺醇(表9)、大黃酸-8-O-(6′-O-乙?;?葡萄糖(表10)和沒食子酸(表11),其他化合物中羥基紅花黃色素A質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(表12)。

    表1 張氏消腫定痛膏滲透液中主要氨基酸及其衍生物(前20種)Table 1 Main amino acids and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表1 張氏消腫定痛膏滲透液中主要氨基酸及其衍生物(前20種)Table 1 Main amino acids and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表2 張氏消腫定痛膏滲透液中主要酚酸類物質(zhì)(前20種)Table 2 Main phenolic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表2 張氏消腫定痛膏滲透液中主要酚酸類物質(zhì)(前20種)Table 2 Main phenolic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表3 張氏消腫定痛膏滲透液主要黃酮類物質(zhì)(前20種)Table 3 Main flavonoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表3 張氏消腫定痛膏滲透液主要黃酮類物質(zhì)(前20種)Table 3 Main flavonoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表4 張氏消腫定痛膏滲透液中主要木脂素和香豆素(前20種)Table 4 Main lignans and coumarins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表4 張氏消腫定痛膏滲透液中主要木脂素和香豆素(前20種)Table 4 Main lignans and coumarins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表5 張氏消腫定痛膏滲透液中主要生物堿(前20種)Table 5 The main alkaloid in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表5 張氏消腫定痛膏滲透液中主要生物堿(前20種)Table 5 The main alkaloid in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表6 張氏消腫定痛膏滲透液中主要萜類化合物(前20種)Table 6 Main terpenoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表6 張氏消腫定痛膏滲透液中主要萜類化合物(前20種)Table 6 Main terpenoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表7 張氏消腫定痛膏滲透液中主要有機(jī)酸(前20種)Table 7 Main organic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表7 張氏消腫定痛膏滲透液中主要有機(jī)酸(前20種)Table 7 Main organic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表8 張氏消腫定痛膏滲透液中主要核苷酸及衍生物(>0.01%)Table 8 Main nucleotides and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(>0.01%)(,n=3)

    表8 張氏消腫定痛膏滲透液中主要核苷酸及衍生物(>0.01%)Table 8 Main nucleotides and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(>0.01%)(,n=3)

    表9 張氏消腫定痛膏滲透液中主要脂質(zhì)(>0.01%)Table 9 Main lipids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(>0.01%)(,n=3)

    表9 張氏消腫定痛膏滲透液中主要脂質(zhì)(>0.01%)Table 9 Main lipids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(>0.01%)(,n=3)

    表10 張氏消腫定痛膏滲透液中主要醌類物質(zhì)(>0.01%)Table 10 Main quinones in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(>0.01%)(,n=3)

    表10 張氏消腫定痛膏滲透液中主要醌類物質(zhì)(>0.01%)Table 10 Main quinones in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(>0.01%)(,n=3)

    表11 張氏消腫定痛膏滲透液中主要鞣質(zhì)(>0.01%)Table 11 Main tannins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(>0.01%)(,n=3)

    表11 張氏消腫定痛膏滲透液中主要鞣質(zhì)(>0.01%)Table 11 Main tannins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(>0.01%)(,n=3)

    表12 張氏消腫定痛膏滲透液中其他主要物質(zhì)(前20種)Table 12 Main other substances in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    表12 張氏消腫定痛膏滲透液中其他主要物質(zhì)(前20種)Table 12 Main other substances in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

    4 討論

    張氏消腫定痛膏是張氏正骨學(xué)術(shù)流派傳承人在中醫(yī)理論及張氏正骨學(xué)術(shù)思想指導(dǎo)下研制而成,由骨碎補(bǔ)、當(dāng)歸、紅花、川芎、續(xù)斷、龍血竭、王不留行、梔子、大黃等25味中藥制成,在岳陽市中醫(yī)醫(yī)院及張氏正骨學(xué)術(shù)流派工作室臨床工作中,歷經(jīng)20余年數(shù)萬例的臨床驗(yàn)證,具有行氣、活血化瘀、消腫止痛的功效,對損傷軟組織無菌性炎癥的改變、局部急性炎癥的修復(fù)具有重要促進(jìn)作用[1-4]。

    本研究結(jié)果顯示,張氏消腫定痛膏中總共檢測到542種化合物,其中黃酮類化合物和酚酸最多,分別為122 種和77 種。張氏消腫定痛膏滲透液中檢測到422 種化合物,其中最多的是酚酸71 種,黃酮類化合物75 種,萜類37 種;相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的依次為酚酸[(37.83±9.23)%]、氨基酸及衍生物[(9.99±1.20)%]、有機(jī)酸[(7.91±2.22)%]??梢姺铀犷愇镔|(zhì)透皮吸收良好,酚酸具有重要的抗炎[5]和治療神經(jīng)肌肉相關(guān)疾病[6]作用,與張氏消腫定痛膏適應(yīng)證較一致。

    張氏消腫定痛膏滲透液中化合物相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過1.00%的分別為綠原酸*、十六烷基鞘胺醇、L-精氨酸、N6-琥珀酰腺苷、脯氨酸甜菜堿、羥基紅花黃色素A*、N-乙酰-L-谷氨酸、黃嘌呤、大黃酸-8-O-(6′-O-乙?;?葡萄糖、哌啶酸、D-(+)-蔗糖、鄰苯二甲酸二丁酯*、新綠原酸*、3,4-二羥基苯甲醛、6-羥基山柰酚-3,6-O-二葡萄糖苷-7-O-葡萄糖醛酸、氨基丙二酸、4-胍基丁酸、異戊烯基腺苷-7-葡糖苷、2-羥基-3-丁烯基硫苷和去甲麻黃堿,其中綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,它具有抗炎[7-8]、抗氧化[9]等活性作用。透皮吸收化合物主要來源于續(xù)斷[10-11]、紅花[12-13]、大黃[14-15]、川芎[16-17]、枳實(shí)[18]和骨碎補(bǔ)[19]等中藥材,與張氏消腫定痛膏處方較一致。

    本文結(jié)果表明,基于UPLC-MS/MS和自建數(shù)據(jù)庫等廣泛靶向代謝組研究平臺對于復(fù)雜的中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究具有簡便、高效的特點(diǎn),但因儀器分辨率限制,定性分析準(zhǔn)確性存在一定爭議;另外,由于不同化合物在質(zhì)譜中響應(yīng)存在差異,導(dǎo)致使用峰面積進(jìn)行相對定量分析具有一定誤差。但本研究對張氏消腫定痛膏透皮吸收化合物具有初步篩選的作用,對后續(xù)提高制劑療效和質(zhì)量控制具有一定的指導(dǎo)意義。

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