河南省2019～2020年H3N2亞型流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶基因特征分析

僧明華,楊凱朝,王文慧,趙 升,徐 瑾

河南省疾病預防控制中心免疫預防醫(yī)學重點實驗室 鄭州 450016

H3N2亞型流感病毒是河南省近年來的主要流行株，是流感防控的重點[1-2]。由于H3N2型流感病毒持續(xù)發(fā)生變異，自2012年以來，WHO更新了5次疫苗株，但抗原性分析結(jié)果顯示疫苗匹配度較差[3]，疫苗保護效果欠佳[4-5]。H3N2亞型流感病毒的基因不斷發(fā)生抗原性漂移，其蛋白構(gòu)象的改變導致該種型別的流感病毒不易在雞胚中培養(yǎng)，極少數(shù)能夠在雞胚中生長的病毒株又在抗原決定簇發(fā)生了數(shù)個雞胚適應性突變，不能代表流行株的抗原特點[6]，因此H3N2型流感病毒疫苗株的選育成為難點。流感疫苗的生產(chǎn)主要通過經(jīng)典重配技術和反向遺傳技術來建立疫苗種子株，以提高疫苗株的安全性、產(chǎn)量和免疫原性[7-8]。因此需要加強對H3N2型流感病毒的基因特異性監(jiān)測，分析每年度流行株的基因多態(tài)性，篩選出更優(yōu)的疫苗推薦株，以提高疫苗的匹配度和保護效果，同時為疫苗種子株的研發(fā)奠定基礎。作者對河南省2019～2020年H3N2亞型流感病毒的血凝素(hemagglutinin，HA)基因和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)基因進行特異性分析，以期發(fā)現(xiàn)關鍵性突變位點，為流感防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本來源本研究所涉及的甲型 H3N2 亞型流感病毒毒株來源于2019～2020年監(jiān)測年度河南省流感監(jiān)測哨點醫(yī)院流感樣病例(influenza like illness，ILI)咽拭子的分離培養(yǎng)；病例定義、采樣對象及標本采集方法參照《全國流感監(jiān)測技術指南(2017 年版)》[9]。共采集ILI咽拭子標本16 340份，分離到H3N2亞型流感病毒557株，選取流行峰前、中、后共22株流感病毒株進行基因特異性分析。

1.2 樣本采集、核酸檢測及病毒分離咽拭子標本采集后于4 ℃保存，24 h內(nèi)送至流感監(jiān)測哨點醫(yī)院所在地市的流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室。使用Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒(CDC)(天隆科技，型號64T)提取病毒RNA，操作步驟參照說明書。使用甲型/乙型/甲型H1N1亞型/季節(jié)性H3亞型人類流感病毒四重實時熒光定量PCR檢測試劑盒(卓誠惠生)進行流感病毒的核酸檢測，操作步驟和陽性判斷標準參照說明書。將0.5 mL H3N2流感病毒陽性標本接種于25 mL MDCK細胞培養(yǎng)瓶，置于35 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1～2 h。吸出接種物，清洗2遍，然后加入病毒生長液于細胞培養(yǎng)瓶中，置于35 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每日觀察細胞病變情況，當75%～100%細胞出現(xiàn)病變時進行收獲，使用人“O”血球進行血凝試驗和血凝抑制試驗確認病毒株滴度和型別[9]，病毒培養(yǎng)物經(jīng)離心收集上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 序列測定所得病毒株送上海伯杰公司進行HA和NA基因測序。

1.4 基因序列分析采用MEGA7.0軟件中的Clustal W方法對22株流感病毒株HA基因和NA基因的核苷酸和氨基酸序列進行同源性比對，基于最大似然法進行系統(tǒng)發(fā)育分析并構(gòu)建進化樹，Bootstrap法檢驗，重復值設置為1 000。分析序列所用的疫苗株為WHO推薦的流感疫苗株A/Kansas/14/2017、A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016等，其基因序列來自GISAID 公共序列庫。采用NetNGlyc1.0 Server 在線分析軟件(網(wǎng)址https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)對病毒株的HA 和NA基因的N-糖基化位點進行預測。

2 結(jié)果

2.1 同源性特征22株病毒HA和NA基因核苷酸同源性分別為98.5%～100.0%、98.5%～100.0%；氨基酸同源性分別98.2%～100.0%、98.5%～100.0%，同源性較高。與2018～2019年的疫苗株相比，HA基因的核苷酸同源性在98.4%～98.7%，氨基酸同源性97.8%～98.4%；NA基因的核苷酸同源性98.6%～99.1%，氨基酸同源性97.8%～98.7%；與2019～2020年的疫苗株相比，HA基因的核苷酸同源性96.6%～96.8%，氨基酸同源性96.9%～97.5%；NA基因的核苷酸同源性98.1%～98.6%，氨基酸同源性97.4%～98.1%。

2.2 進化樹分析見圖1、2。22株流感病毒株的HA基因和NA基因在進化樹上屬于3C.2a1b分支，與2019～2020年北半球推薦疫苗株A/Kansas/14/2017的遺傳距離較遠，并不處在同一分支上。HA基因與3C.2a1b的3支代表株A/Jilin-Longshan/1235/2018、A/Macao/601326/2018、A/Kanagawa/IC1725/2018/2018[10]聚為一簇，而NA基因只與代表株A/Jilin-Longshan/1235/2018在同一簇，與A/Macao/601326/2018和A/Kanagawa/IC1725/2018/2018的距離稍遠。在HA基因和NA基因的3c.2a1b分支內(nèi)，該22株分成兩個小分支，16株與A/Macao/600344/2020聚為一簇，6株與A/Beijing-Miyun/53/2020等聚為一簇。

●：H3N2型流感分離株；▲：歷年疫苗株圖2 2019～2020年河南省22株H3N2流感病毒NA基因遺傳進化分析

2.3 分子特征分析與2019～2020年度疫苗株相比，所有分離株的HA基因共涉及32處氨基酸突變位點，涉及HA1蛋白的A(N137K，22/22)、B(K160S，22/22；N187K，22/22)、E(E78G，22/22)3個抗原決定簇，此外，S153F(16/22)位于HA蛋白的病毒特異性識別受體結(jié)合位點(receptor binding site，RBS)的口袋裝結(jié)構(gòu)底部，N137K(22/22)位于口袋裝結(jié)構(gòu)的前壁，R342K(22/22)突變位于HA蛋白的裂解位點(疫苗株為PERQTR)。其他共同突變位點有：N107S、S175Y、R342K、I422V、M494，主要突變位點有：K108R(20/22)、K176T(19/22)、S214P(13/22)。

NA基因的氨基酸位點變異共有21處，其中共同的突變位點共有8個：R75K、P126L、I140L、A149V、H155Y、K220N、V303I、T329S，主要突變位點4個：I257V(8/22)、V263I(6/22)、I302L(7/22)、I469T(15/22)，NA基因所有的氨基酸突變位點并非已報道的與耐藥相關的關鍵性突變位點[11]。

2.4 糖基化位點分析對22株HA基因和NA基因進行潛在N-糖基化位點預測分析，結(jié)果顯示，與當年疫苗株(A/Kansas/2017)HA基因的9個糖基化位點相比，22株分離株的糖基化位點發(fā)生149NGT缺失，18株新增174NYT糖基化位點(D區(qū)抗原決定簇)；與上年度疫苗株(A/Singapore/INFIMH/16-0019/2016)HA基因的11個糖基化位點相比，22株分離株的糖基化位點發(fā)生142NWT(A區(qū)抗原決定簇)、149NGT缺失，4株發(fā)生174NYT糖基化位點缺失。

與當年疫苗株NA基因的6個糖基化位點相比，未發(fā)生變異；與上年度疫苗株NA基因的7個糖基化位點相比，發(fā)生329NDS糖基化位點缺失。

3 討論

HA與細胞表面特異性病毒受體的結(jié)合是導致病毒感染的先決條件。HA蛋白上的RBS呈口袋狀，位于HA分子的球區(qū)末端，由底部、后壁、前壁、左側(cè)壁、右側(cè)壁構(gòu)成，分別對應HA的數(shù)個氨基酸位點。大部分流感病毒HA的底部和后壁是保守的，不參與RBS位點與受體結(jié)合，可能起穩(wěn)定RBS結(jié)構(gòu)、促進病毒與受體結(jié)合和病毒繁殖等作用，而前壁和側(cè)壁氨基酸位點的變異可能會影響到RBS與受體結(jié)合的穩(wěn)定性[12]。本研究的22株毒株中，16株病毒發(fā)生RBS底部S153F的變異，22株病毒全部發(fā)生RBS前壁N137K的變異，推測其基因特性和抗原性發(fā)生改變，使之逃避了接種疫苗產(chǎn)生的宿主中和抗體的特異性免疫攻擊，引起了2019～2020年河南省H3N2亞型流感的流行。此外，與受體結(jié)合密切相關的HA裂解位點一般只存在一個堿性氨基酸，若發(fā)生連續(xù)4個以上堿性氨基酸變異，病毒的致病力將會提高[13-14]。本研究的22株病毒發(fā)生了裂解位點內(nèi)的氨基酸突變(R342K)，HA蛋白裂解位點氨基酸序列為PEKQTR(當年疫苗株為PERQTR),然而氨基酸K和R都是堿性氨基酸，且堿性氨基酸的個數(shù)也未發(fā)生變化，因此對病毒的致病力影響不大。

H3N2型流感病毒的HA基因序列分為7個組，其中3C組是最主要的分支，又分為3C.1、3C.2、3C.3三個亞組，在抗原性上相似[15]。3C.2組在2014年以來又分為3C.2a、3C.3a、3C.3b，在3C.2a、3C.3a 亞群中常發(fā)生抗原漂移。2018年以來，3C.2a成為主要流行分支，在分支內(nèi)又分為3C.2a1、3C.2a1b、3C.2a2，每個分支有不同的代表株[16]。本研究所分析的22株河南省H3N2性流感病毒株，與2018～2019年北半球推薦疫苗株A/Singapore/INFIMH/16-0019/2016同源性較高，同屬于3C.2a1分支，然而與2019～2020年北半球推薦疫苗株A/Kansas/14/2017相比，遺傳距離較遠，并不處在同一分支上?？乖苑治霰砻鳎?019～2020年H3N2亞型流行株與疫苗株匹配度僅為20.9%[2]，提示當年度疫苗預防效果欠佳。本文在做基因特征分析時，2020～2021年北半球推薦疫苗株(A/Hongkong/2671/2019)已經(jīng)公布，因而在構(gòu)建系統(tǒng)進化樹時分析了此病毒株，結(jié)果顯示與其同源性極高，推測2020～2021年度流感疫苗對H3N2型流感的預防效果較好。

抗原漂移是影響疫苗效果的關鍵性原因。一般認為，具有流行病學意義的流感病毒變種要存在一定的抗原差異，HA1 蛋白上至少有4個以上氨基酸發(fā)生替換，這些氨基酸替換需涉及2～3個抗原決定簇，上述氨基酸的替代可導致病毒抗原漂移[17]。糖基化位點的改變或增減會對病毒的抗原性和生物特性帶來一定的影響，若糖基化位點變異發(fā)生在抗原決定簇，就會妨礙特異性抗體對病毒的識別，從而造成抗原漂移[18]。本研究所分析的22株河南分離株的HA基因涉及3個抗原決定簇的4個氨基酸位點變異，在1個抗原決定簇增加1個糖基化位點，可以推斷，河南分離株與當年推薦疫苗株的基因特性有較大不同，出現(xiàn)了抗原漂移。

NA蛋白是流感特效藥神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物的靶向作用蛋白，2009年以來，不斷有耐藥株的報道出現(xiàn)，常見的與耐藥相關的H3N2亞型流感病毒NA基因突變位點有E119V/I,R292K,N294S等[11]，這些位點的突變會導致病毒對神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物的敏感性降低。本研究分析的所有NA基因均未發(fā)生上述氨基酸位點的變異，提示河南株對神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物敏感。

綜上所述，2019～2020年河南省H3N2亞型流感病毒株的HA基因發(fā)生了明顯的變異，與疫苗株的匹配度降低可能影響了疫苗的保護效果，從而造成持續(xù)的流行和暴發(fā)；NA基因未發(fā)生耐藥性突變，神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物依然是抗擊流感的特效藥。建議對H3N2型流感病毒進行持續(xù)深入的監(jiān)測，盡快選育出與流行株更為相似的疫苗株，以提高疫苗的預防效果。