VHL基因新突變致VHL綜合征伴腦膜瘤一家系分析

李 沖，王楚楚，齊光照，張麗俠，王志芳，許莉軍，鄭麗麗，秦貴軍，栗夏蓮

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌及代謝科 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州450001 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州450052

von Hippel-Lindau(VHL)綜合征是一種罕見的涉及多系統(tǒng)的常染色體顯性遺傳性腫瘤綜合征(OMIM 193300)，發(fā)病率為1/50 000～1/36 000。VHL基因(ID：7428，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7428)的體系或胚系突變導(dǎo)致多個(gè)器官發(fā)展成為良性、惡性腫瘤和囊腫，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管網(wǎng)狀細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜血管網(wǎng)狀細(xì)胞瘤(HGB)、腎癌(RCC)或腎囊腫、嗜鉻細(xì)胞瘤(PHEO)、胰腺腫瘤或囊腫和生殖系統(tǒng)囊腫等病變[1-3]。VHL綜合征在65歲人群中的外顯率超過90%[4]。該病最常見的死亡原因是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血管網(wǎng)狀細(xì)胞瘤和轉(zhuǎn)移性腎癌及其并發(fā)癥。突變個(gè)體發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)病變的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，常見幕下(小腦、脊髓和腦干)神經(jīng)母細(xì)胞瘤[5]，出現(xiàn)在幕上的病變較為罕見。本研究對(duì)1例VHL綜合征合并右額葉腦膜瘤患者進(jìn)行VHL基因變異家系分析，通過錯(cuò)義突變蛋白功能預(yù)測(cè)軟件Polyphen-2和3D圖對(duì)該突變進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，結(jié)合文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，探討腦膜瘤和VHL綜合征的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 病例資料患者，男，30歲，以“發(fā)作性心悸、頭痛、視物模糊19 a余，視物模糊再發(fā)3個(gè)月”為主訴于2020年3月收住鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌及代謝科。19 a前(2001年)無誘因出現(xiàn)發(fā)作性心悸、頭痛、惡心，伴視物模糊，至當(dāng)?shù)蒯t(yī)院測(cè)血壓200/100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。眼底出血，腎上腺皮髓質(zhì)功能未查，彩超示右腎上腺區(qū)實(shí)性占位(5 cm×2.6 cm×3.5 cm)，行“右側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤摘除術(shù)”。之后監(jiān)測(cè)血壓均正常。15 a前(2005年)在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院查腹部彩超和CT顯示左側(cè)腎上腺區(qū)實(shí)性占位，再次行左側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤摘除術(shù)”。4 a前(2016年)在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院查腹部彩超、增強(qiáng)CT和SPECT顯示右側(cè)腎上腺區(qū)、腔靜脈前門脈后嗜鉻細(xì)胞瘤可能，行“腹腔鏡下異位嗜鉻細(xì)胞瘤切除術(shù)”，病理診斷為(副主動(dòng)脈旁)副節(jié)瘤。3個(gè)月前(2019年12月)再次出現(xiàn)左眼視物模糊，當(dāng)?shù)卦\斷為左眼底出血，腹部CT顯示腹膜后嗜鉻細(xì)胞瘤術(shù)后改變，左側(cè)腎上腺區(qū)多發(fā)病灶，考慮嗜鉻細(xì)胞瘤可能。自發(fā)病以來，神志清，精神可，大小便正常，體重?zé)o明顯變化。既往史、個(gè)人史、婚育史無特殊。體格檢查：除手術(shù)瘢痕外，未見異常。

1.2 家系概況及VHL基因檢測(cè)收集患者(先證者)外周血及病理組織切片?；颊咦允龇墙H結(jié)婚。父親及奶奶血壓高，服藥效果好?；颊哂?兄1弟1姐及2女，均體健，測(cè)血壓均正常。獲得患者及其家屬同意后收集5人的外周血樣本，進(jìn)行VHL基因檢測(cè)。

1.2.1基因組DNA的提取 采用康為世紀(jì)生物科技有限公司的血液基因組DNA Mini試劑盒提取外周血DNA。采用南京諾唯贊生物科技有限公司的FastPure?FFPE DNA Isolation試劑盒提取病理組織切片基因組DNA。提取過程中的配套器材及操作流程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.2VHL基因編碼區(qū)的擴(kuò)增 用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物，采用南京諾唯贊生物科技有限公司提供的2×Taq Plus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增；引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系：2×Taq Plus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，基因組DNA模板(15～25 mg/L)1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。

表1 PCR引物序列

1.2.3PCR產(chǎn)物測(cè)序 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行目的條帶純化，然后在鄭州普利萊醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)患者外周血及病理組織切片進(jìn)行VHL基因全部編碼區(qū)測(cè)序。使用Chromas及Sequencing Analysis Version 5.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列比對(duì)。

1.2.4蛋白功能預(yù)測(cè) 利用軟件Polyphen-2(www.genetics.bwh.harvard.edu/pph2)對(duì)錯(cuò)義突變蛋白進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)和病理學(xué)檢查結(jié)果患者的血尿糞常規(guī)、肝腎功、電解質(zhì)、甲狀腺功能、促甲狀腺激素(TSH)、腎上腺髓質(zhì)功能檢查均未見異常。全天血壓動(dòng)態(tài)變化呈弱杓型曲線。眼底檢查見圖1A，全腹部CT平掃+增強(qiáng)檢查結(jié)果見圖1B，腎上腺髓質(zhì)SPECT/CT融合顯像結(jié)果見圖1C，頭顱MRI平掃與增強(qiáng)結(jié)果見圖1D?；颊哂?020年3月在我院神經(jīng)外科行“右額葉腫塊切除術(shù)”。術(shù)后病理顯示(右額葉占位)腦膜瘤，WHOⅠ級(jí)。免疫組化結(jié)果：CK(-)，S-100(-)，EMA(-)，SSTR2(+)，PR(部分+)，GFAP(-)，Ki-67(2%+)，CD34(血管+)，ERG(血管+)，NSE(-)，Inhibi-a(-)，STAT6(-)，CgA(-)，Syn(-)，D2-40(血管+)。

A：眼底照相顯示左眼視盤表面可見橘紅色圓形隆起病灶，左眼眼底熒光血管造影提示視網(wǎng)膜毛細(xì)血管瘤；B：腎上腺CT顯示左側(cè)腎上腺區(qū)多發(fā)病灶；C：腎上腺髓質(zhì)SPECT/CT融合顯像，靜脈注射顯像劑131I-MIBG后，左側(cè)腎上腺可見軟組織結(jié)節(jié)影，部分放射性分布濃聚，大者約1.3 cm×1.5 cm，CT值約41 Hu；腹膜后可見軟組織結(jié)節(jié)影放射性分布濃聚，大小約1.4 cm×1.9 cm，CT值約27 Hu；D：頭顱MRI顯示右側(cè)額葉見類圓形長T1長T2信號(hào)，內(nèi)見多發(fā)小圓形長T1長T2信號(hào)，T2 Flair序列部分呈高信號(hào)，高B值DWI可見點(diǎn)片狀擴(kuò)散受限高信號(hào)，病變大小約26 mm×26 mm×21 mm(前后徑×左右徑×上下徑)圖1 患者影像學(xué)資料

2.2 VHL基因檢測(cè)結(jié)果及分析患者血液和病理組織標(biāo)本的測(cè)序結(jié)果均提示患者攜帶1個(gè)VHL基因的雜合錯(cuò)義變異(c.284C>G)，該變異導(dǎo)致第95位編碼氨基酸殘基由脯氨酸Pro變?yōu)榫彼酇rg(p.Pro 95 Arg)?；颊吒改讣耙粋€(gè)女兒均未攜帶該變異，提示該變異為新生變異。另一個(gè)女兒為該變異雜合子攜帶者，其測(cè)序結(jié)果見圖2A。

c.284C>G變異未被ClinVar數(shù)據(jù)庫收錄，但收錄在HGMD數(shù)據(jù)庫中，并在1例嗜鉻細(xì)胞瘤患者中有過報(bào)道[6]。該變異附近氨基酸殘基的改變(p.Asn 90 Ile；p.Gly 93 Cys；p.Gly 93 Arg；p.Gly 93 Asp；p.Tyr 98 His；p.Tyr 98 Cys)與VHL綜合征的致病或可能致病均已有報(bào)道[7-9]，表明該變異位于熱點(diǎn)突變區(qū)。此外，該變異頻率在ExAC、GenomAD、1000G參考數(shù)據(jù)庫中未見收錄，不屬于多態(tài)性變化。c.284C>G編碼蛋白p.Pro 95 Arg所在區(qū)域片段的物種保守性分析顯示p.Pro 95在智人、恒河獼猴、老鼠、狗、非洲大象和雞這些物種中高度保守(圖2B)，位于VHL第一外顯子(圖3A)。經(jīng)過錯(cuò)義突變蛋白功能預(yù)測(cè)軟件Polyphen-2預(yù)測(cè)，該突變對(duì)VHL蛋白造成顯著影響，預(yù)測(cè)的氨基酸突變?yōu)閜robably damaging，評(píng)分為0.994(圖3B)。在蛋白質(zhì)3D圖上，突變位點(diǎn)c.284C>G位于VHL的功能區(qū)，與缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)結(jié)合，具有非常重要的功能(圖3C)。結(jié)合在家系驗(yàn)證中其父母未攜帶該變異的情況，根據(jù)ACMG指南判定該變異為可能致病，會(huì)對(duì)基因或基因產(chǎn)物造成有害的影響。

A：紅色箭頭示變異位置，先證者(Ⅱ:1)病理樣本及血液樣本測(cè)序結(jié)果均提示攜帶變異(c.284C>G)；父(Ⅰ:1)、母(Ⅰ:2)、女兒1(Ⅲ:1)未攜帶該變異；女兒2(Ⅲ：2)攜帶該變異；B：VHL:p.Pro 95 Arg所在編碼蛋白質(zhì)區(qū)域片段的物種保守性分析顯示p.Pro 95在物種間高度保守圖2 先證者VHL基因測(cè)序圖

A：c.284C>G位于VHL第一外顯子；B：Polyphen-2預(yù)測(cè)顯示該突變對(duì)VHL蛋白造成顯著影響，預(yù)測(cè)的氨基酸突變?yōu)閜robably damaging，評(píng)分為0.994；C：在3D圖上，其蛋白產(chǎn)物位于VHL的功能區(qū)，與HIF結(jié)合，具有非常重要的功能圖3 VHL基因 c.284C>G突變的蛋白功能預(yù)測(cè)

3 討論

VHL是一種重要的腫瘤抑制因子，參與HIF的泛素化和降解，在氧調(diào)控基因表達(dá)中起著重要作用。VHL位于染色體3p25.3，包括3個(gè)外顯子，編碼蛋白是蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成部分，包括延伸蛋白B、延伸蛋白C、Cullin-2和具有泛素連接酶活性的E3。VHL突變導(dǎo)致蛋白失活，從而使下游底物上調(diào)，促進(jìn)一系列致癌基因的表達(dá)，是多器官腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制[10]。

VHL綜合征具有典型的基因型-表型相關(guān)性。根據(jù)是否合并嗜鉻細(xì)胞瘤，分為兩型：1型無嗜鉻細(xì)胞瘤，常由VHL外顯子缺失、截?cái)?、移碼或無義突變引起；結(jié)合是否合并腎癌，分為1A型(合并腎癌)和1B型(無腎癌)。2型包含嗜鉻細(xì)胞瘤，多由VHL錯(cuò)義突變引起；進(jìn)一步又可分為腎癌風(fēng)險(xiǎn)低的2A型、腎癌風(fēng)險(xiǎn)高的2B型和只有嗜鉻細(xì)胞瘤表現(xiàn)的2C型[1，11]。

本文報(bào)道的VHL綜合征患者11歲因高血壓陸續(xù)發(fā)現(xiàn)左側(cè)腎上腺和腹膜后嗜鉻細(xì)胞瘤，此次因左眼視物模糊入院，完善FFA(眼底熒光血管造影)后發(fā)現(xiàn)左眼視網(wǎng)膜毛細(xì)血管瘤，綜合考慮可能為VHL綜合征，進(jìn)一步對(duì)血液和嗜鉻細(xì)胞瘤病理組織進(jìn)行基因檢測(cè)，顯示該患者攜帶VHL雜合錯(cuò)義突變c.284C>G，導(dǎo)致第95位氨基酸由脯氨酸Pro變?yōu)榫彼酇rg(p.Pro 95 Arg)，為胚系突變。經(jīng)不同物種氨基酸序列比對(duì)，第95位脯氨酸在多個(gè)物種中具有高度保守性。VHL功能缺失等同于細(xì)胞缺氧狀態(tài)，這可能是導(dǎo)致該患者發(fā)生多種腫瘤的分子機(jī)制。

進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)右側(cè)大腦額葉占位，術(shù)后病理顯示腦膜瘤。經(jīng)過文獻(xiàn)檢索，腦膜瘤與NF2雜合缺失有關(guān)，在VHL綜合征中非常罕見[12]，近年來僅有少數(shù)VHL綜合征合并腦膜瘤的病例報(bào)道，Kanno等[13]報(bào)道的一例VHL綜合征2B型合并腦膜瘤患者在VHL第三外顯子685位胞嘧啶突變?yōu)轼B嘌呤(685C>G)導(dǎo)致158位亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸(L158V)(胚系突變)。Santarpia等[14]描述一例26歲VHL綜合征2C型患者，先后經(jīng)歷了雙側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤、腹主動(dòng)脈和膀胱副神經(jīng)節(jié)瘤切除術(shù)，后來發(fā)現(xiàn)右側(cè)額葉腦膜瘤，基因檢測(cè)顯示VHL695G>A導(dǎo)致161位精氨酸突變?yōu)楣劝滨０?R161Q)。在本研究中，該患者為VHL綜合征2C型，存在VHL第一外顯子的雜合錯(cuò)義突變(c.284C>G)，通過Polyphen-2和蛋白結(jié)構(gòu)3D圖對(duì)錯(cuò)義突變c.284C>G的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，提示該突變是功能突變，能顯著影響VHL的活性，與臨床表型關(guān)系密切，但是否導(dǎo)致其罹患右側(cè)額葉腦膜瘤尚不清楚。

隨后我們對(duì)患者的家系成員進(jìn)行突變位點(diǎn)的檢測(cè)，患者一8歲女兒攜帶VHL c.284C>G，目前并未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)腫瘤及囊腫的發(fā)生。根據(jù)國內(nèi)外指南，對(duì)于無癥狀VHL基因突變攜帶者目前尚無有效的干預(yù)腫瘤發(fā)生的手段，只能進(jìn)行密切監(jiān)測(cè)[15]。由于視網(wǎng)膜腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是在青少年時(shí)期，我們正在對(duì)該女進(jìn)行定期隨訪、預(yù)防性監(jiān)測(cè)，待成年后進(jìn)行遺傳咨詢，以期早期發(fā)現(xiàn)腫瘤，及早治療，提高其生活質(zhì)量和預(yù)期壽命。

VHL突變的多樣性，相同突變位點(diǎn)外顯率和發(fā)病年齡的顯著差異給VHL綜合征的診治帶來了巨大的挑戰(zhàn)[16]。Iida等[17]對(duì)存在VHL基因695G>A(R161Q)突變的VHL綜合征2A型先證者的16位家庭成員進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)8例攜帶相同突變位點(diǎn)的基因，其中一例表現(xiàn)為胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，無嗜鉻細(xì)胞瘤，同卵雙胞胎中的一例表現(xiàn)為巨大的嗜鉻細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，而另一例則無任何表型。目前尚不能通過基因檢測(cè)來預(yù)測(cè)患者可能出現(xiàn)的表型，比如哪個(gè)器官會(huì)受累，發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的高低，腫瘤在特定生命階段(幼兒期、妊娠期等)的特殊發(fā)生，或腫瘤生長的速度等。VHL基因的胚系突變與產(chǎn)生的臨床表型之間的相關(guān)性取決于突變的VHL下調(diào)HIF途徑活性的能力，此外，年齡、性別、基因型、妊娠、腫瘤的位置等都可能影響患者的臨床表型[18]。近年來，許多與HIF無關(guān)的VHL功能被發(fā)現(xiàn)，這進(jìn)一步提示了VHL綜合征表型調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性。

總之，我們發(fā)現(xiàn)了VHL綜合征中一個(gè)新的胚系突變VHL c.284C>G，對(duì)VHL的功能可能造成顯著影響，該突變與腦膜瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性是我們未來進(jìn)一步研究的焦點(diǎn)。同時(shí)，本課題組正在開展對(duì)無癥狀VHL突變攜帶人群進(jìn)行密切隨訪和實(shí)施潛在干預(yù)的臨床研究，以提高VHL綜合征患者的生活質(zhì)量，改善其預(yù)后。