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    凝結(jié)芽孢桿菌13002的安全性及潛在功能特性

    2021-12-14 03:19:54劉冬梅趙珊周欽育黃燕燕南樹港
    關(guān)鍵詞:膽鹽耐受性芽孢

    劉冬梅 趙珊 周欽育 黃燕燕 南樹港

    (華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510640)

    凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)屬厚壁菌門(Firmicutes),革蘭氏陽性,兼性厭氧,具有非致病性,芽孢端生,可產(chǎn)乳酸[1- 2],其最適生長(zhǎng)溫度為35~50 ℃,最適生長(zhǎng)pH值為5.5~6.5,形成的芽孢具有耐高溫、耐酸和耐膽鹽等高抗逆性特點(diǎn)[3]。據(jù)報(bào)道,凝結(jié)芽孢桿菌通常從含有牛奶和碳水化合物的產(chǎn)品中分離出來,嗜熱性較強(qiáng),可在pH 6.2、65 ℃的條件下生長(zhǎng),能分解糖類生成L-乳酸,還可產(chǎn)生一些熱穩(wěn)定性淀粉酶,但不能利用麥芽糖、棉子糖、甘露醇和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)氣[4]。與芽孢桿菌屬其他物種的中心或亞末端生孢子不同,凝結(jié)芽孢桿菌孢子是末端生。此外,由于不存在細(xì)胞色素-C氧化酶,它不能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[2]。

    凝結(jié)芽孢桿菌是益生菌中的后起之秀,關(guān)于其益生機(jī)理的研究較少,但已有研究發(fā)現(xiàn),其可分泌多種代謝產(chǎn)物來調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能,也可與其他菌群相互協(xié)同進(jìn)行機(jī)體功能的調(diào)節(jié)[5],如調(diào)節(jié)消化道菌群的平衡——凝結(jié)芽孢桿菌兼性厭氧菌,當(dāng)機(jī)體攝入并進(jìn)入腸道后,其生長(zhǎng)繁殖會(huì)不斷消耗游離氧,降低腸道內(nèi)的氧化還原電勢(shì),從而改善厭氧益生菌的生長(zhǎng)環(huán)境,同時(shí)抑制需氧有害菌的生長(zhǎng)[6]。此外,凝結(jié)芽孢桿菌可分泌產(chǎn)生凝結(jié)素(Lectin)抑制鏈球菌(Streptococcus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)等有害菌的生長(zhǎng)繁殖,提高機(jī)體的抗病毒力,減少疾病的發(fā)生[7]。研究還證實(shí),其可在一定程度上抑制病原真菌的生長(zhǎng)并減緩麥角固醇類物質(zhì)的合成[8]。已有研究[9- 11]發(fā)現(xiàn),凝結(jié)芽孢桿菌能提高動(dòng)物機(jī)體免疫力,促進(jìn)生長(zhǎng)。例如,王乙茹等[10]發(fā)現(xiàn),凝結(jié)芽孢桿菌YNAU 5517能夠在一定程度上改善熱應(yīng)激肉雞的生產(chǎn)性能;王明陽等[11]發(fā)現(xiàn),飼喂凝結(jié)芽孢桿菌可有效促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng),提高其血清非特異性免疫水平和對(duì)副溶血弧菌的抗病力。相關(guān)機(jī)理研究[12]表明,凝結(jié)芽孢桿菌可有效識(shí)別消化道內(nèi)具有免疫佐劑功能的抗原部位,并使相關(guān)淋巴組織處于緊張的免疫準(zhǔn)備狀態(tài),加速免疫器官及免疫系統(tǒng)的發(fā)育、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增加、單核-巨噬細(xì)胞的吞噬和分泌、體液和細(xì)胞免疫水平的提高。

    近年來,人們?cè)絹碓街鲝埥】档氖称废M(fèi)方式,益生菌也因其安全、益生作用明顯等優(yōu)勢(shì)而受到越來越多科研工作者的青睞。我國(guó)益生菌菌種研究起步較晚,目前我國(guó)市場(chǎng)上流通的益生菌菌種多為國(guó)外引進(jìn)[13]。凝結(jié)芽孢桿菌能產(chǎn)生多種酶類,具有促消化吸收及提高飼養(yǎng)動(dòng)物成活、生長(zhǎng)的功能[14],目前已有含凝結(jié)芽孢桿菌活菌的相關(guān)藥物面世,被用于治療因腸道菌群失調(diào)引起的急、慢性腹瀉,慢性便秘,腹脹和消化不良等[15],但有關(guān)凝結(jié)芽孢桿菌潛在功能特性的研究卻鮮見報(bào)道。有鑒于此,文中對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的安全性及潛在功能特性進(jìn)行研究,以期為進(jìn)一步的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    凝結(jié)芽孢桿菌13002(CGMCC NO.7431)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)DMDL 9010(CGMCC NO.5172),由華南理工大學(xué)食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室從中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離篩選得到,保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心;大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 12598,均購于廣東省微生物保藏中心。

    注射用環(huán)磷酰胺,國(guó)藥準(zhǔn)字H 32020857,江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生產(chǎn);左旋咪唑,國(guó)藥準(zhǔn)字H37020819,山東仁和堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn);oligo低聚果糖,量子高科(中國(guó))生物工程有限公司生產(chǎn);IgA檢測(cè)試劑盒、IgG檢測(cè)試劑盒、IgM檢測(cè)試劑盒,南京建成生物工程研究所生產(chǎn);SIgA酶聯(lián)免疫分析試劑盒、IL- 4酶聯(lián)免疫分析試劑盒、IFN-γ酶聯(lián)免疫分析試劑盒,上海撫生實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    680型多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Bio-Rad伯樂公司生產(chǎn);SCIENTZ- 18N型冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn);SIEMENS型血液分析儀,西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司生產(chǎn);AU640型全自動(dòng)生化分析儀,OLMPUS OPTICAL有限公司生產(chǎn)。

    1.3 安全性評(píng)價(jià)方法

    SPF級(jí)KM小鼠20只(體質(zhì)量為18~22 g),由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。根據(jù)GB 15193.3—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》[16]中的方法并略做改動(dòng),進(jìn)行凝結(jié)芽孢桿菌13002的安全性評(píng)價(jià)。采用限量法,將凝結(jié)芽孢桿菌凍干粉稀釋為108CFU/mL的淡黃色菌液,只設(shè)10.0 g/kg(以小鼠體質(zhì)量為基準(zhǔn)計(jì)算,下同)一個(gè)劑量組。每天一次空腹灌胃,每次灌胃量為20.0 mL/kg(以小鼠體質(zhì)量為基準(zhǔn)計(jì)算),觀察14 d。按文獻(xiàn)[16]中4.3.2.4節(jié)及其附錄G所述方法評(píng)價(jià)并判斷毒性分級(jí)。

    凝結(jié)芽孢桿菌凍干粉制備方法為:將凝結(jié)芽孢桿菌13002活菌菌液按3%的體積分?jǐn)?shù)接種于其液體培養(yǎng)基中,于45 ℃、120 r/min下活化培養(yǎng)24 h,經(jīng)2至3次活化培養(yǎng)后,將種子液于發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng),將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液于4 ℃、8 000 r/min下離心10 min,用無菌生理鹽水洗滌離心3次后,取菌泥,按1:3的菌泥:保護(hù)劑質(zhì)量比混勻(保護(hù)劑制備方法:10%的脫脂奶粉及10%的海藻糖溶于0.9%的生理鹽水,85 ℃下滅菌30 min),于-40 ℃下預(yù)凍,冷凍干燥后收集凍干粉,凝結(jié)芽孢桿菌凍干粉活菌數(shù)為6.15×1010CFU/g;將其于-20 ℃下保存,備用。

    1.4 模擬胃液中的耐受性評(píng)價(jià)方法

    根據(jù)文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行模擬胃液中的耐受性評(píng)價(jià):按10%的接種量(體積分?jǐn)?shù),下同)將菌懸液接種至模擬胃液中(pH值分別為2.0、2.5、3.0、4.0、5.0),混合均勻,于37 ℃下恒溫避光培養(yǎng)0、1、2、3、4 h后取樣,進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),同時(shí)設(shè)添加與模擬胃液等體積的蒸餾水的樣品為空白對(duì)照組。

    根據(jù)文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行模擬腸液中的耐受性評(píng)價(jià):按10%的接種量將菌懸液接種至模擬腸液中,混合均勻,于37 ℃下恒溫避光培養(yǎng)0、2、4、6、8 h后取樣,進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),同時(shí)設(shè)添加與模擬腸液等體積的蒸餾水的樣品為空白對(duì)照組。

    根據(jù)文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行膽鹽耐受性評(píng)價(jià):按10%的接種量將菌懸液分別接種至含有0.00%、0.03%、0.10%、0.20%、0.30%、0.50%牛膽鹽的水溶液中,混合均勻,于37 ℃下恒溫避光培養(yǎng)0、1、2、3 h后取樣,進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),同時(shí)設(shè)添加與牛膽鹽溶液等體積的蒸餾水的樣品為空白對(duì)照組。

    無菌條件下,按10%的接種量將菌懸液接種至pH=3.0的模擬胃液中,混合均勻,于37 ℃下恒溫避光培養(yǎng)3 h后,用1 mol/L的NaOH調(diào)pH值至8.0,再加入等體積的模擬腸液和0.3%的膽鹽溶液,于37 ℃下恒溫避光培養(yǎng)4 h后,進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),同時(shí)設(shè)添加與消化液等體積的蒸餾水的樣品為空白對(duì)照組。

    1.5 抑菌能力評(píng)價(jià)方法

    將活化后的菌液按5%的接種量接種于其液體培養(yǎng)基中,擴(kuò)大培養(yǎng)48 h后,得到發(fā)酵液。將上述發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min下離心10 min,用無菌生理鹽水洗滌離心3次后,重懸,得菌懸液。取部分菌懸液超聲破碎30 min,得破碎菌體懸浮液。將上述發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min下離心10 min,取上清,得到上清液。將上述上清液用0.22 μm水系濾膜過濾除菌,得到無菌發(fā)酵液。

    根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行抑菌能力的評(píng)價(jià):以大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 12598為指示菌種,取無菌生理鹽水將兩株指示菌稀釋至106~107CFU/mL后,吸取0.1 mL涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基表面,將牛津杯中心對(duì)稱放置于培養(yǎng)基表面,每個(gè)牛津杯內(nèi)注射100 μL上述待測(cè)樣品液,置于4 ℃下擴(kuò)散24 h后,于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h,觀察并測(cè)量抑菌圈直徑大小。

    取大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 12598培養(yǎng)液,于6 000 r/min下離心15 min得到菌體,用無菌生理鹽水洗滌3次,接種至凝結(jié)芽孢桿菌13002上清液,于37 ℃下恒溫培養(yǎng)4 h,根據(jù)文獻(xiàn)[19]方法進(jìn)行脫水處理后,用SEM電鏡掃描觀察并拍照。

    1.6 體內(nèi)潛在功能特性評(píng)價(jià)方法

    1.6.1 動(dòng)物分組及處理

    SPF級(jí)Balb/c雄性小鼠50只(體質(zhì)量為18~22 g),由南方醫(yī)科大學(xué)提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,隨機(jī)均分成5組,各組間體質(zhì)量無顯著差異,其中,免疫抑制組(CTX)、陽性對(duì)照組(LMS)、凝結(jié)芽孢桿菌組(BCS)、凝結(jié)芽孢桿菌+低聚果糖組(BCS+FOS)通過連續(xù)3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺(注射量50 mg/kg)建立免疫低下小鼠模型。按圖1方式對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃,連續(xù)灌胃2周,各樣品灌胃量為10.0 mL/kg。記錄小鼠每天的體質(zhì)量變化,以便調(diào)整灌胃量。具體分組及試驗(yàn)過程如圖1所示。

    圖1 試驗(yàn)分組及過程設(shè)計(jì)

    1.6.2 一般指標(biāo)的觀察方法

    試驗(yàn)開始后觀察小鼠的食欲、毛發(fā)、大便、活動(dòng)狀況及存活情況等,每天記錄小鼠的體質(zhì)量,稱量喂食量和剩余食量,計(jì)算日攝食量,并計(jì)算飼料利用率。相關(guān)計(jì)算公式如下:

    日均體質(zhì)量增加量(g/d)=平均增重/試驗(yàn)天數(shù),

    日均攝食量(g/d)=平均飼料消耗量/試驗(yàn)天數(shù),

    飼料利用率(%)=(日均體質(zhì)量增加量/日均攝食量)×100%。

    1.6.3 器官指數(shù)的測(cè)定方法

    末次灌胃24 h后,稱量小鼠體質(zhì)量,處死小鼠,解剖并分離取出肝臟、脾臟和腸道等樣本,用生理鹽水漂洗后,用測(cè)量尺測(cè)量小腸的自然長(zhǎng)度,濾紙吸干水分,稱重。相關(guān)計(jì)算公式如下:

    器官指數(shù)(mg/g)=器官質(zhì)量/體質(zhì)量,

    小腸指數(shù)(cm/g)=小腸長(zhǎng)度/體質(zhì)量。

    1.6.4 血常規(guī)及血清生化指標(biāo)的測(cè)定方法

    末次灌胃后,予小鼠禁食不禁水24 h,摘除小鼠眼球取全血50 μL,通過血液分析儀對(duì)小鼠全血進(jìn)行檢測(cè)。全血離心后取血清,通過全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定其各項(xiàng)指標(biāo),包括L-乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、總蛋白、白蛋白、球蛋白。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

    采用IBM SPSS Statistics 24.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素分析,所有測(cè)定結(jié)果均用“均值±方差”的形式表示,P<0.05表示組間有顯著差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 凝結(jié)芽孢桿菌13002的安全性

    益生菌的安全性與其預(yù)期用途相關(guān)。益生菌應(yīng)用時(shí)需具有菌活,而且,與其他食品或藥物成分不同,益生菌具有潛在的傳染性。為了確保益生菌在應(yīng)用時(shí)的活性并避免其傳染性,世界衛(wèi)生組織制定了《食品益生菌評(píng)價(jià)指南》[20],該指南為益生菌的臨床前檢測(cè)、臨床試驗(yàn)以及在體外和動(dòng)物模型下的菌種鑒定、安全性評(píng)價(jià)和功效測(cè)試等提供了參數(shù)。益生菌在應(yīng)用到食品或保健品之前,其安全性評(píng)價(jià)已被列為篩選潛在益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn)和首要步驟。表1所示為凝結(jié)芽孢桿菌13002對(duì)KM小鼠的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)期間,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量顯著增加(P<0.05),在用凝結(jié)芽孢桿菌13002菌液灌胃后,沒有觀察到兩組別的小鼠有中毒和死亡跡象,且兩組別的小鼠在試驗(yàn)期間活躍,皮膚和眼睛顏色沒有任何異常變化。試驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)小鼠進(jìn)行解剖,肉眼未見異常。由此可知,活菌數(shù)為108CFU/mL的凝結(jié)芽孢桿菌13002菌液對(duì)雌雄性KM小鼠急性經(jīng)口毒性LD50>20.0 mL/kg,屬于安全無毒級(jí)。

    表1 凝結(jié)芽孢桿菌13002對(duì)KM小鼠的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果1)

    2.2 凝結(jié)芽孢桿菌13002的耐受性

    研究發(fā)現(xiàn):胃的低pH值和胃蛋白酶的抗菌作用是防止細(xì)菌進(jìn)入腸道的有效屏障;進(jìn)食后胃的pH值最低至1.5,最高達(dá)6.0,但一般維持在2.5~3.5;食物的狀態(tài)影響其在胃中的運(yùn)輸時(shí)間,正常情況下,食物在胃里停留2~4 h,其中液體從胃里排出的速度比固體快,大約只需要20 min就可通過胃[21]。由圖2(a)可知:凝結(jié)芽孢桿菌13002在不同pH值體外模擬胃液中的存活率隨pH值的降低而降低;在pH為3.0~5.0的模擬條件下,作用3 h后,菌株的存活率均大于80%;當(dāng)pH值降低至2.5或2.0時(shí),隨作用時(shí)間的延長(zhǎng),菌株存活率顯著降低(P<0.05),這與Zárate等[22]的研究結(jié)果相符,即所有試驗(yàn)乳酸桿菌在pH=4.0的條件下存活良好,幾種菌株在pH=3.0時(shí)略微喪失生存力,但所有測(cè)試的菌株在pH=2.0時(shí)基本喪失生存力。吳丹陽[23]在研究中發(fā)現(xiàn),凝結(jié)芽孢桿菌T 242在pH=3.0的模擬胃液中耐受3 h后,存活率為87.49%,與文中研究結(jié)果相符。以上結(jié)果表明,文中試驗(yàn)菌株可耐受pH=3.0的模擬胃液環(huán)境,且在pH=2.0的環(huán)境中存活率大于50%。

    (a)對(duì)模擬胃液的耐受性

    (b)對(duì)模擬腸液的耐受性

    (c)對(duì)膽鹽的耐受性

    (d)對(duì)模擬胃腸液的耐受性

    益生菌可存活并發(fā)揮其功能的另一個(gè)屏障是小腸,小腸中含有膽鹽和胰蛋白酶等[24]。食物通過小腸的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間一般為1~4 h,小腸的pH值約為8.0[21]。益生菌的膽鹽耐受性可通過測(cè)定其在膽鹽存在下的生存能力以及在不同含量膽鹽的選擇性培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行判斷。研究發(fā)現(xiàn),被推薦為供人類使用的益生菌的膽鹽耐受含量為0.15%~0.30%[25]。圖2(b)所示為模擬腸液環(huán)境下凝結(jié)芽孢桿菌13002的存活率,當(dāng)作用4 h時(shí),菌株存活率仍在95%左右,說明試驗(yàn)菌株對(duì)模擬腸液具有較高的耐受性;隨著作用時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng),存活率顯著下降,這可能是因?yàn)槟M環(huán)境中缺少微生物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),加劇了菌株存活率的下降。

    進(jìn)一步探究不同膽鹽含量下凝結(jié)芽孢桿菌13002的存活率(見圖2(c)),發(fā)現(xiàn)在0.03%~0.30%的膽鹽含量范圍內(nèi),菌株存活率均保持在84%以上,且在0.5%的膽鹽含量下,菌株仍具有較高的存活率(大于80%),這與Piret等[26]的研究結(jié)果相符——97%的試驗(yàn)菌株可耐受高含量膽鹽且所有菌株菌活均不受胰蛋白酶濃度的影響。以上結(jié)果表明,文中試驗(yàn)菌株對(duì)模擬小腸環(huán)境中的胰蛋白酶和膽鹽具有較高的耐受性。

    為更好地評(píng)價(jià)凝結(jié)芽孢桿菌13002對(duì)胃腸道環(huán)境的耐受性,進(jìn)一步進(jìn)行模擬食物在胃腸道中的消化過程,結(jié)果如圖2(d)所示。經(jīng)7.0 h的模擬胃腸道消化液作用后,凝結(jié)芽孢桿菌13002的存活率仍保持在70%以上。

    綜合上述試驗(yàn)結(jié)果可知,凝結(jié)芽孢桿菌13002對(duì)模擬胃液、腸液、膽鹽均具有良好的耐受性,且在模擬胃腸道消化液中可保持較高的活菌數(shù),有益于菌株在胃腸道內(nèi)以較高的活菌數(shù)到達(dá)其作用靶點(diǎn),發(fā)揮益生功效。

    2.3 凝結(jié)芽孢桿菌13002的抑菌能力

    抑菌活性是評(píng)價(jià)益生菌的重要指標(biāo)之一。研究發(fā)現(xiàn),凝結(jié)芽孢桿菌可消耗游離氧,在促進(jìn)厭氧益生菌生長(zhǎng)的同時(shí)可以抑制需氧有害菌的生長(zhǎng)。此外,Le Marrec等[27]發(fā)現(xiàn),凝結(jié)芽孢桿菌在代謝過程中可產(chǎn)生一種抗菌肽——凝結(jié)素。因此,文中以金黃色葡萄球菌ATCC 12598(G+)和大腸桿菌ATCC 25922(G-)為指示菌,采用牛津杯法探究試驗(yàn)菌株的抑菌活性,結(jié)果如表2和圖3所示。

    表2 不同處理下待測(cè)樣品的抑菌圈直徑1)

    上清液對(duì)兩種指示菌的抑菌活性明顯最高,菌懸液和無菌發(fā)酵液的抑菌活性無顯著差異,菌體破碎液的抑菌活性最差。其原因可能是凝結(jié)芽孢桿菌13002在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生并分泌一些有機(jī)酸類、肽類等抑菌物質(zhì),而在超聲破碎、無菌處理過程中,這些抑菌物質(zhì)失活或遭到破壞,因此使得上清液的抑菌活性顯著高于無菌發(fā)酵液和菌體破碎液;上清液的抑菌活性顯著高于菌懸液,這可能是因?yàn)樵谠囼?yàn)菌株代謝過程中所產(chǎn)生的有機(jī)酸對(duì)指示菌有一定的抑制作用;菌懸液的抑菌活性顯著高于菌體破碎液,這種差異可能主要是因?yàn)樵囼?yàn)菌株為兼性厭氧菌,會(huì)與環(huán)境中的指示菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)、氧氣等,從而降低氧化還原電勢(shì),抑制指示菌的生長(zhǎng)。

    為進(jìn)一步探究試驗(yàn)菌株對(duì)指示菌的抑菌能力,采用抑菌效果最好的上清液與指示菌共培養(yǎng),觀察其對(duì)指示菌形態(tài)的影響,結(jié)果見圖4。由圖4(a)、4(c)可知,未經(jīng)處理的對(duì)照組,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞完整無破損,形態(tài)飽滿,表面光滑;由圖4(b)、4(d)可知,試驗(yàn)處理后,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞形態(tài)明顯發(fā)生改變,嚴(yán)重皺縮,表面出現(xiàn)凹陷,甚至還有一些原生質(zhì)外漏,且對(duì)大腸桿菌的形態(tài)破壞明顯嚴(yán)重于金黃色葡萄球菌,這與前述抑菌圈直徑的測(cè)量結(jié)果一致,可能是由于革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同而產(chǎn)生的差異。

    (a)大腸桿菌

    (b)金黃色葡萄球菌

    (a)對(duì)照組,大腸桿菌

    (b)試驗(yàn)組,大腸桿菌

    (c)對(duì)照組,金黃色葡萄球菌

    (d)試驗(yàn)組,金黃色葡萄球菌

    綜上,凝結(jié)芽孢桿菌13002對(duì)指示菌均有一定的抑菌活性,且對(duì)指示菌株大腸桿菌(G-)的抑菌效果要優(yōu)于金黃色葡萄球菌(G+)。

    2.4 凝結(jié)芽孢桿菌13002對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

    CTX組、LMS組、BCS組、BCS+FOS組連續(xù)3天腹腔注射50 mg/kg環(huán)磷酰胺后,各組小鼠的體質(zhì)量均顯著降低,說明試驗(yàn)建模成功。圖5所示為各組實(shí)驗(yàn)小鼠的每日體質(zhì)量變化。試驗(yàn)期間各組小鼠活動(dòng)正常,且隨試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng),各組小鼠的體質(zhì)量均呈持續(xù)性增加的趨勢(shì)。其中,試驗(yàn)期間對(duì)照組總增重2.21 g,CTX組總增重1.03 g,LMS組總增重2.21 g,BCS組總增重1.76 g,BCS+FOS組總增重1.62 g。說明環(huán)磷酰胺可影響小鼠的正常生長(zhǎng);而補(bǔ)充治療左旋咪唑后,小鼠的體質(zhì)量增加恢復(fù)正常;補(bǔ)充BCS及BCS+FOS后,小鼠的生長(zhǎng)也有所恢復(fù),且總增重與對(duì)照組無顯著差異(P<0.05)。

    圖5 各組實(shí)驗(yàn)小鼠每日體質(zhì)量的變化

    表3為各組實(shí)驗(yàn)小鼠的攝食量及飼料利用率。各組小鼠的日均體質(zhì)量增加量在0.44~0.95 g/d之間,日均攝食量在3.72~4.49 g/d之間,飼料利用率在6.04%~8.18%之間。其中,CTX組日均體質(zhì)量增加量與其他組存在顯著差異,說明環(huán)磷酰胺建模成功,使得實(shí)驗(yàn)小鼠免疫低下;而BCS、BCS+FOS組與對(duì)照組在日均體質(zhì)量增加量、日均攝食量、飼料利用率指標(biāo)上均無顯著差異,綜合2.1節(jié)內(nèi)容可進(jìn)一步說明,凝結(jié)芽孢桿菌13002對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠無毒副作用;且LMS、BCS、BCS+FOS組的日均體質(zhì)量增加量、飼料利用率均顯著高于CTX組,初步說明補(bǔ)充治療后小鼠免疫能力得到了提高。

    表3 各組實(shí)驗(yàn)小鼠的攝食量及飼料利用率

    2.5 凝結(jié)芽孢桿菌13002對(duì)小鼠器官指數(shù)的影響

    器官指數(shù)是衡量機(jī)體器官發(fā)育和功能的重要指標(biāo)。表4所示為各組實(shí)驗(yàn)小鼠的器官指數(shù)。由表4可知,各組別小鼠的肝體比、肺體比、腎體比均無顯著差異,即凝結(jié)芽孢桿菌13002及低聚果糖的施用對(duì)肝、肺、腎器官無毒害作用。CTX組的脾體比顯著低于其他組,這與安松蘭等[28]的研究結(jié)果相符,脾臟是機(jī)體最大的淋巴器官,是免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所,其含有大量的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞,經(jīng)補(bǔ)充治療后,LMS、BCS、BCS+FOS組的脾體比均顯著增大,且接近對(duì)照組,初步說明BCS、BCS+FOS同LMS一樣具有一定的免疫治療作用。

    器官指數(shù)可反映機(jī)體的消化吸收及發(fā)育情況。表5所示為各組實(shí)驗(yàn)小鼠的腸道器官指標(biāo)。由表5可知:CTX、LMS組的小腸指數(shù)顯著降低,說明小腸可能受到了損傷,影響消化吸收功能;BCS、BCS+FOS組的小腸指數(shù)顯著提高,且接近對(duì)照組,說明BCS及BCS+FOS可在一定程度上促進(jìn)小腸的發(fā)育及對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

    表4 各組實(shí)驗(yàn)小鼠的器官指數(shù)

    表5 各組實(shí)驗(yàn)小鼠的腸道器官指標(biāo)

    2.6 凝結(jié)芽孢桿菌13002對(duì)小鼠血常規(guī)的影響

    血常規(guī)檢測(cè)也稱全血細(xì)胞計(jì)數(shù)或全血細(xì)胞分析,能夠較準(zhǔn)確地反映動(dòng)物機(jī)體的健康狀況。由表6可知,各組別的淋巴細(xì)胞百分比LY、中間細(xì)胞百分比MO、中性粒細(xì)胞百分比GR、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)RBC、血紅蛋白HGB、紅細(xì)胞壓積HCT、平均RBC血紅蛋白MCH、平均血小板體積MPV、血小板分布寬度PDW均差異顯著(P<0.05),而其他血常規(guī)指標(biāo)無顯著差異。從整體來看,補(bǔ)充治療BCS、BCS+FOS后可一定程度緩解注射環(huán)磷酰胺后血常規(guī)指標(biāo)的變化,使各組別的指標(biāo)接近對(duì)照組。

    表6 各組實(shí)驗(yàn)小鼠的血常規(guī)結(jié)果

    2.7 凝結(jié)芽孢桿菌13002對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

    表7所示為各組實(shí)驗(yàn)小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、L-乳酸脫氫酶(LDH)含量。由表7可知,BCS、BCS+FOS組的ALT活性在正常范圍內(nèi)高于對(duì)照組,ALT是由肝臟釋放進(jìn)入血液的,說明機(jī)體蛋白質(zhì)沉積加速,糖代謝加速,促進(jìn)了生長(zhǎng);CTX組中該酶含量較高,研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)組織發(fā)生病變時(shí),該酶活力會(huì)增多。CTX組的LDH含量顯著高于其他組別,而其他組別間無顯著差異。LDH廣泛分布于機(jī)體各器官中,當(dāng)組織受到損傷時(shí),會(huì)釋放出大量的LDH,使血液中的LDH活性提高[29]。表7結(jié)果表明,環(huán)磷酰胺對(duì)機(jī)體組織有一定的損傷,經(jīng)過補(bǔ)充治療后,這種損傷有所恢復(fù)。

    表7 各組實(shí)驗(yàn)小鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、L-乳酸脫氫酶含量

    血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)的含量是衡量機(jī)體蛋白質(zhì)吸收和代謝狀況的有效指標(biāo),球蛋白(GLB)的含量則與機(jī)體的體液免疫密切相關(guān)。表8所示為各組實(shí)驗(yàn)小鼠血清中的蛋白含量。由表8可知:CTX組的TP含量相比對(duì)照組有所提高,但白蛋白-球蛋白比(A-G比)卻顯著降低,這可能是因?yàn)榄h(huán)磷酰胺使蛋白丟失過多且消耗增加;補(bǔ)充LMS、BCS、BCS+FOS后蛋白含量有所恢復(fù),說明LMS、BCS、BCS+FOS可在一定程度上促進(jìn)蛋白質(zhì)的消化、吸收,提高氨基酸的利用率。與對(duì)照組相比,其他組別的GLB含量顯著提高。GLB是一種存在于人體中的血清蛋白,具有免疫作用,當(dāng)外來物入侵時(shí),會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生一定量的GLB,而當(dāng)入侵物相對(duì)難以消滅時(shí),會(huì)繼續(xù)刺激機(jī)體繼續(xù)產(chǎn)生更多的GLB,直到入侵物被消滅。表8結(jié)果表明,環(huán)磷酰胺造模后機(jī)體均產(chǎn)生了免疫應(yīng)激作用。

    表8 各組實(shí)驗(yàn)小鼠血清中的蛋白含量

    血清尿素氮(BUN)水平反映了機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸代謝間的平衡狀況,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成率較高時(shí)BUN較低;血清葡萄糖(Glu)作為機(jī)體糖代謝的指標(biāo),可以反映機(jī)體內(nèi)糖代謝的情況,血清中葡萄糖含量越低,說明機(jī)體對(duì)葡萄糖利用率越高,機(jī)體內(nèi)糖代謝也就越強(qiáng)。表9所示為各組實(shí)驗(yàn)小鼠血清中的BUN、Glu含量。由表9可知,與CTX組相比,其他組別的BUN、Glu含量顯著較低,說明補(bǔ)充治療對(duì)提高蛋白質(zhì)合成率及葡萄糖利用率有積極的作用。

    表9 各組實(shí)驗(yàn)小鼠血清中的尿素氮、葡萄糖含量

    表10所示為各組實(shí)驗(yàn)小鼠血清中的血脂含量,其中血清中總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)是反映機(jī)體脂類代謝功能的重要指標(biāo),血清中總膽固醇和甘油三酯含量的異常升高可能預(yù)示機(jī)體內(nèi)脂蛋白代謝異常,容易引起心、腦血管等方面的疾?。桓呙芏戎鞍?HDL-C)能清除組織細(xì)胞中的膽固醇,確保體內(nèi)膽固醇濃度的相對(duì)穩(wěn)定。由表10可知,BCS、BCS+FOS可降低TG、CHO、LDL-C含量,提高HDL-C含量,清除小鼠體內(nèi)多余的膽固醇,維持膽固醇的穩(wěn)定。

    表10 各組實(shí)驗(yàn)小鼠血清中的血脂含量

    3 結(jié)論

    文中對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌13002進(jìn)行了安全性及潛在功能特性的探究。首先通過小鼠急性毒理試驗(yàn),確認(rèn)了凝結(jié)芽孢桿菌13002的安全性。研究發(fā)現(xiàn),活菌數(shù)為108CFU/mL的凝結(jié)芽孢桿菌13002菌液對(duì)KM小鼠急性經(jīng)口毒性LD50>20.0 mL/kg,屬于無毒級(jí)。同時(shí)測(cè)定了試驗(yàn)菌株對(duì)模擬胃腸道環(huán)境的耐受性,發(fā)現(xiàn)其對(duì)胃液、腸液、膽鹽均具有良好的耐受性,且在模擬胃腸道消化液中可保持較高的活菌數(shù)。以金黃色葡萄球菌ATCC 12598(G+)和大腸桿菌ATCC 25922(G-)為指示菌探究其抑菌活性,發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌13002對(duì)兩株指示菌均具有一定的抑菌能力,且上清液的抑菌活性最高,可明顯破壞指示菌的微觀結(jié)構(gòu)。

    進(jìn)一步對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌13002(BCS)及凝結(jié)芽孢桿菌13002+低聚果糖(BCS+FOS)進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以探究其免疫調(diào)節(jié)作用,發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺可影響小鼠的正常生長(zhǎng),而補(bǔ)充治療左旋咪唑后,小鼠的體質(zhì)量、器官指數(shù)等增加直至恢復(fù)正常;補(bǔ)充BCS及BCS+FOS后,小鼠的生長(zhǎng)也有所恢復(fù)。環(huán)磷酰胺對(duì)機(jī)體組織有一定的損傷,而經(jīng)過補(bǔ)充BCS、BCS+FOS后,這種損傷有所恢復(fù),可在一定程度上恢復(fù)血常規(guī)指標(biāo),提高蛋白質(zhì)合成率及葡萄糖利用率,清除小鼠機(jī)體內(nèi)多余的膽固醇,維持膽固醇的相對(duì)穩(wěn)定,維護(hù)機(jī)體的健康,促進(jìn)生長(zhǎng),提高免疫功能。

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