干式熒光發(fā)光法快速檢測(cè)梅毒螺旋體抗體的方法建立和初步應(yīng)用與評(píng)價(jià)

呂松琴，孫溪若，黃 山，段洪芬，施金麗，李曉非，王超男，張 玲，王義娜

（1. 昆明市第三人民醫(yī)院/云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，昆明 650041； 2. 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，上海 201108；3. 東方海洋（北京）醫(yī)學(xué)研究院，北京 100071）

近年來(lái)梅毒的發(fā)病率逐年增加，在國(guó)家法定傳染病中位居第3 位，成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum，TP) 感染引起的性傳播疾病[1-2]，早期梅毒傳染性最強(qiáng)，隨后逐漸減弱；同時(shí)早期梅毒的臨床治愈率顯著高于二、三期梅毒，因此對(duì)梅毒的早期診斷和治療就顯得格外重要[3-4]。梅毒的診斷主要依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，尤其是血清學(xué)檢查[5]。目前使用ELISA 或化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)梅毒螺旋體特異性抗體[6-7]，但這些方法檢測(cè)往往需要1～2 h，不適合臨床快速篩查。故本研究基于免疫層析和熒光發(fā)光平臺(tái)，利用高活性優(yōu)勢(shì)表位嵌合TP 抗原，擬建立一種干式熒光發(fā)光快速檢測(cè)特異性梅毒螺旋體總抗體的檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)其檢測(cè)性能進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 109 例經(jīng)臨床確診的梅毒患者、44例其他疾病對(duì)照組患者和207 例健康體檢者血清樣本由昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心于2020年7月～2021年3月期間收集，保存于-80℃?zhèn)溆谩?09例經(jīng)臨床確診的梅毒患者平均年齡43.8±17.2 歲，其中男性44 例，女性65 例；44 例其他疾病對(duì)照組患者平均年齡45.7±14.5 歲，其中男性23 例，女性21 例；207 例健康體檢者平均年齡43.8±10.9 歲，其中男性85 例，女性122 例。三組性別和年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究獲得昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 儀器與試劑 兔IgG 和羊抗兔IgG 購(gòu)自北京華信行生物技術(shù)有限公司；BSA 購(gòu)自Sigma 公司；熒光微球購(gòu)自上海邁普生物科技有限公司；玻璃纖維素墊、硝酸纖維素膜（NC 膜）等耗材購(gòu)于上海杰一生物技術(shù)有限公司；梅毒螺旋體抗體快速試劑國(guó)家參考品（批號(hào)：370035-201801）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司。ELx405 深孔板洗板機(jī)和ELx-808 吸收光酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-TeK 公司；AFS-1000 干式熒光免疫分析儀購(gòu)自廣州藍(lán)勃生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TP 抗原的表位分析：采用BIOSUN 生物信息學(xué)軟件，分別輸入TP47，TP17 和TP15 抗原氨基酸序列，然后利用B 細(xì)胞表位分析功能，根據(jù)表位峰值的高低分析篩選優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段。

1.3.2 高活性優(yōu)勢(shì)表位嵌合TP 抗原的制備：根據(jù)NCBI 公布的TP 抗原的核酸序列，將TP47，TP17和TP15 三種抗原優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段的核酸序列進(jìn)行連接獲得基因序列，序列合成由中美泰和生物技術(shù)有限公司完成。將高活性優(yōu)勢(shì)表位嵌合TP 抗原的基因序列連接入pET-28a 載體，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-TP47-17-15，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，將含有測(cè)序正確目的基因的大腸埃希菌菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集誘導(dǎo)后的菌體，超聲波破碎，收集上清液進(jìn)行Ni 柱純化，洗脫收集目的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.3.3 干式熒光發(fā)光法TP 總抗體檢測(cè)卡建立：用包被稀釋液將高活性優(yōu)勢(shì)表位嵌合TP 抗原稀釋至最佳包被濃度；將羊抗兔IgG 稀釋成最佳包被濃度；用劃膜儀將兩種包被液分別噴到硝酸纖維素膜上。將已包被的硝酸纖維素膜37℃干燥24 h。將最佳標(biāo)記濃度的高活性優(yōu)勢(shì)表位嵌合TP 抗原與微球按最佳比例進(jìn)行偶聯(lián)制得微球標(biāo)記抗原溶液。將微球標(biāo)記抗原溶液調(diào)整至最佳濃度，以最佳量噴至玻璃纖維墊上制備成TP 微球結(jié)合墊。將TP 微球結(jié)合墊室溫干燥12h。在干燥室內(nèi)將反應(yīng)膜、兔IgG 微球結(jié)合墊、TP 微球結(jié)合墊、樣品墊、濾紙等裝配成反應(yīng)板，再用切條機(jī)切成試紙條組裝成ID 卡，裝入鋁箔袋內(nèi)。檢測(cè)時(shí)，陽(yáng)性樣本中的TP 抗體先與固化在玻璃纖維上的熒光微球標(biāo)記的高活性優(yōu)勢(shì)表位嵌合TP 抗原結(jié)合形成復(fù)合物，并繼續(xù)向NC 膜層析，通過(guò)NC 膜檢測(cè)線（T 線）時(shí)，被包被在NC膜上的高活性優(yōu)勢(shì)表位嵌合TP 抗原捕獲。儀器顯示結(jié)果為S/CO 值，S 代表待測(cè)樣本T 線熒光值和C 線熒光值比值（T/C），CO 為Cut-off值，S/CO值≥1，結(jié)果為陽(yáng)性；S/CO 值＜1，結(jié)果為陰性。

1.3.4 臨界值（Cut-off值）的確定：選取120 例經(jīng)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)確認(rèn)為T(mén)P 抗體陰性的健康體檢血清樣本，采用本研究檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，分別記錄T 線熒光值和C 線熒光值，并計(jì)算比值（T /C），然后計(jì)算T /C 的平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（S），以x±2s為Cut-off值。

1.3.5 干式熒光發(fā)光法TP 總抗體檢測(cè)試劑性能評(píng)估：根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法（試行）》和中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)頒布實(shí)施的《臨床免疫學(xué)定性檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》，采用梅毒螺旋體抗體快速試劑國(guó)家參考品評(píng)估陽(yáng)性符合率、陰性符合率、最低檢測(cè)限、批內(nèi)重復(fù)性、批間重復(fù)性；采用臨床樣本評(píng)估臨床敏感度、特異度、陰性預(yù)期值、陽(yáng)性預(yù)期值、似然比。梅毒螺旋體抗體快速試劑國(guó)家參考品包含10 份陽(yáng)性參考品（P1～P10），20 份陰性參考品（N1～N20），3 份最低檢測(cè)限參考品（L1～L3）和1 份重復(fù)性參考品（CV）。

1.3.6 臨床樣本檢測(cè)

1.3.6.1 酶聯(lián)免疫法：應(yīng)用雙抗原夾心原理，檢測(cè)人血清或血漿中的梅毒螺旋體抗體。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀讀數(shù)，波長(zhǎng)450 nm。以S/CO 值≥1.0 為陽(yáng)性，S/CO 值＜1.0 為陰性。

1.3.6.2 干式熒光發(fā)光法：應(yīng)用雙抗原夾心原理，檢測(cè)人血清或血漿中的梅毒螺旋體抗體。用移液器分別吸取100μl 血清/血漿樣本，加入到檢測(cè)卡上加樣孔中。檢測(cè)卡加樣反應(yīng)15 min 后立即上機(jī)檢測(cè)分析結(jié)果并輸出報(bào)告。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，兩組間比較采用ANOVA 方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)用GraphPad Prism 5 軟件繪制ROC 曲線，并計(jì)算敏感度與特異度。等效性采用Kappa 檢驗(yàn)，Kappa 值在0～1 之間，越接近1 說(shuō)明兩種試劑檢測(cè)結(jié)果的一致性越好。

2 結(jié)果

2.1 TP 抗原的優(yōu)勢(shì)表位篩選 見(jiàn)圖1。利用BIOSUN 生物信息學(xué)軟件分析確定優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段分別為20～170aa（TP47），30～150aa（TP17）和22～80aa（TP15）。

圖1 TP 抗原的B 細(xì)胞表位分布圖

2.2 高活性優(yōu)勢(shì)表位嵌合TP抗原的制備 見(jiàn)圖2。高活性優(yōu)勢(shì)表位嵌合TP 抗原為可溶性表達(dá)，Ni 柱純化后獲得純化抗原，經(jīng)SDS-PAGE 電泳鑒定，結(jié)果顯示抗原相對(duì)分子量約為37.9kDa。

圖2 高活性優(yōu)勢(shì)表位嵌合TP 抗原SDS-PAGE 電泳鑒定

2.3 干式熒光發(fā)光法TP 總抗體檢測(cè)技術(shù)分析性能評(píng)估 通過(guò)對(duì)120 例經(jīng)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)確認(rèn)為陰性的健康人群血清樣本的檢測(cè)，確定本研究干式熒光發(fā)光法TP 抗體檢測(cè)技術(shù)的Cut-off值為0.172。以本研究技術(shù)檢測(cè)梅毒螺旋體抗體快速試劑國(guó)家參考品，結(jié)果見(jiàn)表1。10 份陽(yáng)性參考品檢測(cè)均為陽(yáng)性，符合率為10/10；20 份陰性參考品檢測(cè)19 份為陰性，符合率為19/20；三批產(chǎn)品的批內(nèi)重復(fù)性分別為12.00%，12.30%和9.10%，批間重復(fù)性為10.90%，均≤20%；3 份最低檢測(cè)限參考品L1 和L2 檢測(cè)為陽(yáng)性，L3 檢測(cè)為陰性，以上各項(xiàng)均符合國(guó)家參考品檢測(cè)要求。

表1 梅毒螺旋體抗體快速試劑國(guó)家參考品檢測(cè)結(jié)果

2.4 臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)

2.4.1 臨床樣本檢測(cè)：采用本研究所建立的干式熒光發(fā)光法TP 總抗體檢測(cè)技術(shù)對(duì)360 例臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。兩組間方差分析顯示，梅毒患者血清中抗TP 總抗體水平（S/CO：3.942±1.980）與其它疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；其它疾病對(duì)照組（S/CO：0.676±1.169）與健康對(duì)照組（S/CO：0.199±0.275）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)ROC 曲線，本研究檢測(cè)技術(shù)診斷梅毒患者的AUC 值為0.986（95% CI：0.975～0.996），S/CO=1 為臨界值，檢測(cè)敏感度為99.08%（95% CI：94.99%～99.98%）（108/109），特異度為94.02%（95% CI：90.37%～96.63%）（236/251）；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為87.80%，陰性預(yù)測(cè)值為99.58%；陽(yáng)性似然比為16.569，陰性似然比為0.009 8。

圖3 干式熒光發(fā)光法TP 總抗體檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)性能

2.4.2 干式熒光發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法比較：見(jiàn)表2。平行檢測(cè)360 例臨床樣本，以酶聯(lián)免疫法試劑檢測(cè)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，干式熒光發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法的陽(yáng)性符合率為96.77%（120/124），陰性符合率為98.73%（233/236），總體符合率為98.06%（353/360），兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Kappa指數(shù)為0.965，表明兩種方法具有高度一致性。

表2 360 例臨床樣本的平行檢測(cè)結(jié)果

3 討論

準(zhǔn)確快速地檢測(cè)梅毒對(duì)于臨床輸血安全以及傳染病防控具有重要作用。傳統(tǒng)的梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗(yàn)雖然是梅毒螺旋體抗體檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)，但由于天然抗原不易獲得造成試劑昂貴，限制了其在臨床上的應(yīng)用[6,8]。近年來(lái)，采用基因重組技術(shù)制備的TP 抗原逐漸代替天然抗原，基于重組抗原建立起來(lái)的酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法、膠體金免疫層析法等檢測(cè)技術(shù)也在臨床上得到廣泛應(yīng)用[9-11]。

梅毒螺旋體抗原中TP47，TP17 和TP15 三個(gè)脂蛋白具有較強(qiáng)的抗原性。TP47 被認(rèn)為是梅毒螺旋體豐度最高、免疫性最強(qiáng)和特異度最好的抗原，TP17和TP15 雖然含量較低，但無(wú)論在人體內(nèi)還是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都表明具有很強(qiáng)的免疫原性，單獨(dú)或聯(lián)合作為包被抗原表現(xiàn)出較好的敏感度和特異度[12-14]。在本研究中所采用高活性優(yōu)勢(shì)表位嵌合TP 抗原是經(jīng)過(guò)B細(xì)胞表位分析預(yù)測(cè)確定TP47，TP17 和TP15 的優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段，并將其串聯(lián)融合表達(dá)為涵蓋三種抗原優(yōu)勢(shì)表位的嵌合抗原，既保持了抗原的大部分活性表位，又去除了TP47 中和人纖連蛋白存在較高同源性的區(qū)段。本研究基于此抗原所建立的干式熒光發(fā)光法TP 總抗體快速檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)國(guó)家參考品，陽(yáng)性參考品、陰性參考品、最低檢出限和重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果均符合要求。在臨床性能評(píng)價(jià)中，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，ROC 曲線分析顯示本研究技術(shù)具有較高檢測(cè)性能，但特異度有待進(jìn)一步提高。

本研究的干式熒光發(fā)光法TP 總抗體快速檢測(cè)技術(shù)基于免疫層析和熒光發(fā)光平臺(tái)，采用雙抗原夾心法原理設(shè)計(jì)。將該檢測(cè)技術(shù)與臨床廣泛使用的酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑相比較，具有高等效性。但是本研究檢測(cè)技術(shù)僅需一步檢測(cè)，可在15 min 內(nèi)獲得結(jié)果，簡(jiǎn)便快捷，檢測(cè)時(shí)間顯著縮短，更加適合術(shù)前快速檢測(cè)的要求。與膠體金免疫層析技術(shù)相比，敏感度更高，熒光信號(hào)通過(guò)設(shè)備讀取，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性、客觀性，容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控，避免了人為判斷的誤差[15]。因此，本研究檢測(cè)技術(shù)是一種敏感度和特異度均高的現(xiàn)場(chǎng)快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，能夠滿足臨床檢測(cè)需要。