穿心蓮內(nèi)酯對潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血單個核細(xì)胞IL-23/IL-17軸的影響

朱 琴 束 龍 馮玉良 鄭培奮

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性、非特異性腸道炎性疾病。據(jù)報道，近年來在我國的發(fā)生率呈明顯的上升趨勢，其好發(fā)于青壯年，病程遷延、易復(fù)發(fā)，給家庭、社會帶來巨大的負(fù)擔(dān)[1]。目前UC治療的主要藥物仍存在不良反應(yīng)多、耐藥、及價格昂貴的缺點。

UC的發(fā)病機制目前尚不明確，但普遍認(rèn)為與遺傳易感宿主對腸道菌群的免疫應(yīng)答失常有關(guān)。目前研究表明，IL-23/IL-17軸在UC的發(fā)病機制中可能處于重要地位。腸道炎癥時，腸道細(xì)菌抗原可刺激腸道內(nèi)專職抗原遞呈細(xì)胞，促使其分泌IL-23等前炎性細(xì)胞因子，初始CD4+T細(xì)胞在其作用下，經(jīng)STAT3通路激活控制輔助性T細(xì)胞17分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子——視黃酸相關(guān)孤核受體(ROR-γt)，促進T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，并誘導(dǎo)編碼IL-17基因表達，使Th17細(xì)胞特征性分泌IL-17。IL-17具有強大的募集和激活嗜中性粒細(xì)胞的能力，刺激成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等多種促炎性細(xì)胞因子。在正常腸道環(huán)境中，Th17細(xì)胞的主要作用可能是保護性的，而在UC的發(fā)病機制中，高表達的IL-23激活了IL-17的致病性，造成腸道嚴(yán)重的組織損傷[2,3]。

穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮的提取物及主要有效成分，分子式為C20H30O5。筆者進行的前期動物實驗發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制IL-23/IL-17軸，降低TNBS結(jié)腸炎小鼠疾病活動指數(shù)評分，促進腸道黏膜修復(fù)[4]。然而穿心蓮內(nèi)酯對UC患者IL-23/IL-17軸的影響尚未完全闡明。本研究利用UC患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，通過體外細(xì)胞實驗，探討穿心蓮內(nèi)酯對IL-23/IL-17軸的調(diào)控作用及治療UC的作用機制，為探索UC治療的新策略提供線索和理論依據(jù)。

對象與方法

1.主要試劑：穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，AG)購自美國Sigma-Aldrich公司；人淋巴細(xì)胞分離液購自加拿大Cedarlane公司；RPMI-1640 購自美國HyClone公司；人IL-23酶聯(lián)免疫分析試劑盒、人IL-17A酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自中國Bioswap公司；anti-CD4-FITC、anti-IL-17-PE購自美國BioLegend公司；ROR-γt抗體購自英國Abcam公司；抗GAPDH購自美國Cell Signaling Technology公司；HRP標(biāo)記抗體購自碧云天生物技術(shù)有限公司；流式細(xì)胞儀(Accuri C6)購自美國Bio-Rad Laboratories公司。

2.研究對象：獲取知情同意后，30例來自浙江醫(yī)院消化內(nèi)科的UC患者進入了研究。所有UC的診斷均根據(jù)臨床特征、結(jié)腸鏡、影像學(xué)、手術(shù)及病理的結(jié)果，符合2012年中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有受試者均采集靜脈血樣本20ml。本研究方案通過浙江醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審核批準(zhǔn)[2015(10K)號]，入組患者均簽署了知情同意書。

3.外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)獲?。簩?ml新鮮血樣本轉(zhuǎn)入10ml無菌離心管中，加入2ml PBS溶液稀釋，輕輕混勻；加入4ml人淋巴細(xì)胞分離溶液。然后將稀釋的血液4ml輕輕加到離心管的淋巴細(xì)胞分離液上層；2000r/min離心20min，PBMC所在細(xì)胞層為白色。用移液器將該層細(xì)胞吸取在另一干凈無菌的10ml離心管中。1500r/min，10min離心后去掉上清，再加入PBS至5ml，進行相同操作的清洗3次；加入1ml RMPI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，即得單核細(xì)胞懸液。

4.細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理：PBMCs細(xì)胞采用含10%胎牛血清，1%雙抗(青鏈霉素混合液)的RMPI-1640培養(yǎng)液，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。顯微鏡下觀察其為懸浮細(xì)胞，臺盼藍染色活細(xì)胞率達95%以上。PBMCs細(xì)胞按照每孔100萬的密度鋪入12孔板中。將提取的每份PBMCs細(xì)胞再分成4份，分別處理。其中空白對照組：PBMC細(xì)胞加入DMSO培養(yǎng)； 低濃度穿心蓮內(nèi)酯(10μg/mlAG)組、中濃度穿心蓮內(nèi)酯(20μg/mlAG)組、高濃度穿心蓮內(nèi)酯(30μg/mlAG)組分別加入相應(yīng)濃度的穿心蓮內(nèi)酯處理48h。處理后的PBMCs細(xì)胞分別進行ELISA、流式細(xì)胞檢測及Western blot法檢測。

5.ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-23和IL-17A濃度：應(yīng)用雙抗體夾心法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-23和IL-17A濃度。用純化的人IL-23和IL-17A抗體分別包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中分別依次加入IL-23和IL-17A，再與 HRP 標(biāo)記的IL-23和IL-17A抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化呈藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化呈最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-23和IL-17A呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm波長下測定吸光度(A)值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中IL-23和IL-17A濃度。

6.流式細(xì)胞法檢測Th17(CD4+IL-17+)細(xì)胞亞群占CD4+T細(xì)胞比例：將單核細(xì)胞懸液進行細(xì)胞計數(shù)；以1000r/min離心10min，棄上清，沉淀用RMPI-1640培養(yǎng)基重懸；用RMPI-1640培養(yǎng)基調(diào)整待檢測細(xì)胞濃度為0.5×105個/毫升，接種于24孔板中，加入佛波醇乙酯(PMA)100ng/ml，離子霉素1μg/ml和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑莫能菌素1μg/ml，之后放入37℃ 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h；用anti-CD4-FITC標(biāo)記4℃ 1h；孵育結(jié)束后，預(yù)冷PBS洗滌兩次后加500μl 4%多聚甲醛PBS溶液固定，避光放置20min，300×g，離心5min，沉淀細(xì)胞用0.1%PBS-Triton溶液破膜，避光放置10min，離心棄上清。用anti-IL-17-PE進行標(biāo)記。流式細(xì)胞儀檢測各細(xì)胞亞群比例。CD4+IL-17+為Th17細(xì)胞。

7.Western blot法檢測Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt表達水平：將培養(yǎng)的PBMC細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，吸去培養(yǎng)液，適量預(yù)冷的1×PBS洗滌2次，吸去PBS，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，4℃充分裂解細(xì)胞，將細(xì)胞刮入1.5ml EP管中，95℃以上加熱10min，12000×g離心10min，取上清，進行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80℃冰箱。BCA法蛋白定量。SDS-PAGE電泳：取蛋白上樣量80μg，再加1/4總體積的蛋白上樣緩沖液，最后用RIPA補齊至總體積相等(20μl)，混勻后沸水煮5min。上樣，接通電源，80V電泳至分離膠120V電泳。半干式轉(zhuǎn)膜25V轉(zhuǎn)膜30min。封閉：5%脫脂奶粉室溫封閉1h或4℃過夜。一抗：ROR-γt 1∶1500，GAPDH1∶2000稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，室溫孵育2h或4 ℃孵育過夜。二抗：孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，每次5min。隨后根據(jù)用量，按照1∶1000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1h。用TBST洗滌3次，每次5min。ECL化學(xué)發(fā)光檢測。

結(jié) 果

通過檢測比較UC空白對照組與低、中、高濃度穿心蓮內(nèi)酯組IL-23濃度、Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt表達水平、Th17細(xì)胞亞群的比例及下游促炎性細(xì)胞因子IL-17A水平，研究穿心蓮內(nèi)酯對UC患者PBMCs IL-23/IL-17軸的調(diào)控作用。

1.穿心蓮內(nèi)酯(AG)對UC患者PBMCs分泌IL-23和IL-17A的作用：ELISA檢測空白對照組、低濃度穿心蓮內(nèi)酯(10μg/mlAG)組、中濃度穿心蓮內(nèi)酯(20μg/mlAG)組、高濃度穿心蓮內(nèi)酯(30μg/mlAG)組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-23和IL-17A濃度。與空白對照組比較，低、中、高濃度穿心蓮內(nèi)酯組的IL-23和IL-17A濃度均明顯下降(P=0.000),且呈穿心蓮內(nèi)酯劑量依賴效應(yīng)(表1、圖1)。

表1 各組UC患者細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-23和IL-17A濃度

圖1 穿心蓮內(nèi)酯(AG)對UC患者PBMCs分泌IL-23和IL-17A的作用A.空白對照組與低、中、高濃度穿心蓮內(nèi)酯組IL-23濃度比較;B.空白對照組與低、中、高濃度穿心蓮內(nèi)酯組IL-17A濃度比較。與空白對照組比較，*P=0.000；與低濃度穿心蓮內(nèi)酯組比較，#P=0.000；與中濃度穿心蓮內(nèi)酯組比較，ΔP=0.000

2.穿心蓮內(nèi)酯對UC患者Th17細(xì)胞亞群/CD4+T細(xì)胞比例的作用：空白對照組Th17(CD4+IL-17+)細(xì)胞亞群占CD4+T細(xì)胞比例為16.17%±0.45%。與空白對照組比較，低濃度穿心蓮內(nèi)酯組(10.13%±0.37%)、中濃度穿心蓮內(nèi)酯組(7.22%±0.67%)、高濃度穿心蓮內(nèi)酯組(4.51%±0.18%)的Th17(CD4+IL-17+)細(xì)胞亞群占CD4+T細(xì)胞比例均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=382.832，P均為0.000)，且不同濃度穿心蓮內(nèi)酯組間呈劑量依賴效應(yīng)(P=0.000)，詳見圖2。

圖2 穿心蓮內(nèi)酯對UC患者Th17細(xì)胞亞群/CD4+T細(xì)胞比例的作用A.流式細(xì)胞法檢測結(jié)果;B.各組PBMCs中Th17(CD4+IL-17+)細(xì)胞亞群占CD4+T細(xì)胞比例。Th17細(xì)胞(CD4+IL-17A+細(xì)胞)：右上象限，CD4+T 細(xì)胞：右上及右下象限。與空白對照組比較，*P=0.000；與低濃度穿心蓮內(nèi)酯組比較，#P=0.000；與中濃度穿心蓮內(nèi)酯組比較，ΔP=0.000

3.穿心蓮內(nèi)酯對UC患者PBMCs中Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt表達水平的作用：與空白對照組比較，低、中、高濃度穿心蓮內(nèi)酯組ROR-γt表達水平顯著降低(P=0.000)；不同濃度穿心蓮內(nèi)酯組ROR-γt表達水平呈劑量依賴效應(yīng)(P=0.000)，詳見表2、圖3。

表2 各組UC患者PBMCs中Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt表達水平

圖3 穿心蓮內(nèi)酯對UC患者PBMCs中ROR-γt水平的作用A.Western blot法檢測結(jié)果圖；B.各組ROR-γt/GADPH比例。與空白對照組比較，*P=0.000；與低濃度穿心蓮內(nèi)酯組比較，#P<0.05；與中濃度穿心蓮內(nèi)酯組比較，ΔP<0.05

討 論

潰瘍性結(jié)腸炎的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，但免疫應(yīng)答失常在UC發(fā)病中十分關(guān)鍵。目前已證實，促炎性細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子TNF-α、IL-1β和IL-6等與UC的發(fā)病密切相關(guān)[5]。IL-23/IL-17軸已報道可調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6，因此在UC的發(fā)病中可能起關(guān)鍵作用[3,6]。有研究證明，UC患者腸道黏膜中IL-23R、IL-17的mRNA表達增加，并且與UC患者疾病活動度評分呈正相關(guān)[7]。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，IL-17R敲除或IL-17R IgG處理后的小鼠與野生型小鼠比較，對2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)引起的結(jié)腸炎有更強的抵抗力。Elson等[9]研究發(fā)現(xiàn)，抗IL-23亞基p19的抗體可降低腸道中促炎性細(xì)胞因子的表達，從而導(dǎo)致Th17細(xì)胞凋亡并抑制腸道炎癥。這些研究均表明了IL-23/IL-17軸在UC發(fā)病中的重要作用。

目前臨床治療UC的藥物主要包括5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和單克隆抗體等，但存在不同程度的不良反應(yīng)(如骨髓肝臟毒性、增加感染風(fēng)險)及耐藥性等問題，且價格昂貴，給患者家庭及我國醫(yī)保系統(tǒng)帶來較大經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[10,11]。因此，研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗UC藥物，具有重要的臨床及經(jīng)濟價值。

穿心蓮屬爵床科植物，臨床常用于治療腸道腹瀉及呼吸道感染性疾病，其中藥湯劑在UC的臨床治療中也取得了良好療效。穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮的主要有效成分。目前穿心蓮內(nèi)酯治療膿毒血癥、腦膜炎、急性肺損傷等的研究結(jié)果提示其具有良好的抗氧化及抗炎作用[12～16]。本課題組一直致力于UC發(fā)病機制及治療方面的研究，前期動物實驗中，筆者所在團隊利用TNBS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，研究結(jié)果顯示，穿心蓮內(nèi)酯能下調(diào)IL-23/IL-17軸，抑制IL-17及TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性細(xì)胞因子水平(P=0.000)，并有效地改善結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸黏膜大體形態(tài)及組織病理學(xué)評分(P<0.05)[4]。表明穿心蓮內(nèi)酯可以抑制腸道炎癥，促進腸道黏膜修復(fù)。

本研究進一步利用UC患者外周血單個核細(xì)胞，分別予低濃度穿心蓮內(nèi)酯(10μg/mlAG)、中濃度穿心蓮內(nèi)酯(20μg/mlAG)、高濃度穿心蓮內(nèi)酯(30μg/mlAG)處理。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，低、中、高濃度穿心蓮內(nèi)酯均能降低UC患者IL-23水平(P=0.000)，降低Th17細(xì)胞亞群的比例(P=0.000)、Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt表達水平(P=0.000)及相關(guān)促炎性細(xì)胞因子IL-17A水平(P=0.000)，并且呈劑量依賴效應(yīng)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，穿心蓮內(nèi)酯對IL-23/IL-17軸有抑制作用，可能通過下調(diào)IL-23/IL-17軸，起到抑制UC炎性反應(yīng)的作用。研究結(jié)果為探索UC治療的新策略及穿心蓮內(nèi)酯治療UC的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。