成人重癥哮喘誘導痰差異表達基因生物信息學分析

陳曉文 李中鵬 王 芳 李章紊 吳 健

支氣管哮喘是全球范圍內(nèi)最常見的慢性呼吸道疾病之一，根據(jù)Th2 細胞因子是否參與其病理生理發(fā)展可將哮喘分為2 型和非2 型[1]。全球哮喘患者達3.58億，患病率較1990年增加了12.6%[2]。王辰院士團隊于2019年在《Lancet》雜志上發(fā)表了中國哮喘流行病學研究結果，中國哮喘病人總數(shù)約有4570萬，20歲及以上人群的哮喘患病率為4.2%，其中重度哮喘占5.99%，提示我國哮喘防控形勢嚴峻[3]。

持續(xù)24h仍不緩解的哮喘稱為哮喘持續(xù)狀態(tài)或重癥哮喘。重癥哮喘的臨床表現(xiàn)為發(fā)作性呼氣性呼吸困難，雙肺哮鳴音的呼吸系統(tǒng)急癥。重癥哮喘患者癥狀不受控制、經(jīng)常惡化，伴隨著肺功能的下降，嚴重影響患者的生存質(zhì)量，甚至危及生命[4, 5]。近年來針對其發(fā)病機制的研究，使阻斷多個分子靶點的生物制劑出現(xiàn)成為可能，如與免疫球蛋白E(IgE)、白介素(IL)-4、IL-5和IL-13等2型炎癥生物學標志物升高相關的2型哮喘。然而，2型炎癥僅能解釋約半數(shù)重癥哮喘發(fā)病機制，而關于非2 型哮喘的研究較少[6]。

誘導痰細胞學是確定哮喘炎癥表型的金標準，常用于評估氣道炎癥[7]。隨著組學研究的興起，利用誘導痰尋找重癥哮喘新生物學標志物的方法取得了突破[8]。篩選新的靶點，有可能作為重癥哮喘患者治療新靶標。本研究對正常人與重癥哮喘患者誘導痰基因芯片數(shù)據(jù)進行分析處理，旨在鑒定候選的重癥哮喘疾病進展中誘導痰顯著差異表達的關鍵基因。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)集篩選:NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)是一個公共功能基因組數(shù)據(jù)庫，創(chuàng)建于2000年，收錄全世界各國研究機構提交的高通量基因表達數(shù)據(jù)。本研究從GEO(Affymetrix GPL13158平臺，Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)下載基因表達數(shù)據(jù)集(GSE137268)，數(shù)據(jù)集中包含33例重癥哮喘誘導痰樣本(嗜酸性粒細胞哮喘13例，非嗜酸性哮喘20例)和15例正常對照誘導痰樣本。

2.獲取差異基因:使用Benjamini&Hochberg方法進行統(tǒng)計分析，并用R語言軟件作火山圖。矯正后P<0.05同時log2(差異倍數(shù))≥0.58認為上調(diào)基因表達差異有統(tǒng)計學意義；矯正后P<0.05同時log2(差異倍數(shù))≤-0.58認為下調(diào)基因表達差異有統(tǒng)計學意義[9]。

3.蛋白互作網(wǎng)絡圖構建:使用String數(shù)據(jù)庫構建蛋白互作網(wǎng)絡，String數(shù)據(jù)庫可用于了解已知的蛋白相互作用，這些數(shù)據(jù)來源于其他已經(jīng)過驗證的數(shù)據(jù)庫或實驗室原始數(shù)據(jù)，也可用于預測蛋白相互作用。使用Cytoscape進一步處理數(shù)據(jù)，并使用MCODE確定蛋白互作網(wǎng)絡中最重要的模塊。選擇的標準為：MCODE評分>5分，度截止=2分，結點得分截止=0.2分，最大深度=100分，K-Score=2分[10]。

4.差異基因富集分析:《京都基因與基因組百科全書》(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)，是一個用于從高通量實驗技術產(chǎn)生的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)集中了解高級功能和生物系統(tǒng)的數(shù)據(jù)資源庫。GO是用來注釋基因和分析基因生物學過程的主要生物信息學工具[11]。為了分析差異基因的功能，使用R軟件進行統(tǒng)計分析與可視化，R語言軟件包ClusterProfiler用于富集分析[12]。

結 果

1.差異表達基因篩選:GSE137268數(shù)據(jù)集檢測到22185個基因，其中顯著上調(diào)(矯正后P<0.05及l(fā)og2(差異倍數(shù))≥0.58)70個；顯著下調(diào)(矯正后P<0.05及l(fā)og2(差異倍數(shù))≤-0.58)31個。前10位顯著上調(diào)和下調(diào)基因詳見表1。圖1顯示了差異表達基因的分布情況。

表1 前10位顯著上調(diào)和下調(diào)基因

圖1 差異表達基因火山圖log2(差異倍數(shù)).對差異表達倍數(shù)值取log2，橫坐標的絕對值越大，表明基因表達量在兩個樣本間的倍數(shù)差異越大;-lg(P).對P值取-lg，縱坐標值越大，表明差異基因的表達越顯著。上調(diào)基因用紅色點表示；下調(diào)基因用綠色點表示；非顯著差異的基因用灰色點表示

2.蛋白互作網(wǎng)絡圖構建:差異表達基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡包含40個節(jié)點和52個邊，詳見圖2A。通過Cytoscape下的 MCODE插件，篩出一個最顯著的模塊，共5個節(jié)點，包含jumonji富含at結合結構域2(jumonjiandat-rich interaction domain containing 2，JARID2)、組蛋白2簇h2ac (recombinant histone cluster 2，HIST2H2AC)、組蛋白2簇h2aa3(recombinant histone cluster 2, h2aa3，HIST2H2AA3)、組蛋白2簇h2be(recombinant histone cluster 2, h2be，HIST2H2BE)、多同源性蛋白2(polyhomeotichomolog 2，PHC2)，詳見圖2。

圖2 差異表達基因的蛋白互作網(wǎng)絡圖及關鍵模塊A.差異表達基因蛋白互作網(wǎng)絡；B.差異表達基因關鍵模塊

3.差異基因富集分析:在滿足矯正后P<0.05 且Q<0.2條件下，重癥哮喘組和健康對照組主要差異蛋白富集于激活T細胞和調(diào)節(jié)適應性免疫應答等生物進程；肌動蛋白結合、裂解酶、碳-碳裂解酶、細胞因子受體活性以及CARD蛋白結構域等分子功能；中性粒細胞顆粒、Ficolins以及3級顆粒等細胞組成，詳見圖3。

圖3 GO富集分析A.生物進程；B.分子功能；C.細胞組成

4.KEGG富集分析:KEGG是一個整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫。具有把從已經(jīng)完整測序的基因組中得到的基因目錄與更高級別的細胞、物種和生態(tài)系統(tǒng)水平的系統(tǒng)功能關聯(lián)起來的功能。重癥哮喘組和健康對照組誘導痰差異上調(diào)蛋白IL3RA/IL1R2/CXCR4/TNFSF14/IL18R1參與了細胞因子-細胞因子受體相互作用；ALDOC/HK3/TFRC參與了HIF-1信號通路; CXCR4/TNFSF14/IL18R1同時參與了病毒與細胞因子-細胞因子受體相互作用; IL3RA/TFRC/IL1R2同時參與了造血細胞系統(tǒng)；而ALDOC/HK3同時參與了果糖與甘露糖代謝，詳見圖4。

圖4 KEGG富集分析結果根據(jù)矯正后的P繪制氣泡圖以展現(xiàn)差異蛋白顯著富集的KEGG通路?？v坐標為KEGG 通路，橫坐標數(shù)值為經(jīng)校驗后的P經(jīng)過lg負對數(shù)轉換后的值

討 論

誘導痰技術應用始于1958年,痰中豐富的細胞、蛋白質(zhì)和微生物成分可作為疾病嚴重性、急性發(fā)作、病情進展及治療療效評價的標志物。誘導痰技術作為哮喘實驗室檢查的一種手段，因其無創(chuàng)性、安全性、可靠性及可重復性，在哮喘的診斷及表型確定中受到重視[13]。近年來，基因芯片技術廣泛用于揭示疾病發(fā)生、發(fā)展中遺傳改變。對哮喘誘導痰基因芯片數(shù)據(jù)進行分析，有助于發(fā)掘治療哮喘的靶基因。

利用GEO2R對GSE137268基因芯片數(shù)據(jù)進行分析，獲得重癥哮喘與正常人氣誘導痰差異表達101個基因，其中70個上調(diào)基因，31個下調(diào)基因。通過蛋白相互作用網(wǎng)絡，篩選出5個關鍵基因，包括JARID、HIST2H2AC、HIST2H2AA3、HIST2H2BE和PHC2。JARID2位于染色體6p22.3上，是組蛋白甲基轉移酶復合物的調(diào)節(jié)因子,在哮喘發(fā)生、發(fā)展中的作用未知[14]。HIST2H2AC、HIST2H2AA3和HIST2H2BE是核小體的核心成分。核小體將DNA包裹并壓縮成染色質(zhì)，限制了DNA進入需要DNA作為模板的細胞機制。它們在轉錄調(diào)控、DNA修復、DNA復制和染色體穩(wěn)定性中起著重要作用，可調(diào)節(jié)細胞因子產(chǎn)生及在哮喘發(fā)病、嚴重程度[15]。PHC2是造血干細胞的重要調(diào)節(jié)因子，哮喘患者造血干細胞動員的具體機制目前仍不明確[16]。

富集分析提示T細胞參與的免疫應答在重癥哮喘患者疾病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。Th2亢進被認為是哮喘慢性氣道炎癥、氣道高反應性的關鍵環(huán)節(jié)[17, 18]。αβT分為CD4+αβT細胞和CD8+αβT兩種，主要在淋巴結之間巡邏、監(jiān)視，一旦受刺激被抗原遞呈細胞活化，前者可快速分化為效應或調(diào)節(jié)T細胞，后者可分化為細胞毒性T和記憶T細胞。大部分過敏性哮喘氣道炎癥表現(xiàn)是由Th2型細胞因子調(diào)控的嗜酸粒細胞所介導的，本研究納入20例非嗜酸性粒細胞哮喘，其免疫機制有待進一步深入研究。Ficolins是一種可溶分子，可與微生物表面上存在的碳水化合物相結合，且在凝集素補體激活途徑中充當識別分子，在哮喘發(fā)生、發(fā)展中機制未明。

KEGG信號通路分析結果可以看到重癥哮喘組與健康對照組誘導痰基因表達存在差異。細胞因子是可溶性的細胞外蛋白或糖蛋白，哮喘疾病的發(fā)生、發(fā)展中多種細胞因子相互作用。細胞因子充當細胞間重要的調(diào)節(jié)因子和動員因子，參與先天性和適應性免疫。在宿主防御、細胞生長、分化、死亡、血管生成以及發(fā)育和修復過程。缺氧誘導因子-1α是炎癥的主要調(diào)節(jié)者，研究觀察到在哮喘的肺泡巨噬細胞和肺實質(zhì)中上調(diào)，可能驅動特定的哮喘表型[19]。研究顯示，美國兒童哮喘患病率(1980～1995年)不明原因的翻倍、持續(xù)攀升直至2013年的穩(wěn)定，可能與食品供應中高果糖玉米糖漿的擴散有關[20]。據(jù)估計，約30%～40%的成人哮喘發(fā)作與呼吸道病毒感染有關。大多數(shù)哮喘相關病毒包括呼吸道合胞病毒、鼻病毒和副流感病毒[21]。

綜上所述，通過生信分析篩選出的重癥哮喘誘導痰差異表達基因，部分在支氣管哮喘方面已有多項研究，但有些還有待于進一步探索，如PHC2與造血細胞系統(tǒng)，以及補體系統(tǒng)重癥哮喘發(fā)生、發(fā)展中的作用。本實驗利用生物信息學分析工具可預測哮喘誘導痰差異表達關鍵基因及通路，為哮喘的診治提供潛在的治療目標。