過(guò)表達(dá)FAK對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞增殖及侵襲的影響

陳 凱，李張維，廖曉穎，康成容，龔 攀

舌鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面及頭頸部位最常見(jiàn)及發(fā)病率最高的一種實(shí)體惡性腫瘤[1-2]，其具有較強(qiáng)的局部浸潤(rùn)、侵襲及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特征。目前，現(xiàn)有的治療療效均較差[3]，患者5年生存率僅為50%～60%[4-5]。

黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)作為非受體型的酪氨酸激酶的一種類(lèi)型，在正常生理狀態(tài)下發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞之間、細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間黏附作用；與整合素蛋白構(gòu)成復(fù)合體后，又可在細(xì)胞生理活動(dòng)的調(diào)控方面發(fā)揮作用。已有研究和實(shí)驗(yàn)揭示，F(xiàn)AK表達(dá)變化與人惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。但以往文獻(xiàn)報(bào)道大多局限于臨床病理相關(guān)性的研究，尚缺乏在細(xì)胞水平對(duì)其具體功能和機(jī)制的研究。本組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，下調(diào)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中FAK的表達(dá)量，可有效影響腫瘤細(xì)胞的多項(xiàng)功能[6-7]。為更深入地揭示FAK在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了FAK基因過(guò)表達(dá)載體，培養(yǎng)高表達(dá)FAK的舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞株，探討FAK高表達(dá)對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株CAL-27由中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院李勁松教授惠贈(zèng)。DNA聚合酶試劑盒、Kpn I和BamH I限制性?xún)?nèi)切酶、DNA連接酶試劑盒、Lipofectamine 2000購(gòu)自Themro Seientific公司；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma公司；凝膠純化試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；GoScript Reverse Transcription System購(gòu)自Promega公司；GoTaq qPCR Master Mix試劑盒購(gòu)自Promega公司；Trizol試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；FAK單克隆抗體(兔抗)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的培養(yǎng) 篩選低轉(zhuǎn)移CAL-27細(xì)胞株，在10%胎牛血清的培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)挑選的舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)定為37 ℃ 5%CO2)，行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2目的基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 通過(guò)對(duì)FAK基因序列及載體pcDNA3.1(+)序列分析，將目的片段克隆到載體中。設(shè)計(jì)并合成FAK基因的上、下游引物，引物序列如下：FAK-Kpn I-F: 5′-GGGG TACCATGGCAGCTGCTTACCTTGAC-3′(下劃線為Kpn I酶切位點(diǎn))，F(xiàn)AK-BamH I-R: 5′-CGGGATC CTCAGTGTGGTCTCGTCTGCC-3′(下劃線為BamH I酶切位點(diǎn))。使用Trizol試劑盒獲取總RNA，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)提取cDNA，PCR擴(kuò)增FAK序列，經(jīng)過(guò)電泳、純化、回收，Kpn I及BamH I雙酶切后，回收目標(biāo)序列，將目標(biāo)序列連接到載體pcDNA3.1(+)中。在Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中加入重構(gòu)的載體質(zhì)粒，對(duì)菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。挑選陽(yáng)性單克隆，送測(cè)序公司(廣州賽哲生物公司)進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3分組和轉(zhuǎn)染 按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別將pcDNA3.1(+)-FAK重組載體及pcDNA3.1(+)-NC空載體轉(zhuǎn)染CAL-27細(xì)胞，選取狀態(tài)最佳的細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)增培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組為pcDNA3.1(+)-FAK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；陰性對(duì)照組為pcDNA3.1(+)-NC空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；空白對(duì)照組為野生型CAL-27細(xì)胞。

1.2.4qPCR 使用Trizol試劑，提取細(xì)胞總RNA；進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估后使用GoScript Reverse Transcription System試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；qPCR實(shí)驗(yàn)使用GoTaq qPCR Master Mix試劑盒，PCR儀為西安天隆TL988-IV系統(tǒng)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用比較CT法分析相關(guān)數(shù)據(jù)。FAK引物序列：上游5′-TTGGACGATGTATTGGAGAAGG-3′；下游5′-TTTA ATTGCAACCGCCAAAG-3′。

1.2.5Western blot法 在樣品中加入裂解液，提取細(xì)胞總蛋白。調(diào)配標(biāo)準(zhǔn)蛋白液和工作液，測(cè)量570 nm吸光度值，換算蛋白濃度。配備Master Mix和Biotinylated Ladder。Master Mix與蛋白樣品(稀釋比1 ∶4)混合、震蕩后，將各組樣本和Biotinylated Ladder放入沸水5～10 min。按照Wes Separation Module試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，去除上樣板封口，對(duì)樣品及相關(guān)試劑進(jìn)行上樣操作，在此過(guò)程中需注意避免產(chǎn)生氣泡。使用Proteinsimple Wes儀器，運(yùn)行程序，獲得結(jié)果。

1.2.6MTT實(shí)驗(yàn) 將狀態(tài)良好的各組舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞在96孔板中接種，設(shè)置4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、24、48和72 h)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)為1塊板。待實(shí)驗(yàn)細(xì)胞貼壁，更新培養(yǎng)液，加入MTT試劑后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入DMSO，酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度值(492 nm波長(zhǎng)處)。

1.2.7Transwell小室實(shí)驗(yàn) 接種實(shí)驗(yàn)細(xì)胞前，在Transwell小室上表面涂覆Matrigel溶液，加入無(wú)血清培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中平衡。對(duì)各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)，制成細(xì)胞懸液，加入小室上半室；完全培養(yǎng)基加入小室下半室。在小室中培養(yǎng)20 h，棄去下半室培養(yǎng)液，擦除上半室內(nèi)表面細(xì)胞，常溫染色(0.1%無(wú)水甲醇結(jié)晶紫)。顯微鏡下隨機(jī)抽選5個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)，并計(jì)算每個(gè)視野計(jì)數(shù)的平均值。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CAL-27細(xì)胞后各組中FAK mRNA的表達(dá)轉(zhuǎn)染CAL-27細(xì)胞后實(shí)驗(yàn)組中FAK mRNA的相對(duì)表達(dá)量(11.15±0.23)明顯高于空白對(duì)照組(1.00±0.10)和陰性對(duì)照組(0.86±0.18)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的表達(dá)值僅為實(shí)驗(yàn)組的8.97%和7.71%。實(shí)驗(yàn)組中FAK mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，與空白、陰性對(duì)照組相比，差異有顯著性(F=3 356.83，P<0.01，圖1)。

圖1 各組FAK mRNA的表達(dá)

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CAL-27細(xì)胞后各組中FAK蛋白表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CAL-27細(xì)胞后，Western blot法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組中FAK蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.136 3±0.027 9)明顯高于空白對(duì)照組(0.077 7±0.013 6)和陰性對(duì)照組(0.814 2±0.010 2)。對(duì)照組表達(dá)量?jī)H為實(shí)驗(yàn)組的57.0%和59.74%，實(shí)驗(yàn)組中FAK蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，與空白、陰性對(duì)照組相比，差異有顯著性(F=8.64，P<0.05，圖2、3)。

圖2 各組中FAK蛋白表達(dá)變化

圖3 各組中FAK蛋白表達(dá)

2.3 FAK過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在0 h和24 h時(shí)，三組細(xì)胞的增殖能力差異無(wú)顯著性(F0 h=4.37，P0 h>0.05；F24 h=0.212，P24 h>0.05)。在48 h和72 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值均明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增強(qiáng)，具有時(shí)間依賴(lài)性(F48 h=6.41，P48 h<0.05；F72 h=54.40，P72 h<0.01)。FAK基因高表達(dá)能增強(qiáng)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖能力(圖4)。

圖4 各組細(xì)胞的增殖能力變化

2.4 FAK過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿膜至下室的數(shù)目(98.00±8.80)明顯高于空白對(duì)照組(60.20±11.12)及陰性對(duì)照組(43.60±7.50)，差異有顯著性(F=45.28，P<0.01)。FAK基因過(guò)表達(dá)后，舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)(圖5)。

圖5 各組細(xì)胞侵襲能力的變化：A.空白對(duì)照組；B.陰性對(duì)照組；C.實(shí)驗(yàn)組

3 討論

FAK廣泛分布于人體各種細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外基質(zhì)中，參與多種細(xì)胞學(xué)行為，在涉及細(xì)胞相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用。FAK在受到刺激后，引發(fā)黏著斑結(jié)構(gòu)中靶蛋白的磷酸化，介導(dǎo)FAK/PI3K、FAK/Ras/MAPK及FAK/rc/p130CAS/JNK等多種信號(hào)傳導(dǎo)通路，是細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)出入的樞紐。近年，眾多實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦揭示FAK參與了腫瘤的血管生成，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡及侵襲等生物學(xué)行為關(guān)系密切[8]?，F(xiàn)有研究顯示，泌尿系統(tǒng)腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤、肺癌及子宮頸癌等多種惡性腫瘤的預(yù)后不良與FAK的過(guò)表達(dá)密切相關(guān)[9-12]。FAK在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)亦顯著增加，且高表達(dá)的FAK促進(jìn)了癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。目前，關(guān)于FAK與舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞相互作用的具體機(jī)制尚不清楚，相關(guān)報(bào)道較少，有必要在細(xì)胞水平進(jìn)行深入分析。

在基因?qū)W研究中，對(duì)目標(biāo)靶基因的沉默和過(guò)表達(dá)是最常用的技術(shù)和手段。其中，基因過(guò)表達(dá)技術(shù)在研究生物分子間的相互作用及相互關(guān)系方面更具優(yōu)勢(shì)；但由于過(guò)表達(dá)載體不易構(gòu)建等原因，目前關(guān)于人FAK過(guò)表達(dá)研究方面的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建并獲取了過(guò)表達(dá)FAK的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，篩選合格的pcDNA3.1(+)-FAK對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，建立了過(guò)表達(dá)FAK的細(xì)胞模型。利用此細(xì)胞模型，研究發(fā)現(xiàn)FAK高表達(dá)可有效提升舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖活性和侵襲能力。

腫瘤的轉(zhuǎn)移包含一個(gè)復(fù)雜的病理、生理過(guò)程：癌細(xì)胞從腫瘤原發(fā)灶剝離后，匯入循環(huán)系統(tǒng)，再穿過(guò)血管、淋巴管管壁，到達(dá)繼發(fā)位置，最后在此部位停留、長(zhǎng)大，形成腫瘤轉(zhuǎn)移灶，這其中關(guān)聯(lián)了多個(gè)階段、多條途徑及多種調(diào)控機(jī)制。在此過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞還必須具備重要的生存特性：(1)抗凋亡特性；(2)在其它組織中生存、增殖的特性。FAK作為多種信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲關(guān)系密切，其主要通過(guò)以下4條途徑介導(dǎo)細(xì)胞的增殖和侵襲：(1)FAK/PI3K-AKT途徑：一般情況下，錨著依賴(lài)性生存(anchor-dependent survival)是人體內(nèi)各種組織細(xì)胞均具有的生理特性；一旦組織細(xì)胞脫離了相互的黏附、黏著狀態(tài)，便易發(fā)生死亡，也稱(chēng)失巢凋亡。而癌細(xì)胞則恰恰具備了這種抗凋亡能力：其在脫離黏附后，能夠以一種十分特殊的狀態(tài)存活，為腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了可能性。已有研究證實(shí)，在口腔惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中，癌細(xì)胞的抗失巢凋亡能力發(fā)揮了舉足輕重的作用[14]。細(xì)胞生存相關(guān)的整合蛋白簇聚后，F(xiàn)AK發(fā)生磷酸化，刺激PI3K/AKT信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，補(bǔ)償了脫黏附腫瘤細(xì)胞缺失的生存信號(hào)，使其具有脫黏附生存的能力，侵襲和轉(zhuǎn)移能力也同時(shí)得到增強(qiáng)；另外，AKT激活后，促凋亡蛋白BAD和Caspase-9活性受到抑制，進(jìn)一步增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力[15]。(2)MAPK-ERK途徑：FAK通過(guò)此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活化，模擬細(xì)胞生存信號(hào)，激活Paxillin蛋白的磷酸化，影響細(xì)胞骨架的重組，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[16]。(3)FAK-p53途徑：p53是目前研究最成熟的一種抑癌因子，能接受多種信號(hào)刺激，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，調(diào)控細(xì)胞老化及凋亡機(jī)制的啟動(dòng)，在抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、促進(jìn)生理性及病理性的DNA損傷修復(fù)等方面發(fā)揮積極作用[17]。經(jīng)由非激酶依賴(lài)途徑，F(xiàn)AK可與p53、MDM2發(fā)生相互反應(yīng)，誘導(dǎo)并加速p53的泛素化及降解，延緩腫瘤細(xì)胞的凋亡；此外，F(xiàn)AK自身攜帶的FERM結(jié)構(gòu)域還可增強(qiáng)p53的活性，加速消除相關(guān)激酶類(lèi)物質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[18]。(4)FAK-RIP途徑：NF-κB是重要的促細(xì)胞存活的信號(hào)效應(yīng)分子，而受體相互作用蛋白(receptor interacting protein, RIP)可以調(diào)節(jié)NF-κB的活性，在細(xì)胞生存、凋亡及器官發(fā)育、免疫應(yīng)答等信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮積極的作用。FAK可以與RIP結(jié)合，并激活NF-κB；當(dāng)FAK高表達(dá)時(shí)，F(xiàn)AK與RIP的平衡關(guān)系受到破壞，誘發(fā)細(xì)胞增殖處于活躍狀態(tài)，細(xì)胞凋亡受到抑制。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)AK過(guò)表達(dá)可以通過(guò)多種復(fù)雜的信號(hào)通路有效提升舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖活性和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。FAK可以為舌鱗狀細(xì)胞癌患者的生存期及預(yù)后判斷提供參考，對(duì)FAK進(jìn)行更深入的研究不僅有利于揭示舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制，也可能為其臨床治療提供新的方向和靶點(diǎn)。