H3F3A基因突變及H3.3 G34W蛋白表達(dá)在骨巨細(xì)胞瘤中的診斷意義

楊宣濤，徐艷瓊，楊 慧，王晚璞，鄭青青，劉 濤

骨巨細(xì)胞瘤(giant cell tumor of bone, GCTB)系一種中間型骨腫瘤，組織學(xué)上由腫瘤性單核細(xì)胞和均勻分布的破骨細(xì)胞樣巨細(xì)胞構(gòu)成。但幾乎所有的骨病變均可以有破骨樣巨細(xì)胞，如非骨化性纖維瘤、軟骨母細(xì)胞瘤、動脈瘤樣骨囊腫等，這常常給準(zhǔn)確診斷GCTB帶來很大的干擾，尤其是較小組織的活組織檢查，有時極具挑戰(zhàn)性。近年來，隨著RANKL抑制劑(denosumab)的應(yīng)用，GCTB的治療取得較好的療效[1]，但同時治療后的GCTB形態(tài)學(xué)特征與治療前的差異可以較大，有時完全無破骨樣巨細(xì)胞，若在無臨床病史的情況下，診斷尤其困難。

H3.3由1號染色體上的H3F3A基因和17號染色體上的H3F3B基因共同編碼，在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。近年研究發(fā)現(xiàn)GCTB中存在H3F3A基因突變，90%以上為p.G34W突變，并且可以采用免疫組化法檢測H3.3 G34W蛋白表達(dá)鑒別診斷GCTB[2-5]，但這類研究多以國外為主，國內(nèi)僅有少量文獻(xiàn)報道，且基因突變與蛋白陽性率多低于國外研究[6-8]。本實驗采用熒光PCR-毛細(xì)管電泳測序法和免疫組化法探討H3F3A基因突變和H3.3 G34W突變蛋白在GCTB中的表達(dá)及診斷意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集云南省第一人民醫(yī)院2014年1月～2020年8月具有典型的影像學(xué)、組織學(xué)特點，且標(biāo)本未經(jīng)脫鈣處理的GCTB 34例(其中原發(fā)性30例，復(fù)發(fā)性2例，經(jīng)denosumab治療后2例)，并收集其它富含破骨樣巨細(xì)胞的腫瘤40例(其中軟骨母細(xì)胞瘤10例，富于巨細(xì)胞骨肉瘤3例，甲狀旁腺功能亢進(jìn)2例，動脈瘤樣骨囊腫10例，非骨化性纖維瘤15例)。所有病例均有完整的病歷資料，樣本來源包括穿刺活檢、病灶刮出和局部手術(shù)切除組織。

1.2 試劑H3.3 G34W一抗購于北京中杉金橋生物公司(兔單克隆抗體，即用型，克隆號RM263)，石蠟包埋組織DNA試劑提取盒購于廈門艾德生物公司。紫外分光光度計SMA4000為AMOY DIAGNOSTICS公司制造，ABI 7500 PCR儀器及ABI 3500Dx基因分析儀為Life Technologies Holdings Pte Ltd公司制造，H3F3A基因第2外顯子突變檢測試劑盒由北京旌準(zhǔn)醫(yī)療公司提供(SS-129-24)。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、4 μm厚切片，HE染色，鏡下觀察。所有病例均按WHO(2020)骨和軟組織腫瘤分類的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，由2位副主任病理醫(yī)師診斷。免疫組化染色采用EnVision兩步法。判讀標(biāo)準(zhǔn)：≥10%核中等強度著色為陽性，≥10%核弱～中等強度著色為部分陽性，<10%核弱著色為陰性。

1.3.2熒光PCR-毛細(xì)管電泳測序法 蠟塊5 μm厚連續(xù)切片10張，放入滅菌EP管中，組織經(jīng)二甲苯脫蠟后，按照石蠟包埋組織DNA試劑提取盒說明書進(jìn)行操作，提取樣本DNA，并使用紫外分光光度計測定DNA濃度和純度。PCR反應(yīng)體系為25 μL，H3F3A PCR反應(yīng)液為12.5 μL，引物混合液為10.5 μL，DNA模板為2.0 μL。擴增條件：37 ℃ UDG酶防污染反應(yīng)10 min 95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，合計40個循環(huán)，然后進(jìn)行熔解曲線分析，根據(jù)(87.5±1.5) ℃處是否出現(xiàn)熔解峰來判斷是否有目的產(chǎn)物。酶解純化：3 μL的PCR擴增產(chǎn)物和2 μL的酶解混合液混勻后于37 ℃反應(yīng)60 min，然后80 ℃孵育15 min進(jìn)行酶變性。測序反應(yīng)體系配置：酶解后的擴增產(chǎn)物2.0 μL，測序引物3.0 μL，測序試劑1.0 μL，合計6.0 μL測序反應(yīng)體系。測序反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性1 min。 96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸2 min，合計30個循環(huán)。測序產(chǎn)物采用醋酸鈉-乙醇沉淀法進(jìn)行純化后，于ABI 3500Dx基因分析儀進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果與基因組序列進(jìn)行比對，參考序列為NM_002107.4。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計結(jié)果組間率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。標(biāo)志物的診斷指標(biāo)按下列公式計算：靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)，特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征34例GCTB中，男性16例，女性18例，年齡13～71歲，平均34歲，中位年齡31歲。位于長骨30例(占88.6%)，其中股骨15例，脛骨8例，腓骨1例，橈骨5例，肱骨1例；非長骨4例(占11.4%)，其中掌骨、骶骨、胸椎及髕骨各1例。所有病例均有典型的影像學(xué)資料，表現(xiàn)為骨端偏心性、膨脹性溶骨性骨質(zhì)破壞，邊界較清，無周邊骨硬化，其中1例突破關(guān)節(jié)囊，累及皮下(圖1)。

圖1 腫瘤位于脛骨上段，體積巨大，突破關(guān)節(jié)囊，累及皮下

2.2 GCTB中H3.3 G34W的表達(dá)34例GCTB中32例H3.3 G34W陽性(占94.1%)，均呈強陽性，表現(xiàn)為腫瘤性單核細(xì)胞胞核彌漫強著色(圖2)；2例陰性(占5.9%)。其中2例復(fù)發(fā)病例亦呈陽性。2例經(jīng)denosumab治療后的組織學(xué)形態(tài)表現(xiàn)為顯著的纖維化、巨細(xì)胞數(shù)量顯著減少，伴大量的未成熟骨化(圖3)。免疫組化結(jié)果顯示，梭形單核細(xì)胞和骨樣基質(zhì)中的瘤細(xì)胞H3.3 G34W蛋白均陽性(圖4、5)。

圖2 腫瘤性單核細(xì)胞H3.3 G34W呈彌漫強陽性,EnVision兩步法 圖3 deno-sumab治療后顯示纖維化、巨細(xì)胞數(shù)量顯著減少,伴大量的未成熟骨化 圖4 deno-sumab治療后梭形單核細(xì)胞H3.3 G34W陽性,EnVision兩步法 圖5 denosum-ab治療后骨樣基質(zhì)中的瘤細(xì)胞H3.3 G34W陽性,EnVision兩步法 圖6 軟骨母細(xì)胞瘤中H3.3 G34W弱陽性,EnVi-sion兩步法

2.3 非GCTB中H3.3 G34W的表達(dá)40例富含破骨樣巨細(xì)胞的腫瘤中僅1例軟骨母細(xì)胞瘤H3.3 G34W部分陽性(2.5%)(圖6)，表現(xiàn)為腫瘤性單核細(xì)胞胞核弱陽性；其余病例均為陰性。H3.3 G34W在GCTB的陽性率高于非GCTB(P<0.05，表1)。

表1 骨巨細(xì)胞瘤和非骨巨細(xì)胞瘤中H3.3 G34W的表達(dá)

2.4 H3F3A基因測序結(jié)果34例GCTB均行熒光PCR-毛細(xì)管電泳測序檢測，其中1例因蠟塊時間較久(2014年)、DNA質(zhì)量不佳，未能檢出H3F3A突變，其余33例(97.1%)均檢測出H3F3A突變，包括2例復(fù)發(fā)病例和2例經(jīng)denosumab治療后的病例。其中31例(91.2%)為p.G34W突變(圖7)，1例(2.9%)為p.G34V突變，1例(2.9%)為p.G34L突變。40例非GCTB均未發(fā)現(xiàn)有H3F3A基因突變。

圖7 熒光PCR-毛細(xì)管電泳測序法檢測顯示

2.5 H3.3 G34W蛋白和H3F3A基因突變分析在GCBT診斷中的特異性和敏感性對比分析34例GCTB中，32例H3.3 G34W陽性，H3.3 G34W診斷敏感性為94.1%；33例有H3F3A基因突變，H3F3A基因突變檢測診斷敏感性為97.1%。40例富含破骨樣巨細(xì)胞的非GCTB中，僅1例軟骨母細(xì)胞瘤H3.3 G34W為部分陽性，特異性為98%；40例非GCTB均未檢測出H3F3A突變，特異性為100%。基因突變檢測在特異性和敏感性上均略高于免疫組化法。兩種方法均與病理診斷具有較好的一致性(P<0.01)。

3 討論

組蛋白H3包括經(jīng)典的H3.2、H3.1及組蛋白變體H3.3。雖然H3.3與H3.2、H3.1在氨基酸序列上僅有個別氨基酸殘基不同，但H3.3在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞發(fā)育分化過程中卻顯得更加重要。研究表明，H3.3的編碼基因H3F3A和H3F3B錯義點突變與中樞神經(jīng)系統(tǒng)及骨與軟組織腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[10-11]。

GCTB常伴繼發(fā)性改變，包括動脈瘤樣骨囊腫樣改變，廣泛的梗死、纖維母細(xì)胞增生、泡沫細(xì)胞浸潤，需與其它富含巨細(xì)胞的腫瘤鑒別，如非骨化性纖維瘤、軟骨母細(xì)胞瘤、動脈瘤樣骨囊腫、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、腱鞘巨細(xì)胞瘤瘤等。近年來研究發(fā)現(xiàn)GCTB中存在H3F3A基因p.G34W/L/V/R突變，>90%為p.G34W突變，并且已經(jīng)開發(fā)出特異性抗體可用于GCTB的診斷和鑒別診斷[3-5]。

本組免疫組化結(jié)果顯示，34例GCTB中，32例H3.3 G34W蛋白陽性，陽性率為94.1%，40例非GCTB中僅1例軟骨母細(xì)胞瘤呈弱陽性。34例GCTB中33例(97.1%)存在H3F3A突變，其中31例(91.2%)為p.G34W突變，1例為p.G34V突變(2.9%)，1例為p.G34L突變(2.9%)。2例非p.G34W突變者，其相應(yīng)的H3.3 G34W蛋白表達(dá)亦為陰性。本組的H3.3 G34W陽性率及H3F3A突變檢出率與國外文獻(xiàn)報道結(jié)果較一致，高于部分國內(nèi)相關(guān)研究[6-8]，可能是因為本組樣本剔除了經(jīng)脫鈣處理的組織標(biāo)本。本組1例H3.3 G34W蛋白呈陽性，但未檢測出p.G34W突變，經(jīng)仔細(xì)核對，是由于蠟塊年代較久，DNA質(zhì)量不佳所致。Gong等[12]對180例GCTB進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，171例(95%)檢出H3F3A突變，其中163例(90.56%)為p.G34W突變，并表達(dá)H3.3 G34W蛋白；作者同時發(fā)現(xiàn)2例H3.3 G34W蛋白表達(dá)，但p.G34W突變?yōu)橐吧?。Lüke等[13]亦發(fā)現(xiàn)1例H3.3 G34W蛋白表達(dá)，但p.G34W突變?yōu)橐吧?。分析兩者不一致的原因可能包含了以下幾種因素：(1)脫鈣導(dǎo)致DNA破壞；(2)蠟塊年份較久或保存不當(dāng)，導(dǎo)致DNA質(zhì)量不佳；(3)組織標(biāo)本過少，這也是術(shù)前穿刺活檢中可能遇到的問題；(4)腫瘤的繼發(fā)性改變明顯，如伴出血、梗死、含有較多泡沫狀組織細(xì)胞或纖維成分過多等，導(dǎo)致可供檢測的腫瘤細(xì)胞數(shù)量過少。但由于基因測序可以檢測出少見的突變類型，故在GCTB診斷中總的敏感性要略高于免疫組化法。

少數(shù)骨肉瘤(包括富于巨細(xì)胞的骨肉瘤)與惡性GCTB的鑒別診斷由于H3F3A的檢出而成為一個有爭議的問題。目前，國內(nèi)外對此研究結(jié)果不一。Amary等[3]報道385骨肉瘤中13例存在H3.3 G34突變，13例患者平均年齡34歲(范圍19～64歲)，11例有影像學(xué)資料，除1例外均位于關(guān)節(jié)下。故作者認(rèn)為具有H3.3突變的關(guān)節(jié)下原發(fā)惡性骨腫瘤，即使無良性GCTB的組織學(xué)成分，也可能是真正原發(fā)惡性GCTB。該觀點亦得到了Koelsche等[14]的部分認(rèn)同。Koelsch等發(fā)現(xiàn)約5.7%(6/106)骨肉瘤檢出H3F3A突變，并且這些患者平均年齡超過30歲，中位年齡65歲，僅從H3F3A突變狀態(tài)、年齡和部位特點看，作者推測這6例很可能是惡性GCTB。但這組病例的影像學(xué)、組織學(xué)和核型上均與普通型骨肉瘤無明顯差異。作者同時進(jìn)行了甲基化檢測，發(fā)現(xiàn)具有H3F3A突變的這組病例甲基化譜明顯不同于H3F3A野生型骨肉瘤，而與GCTB更為密切。最終，作者提出具有H3F3A突變的骨肉瘤可能是骨肉瘤中的一種特殊亞型。Yoshida等[15]發(fā)現(xiàn)5例缺乏H3F3A突變的惡性GCTB，F(xiàn)ISH分析表明可能與H3F3A基因的缺失有關(guān)。作者主張將缺乏H3F3A突變的惡性GCTB作為一種特殊亞型。國內(nèi)學(xué)者王璇等[6]發(fā)現(xiàn)3例富于巨細(xì)胞的骨肉瘤存在H3.3 G34W蛋白表達(dá)，而白岳青等[8]報道的3例富于巨細(xì)胞的骨肉瘤在蛋白水平及Gong等[12]報道的18例骨肉瘤在基因水平均未檢出H3.3 G34突變。本組3例巨細(xì)胞骨肉瘤在蛋白及基因水平檢測結(jié)果均為陰性，復(fù)習(xí)其放射學(xué)及組織學(xué)仍歸屬于骨肉瘤。因此，目前骨肉瘤中的H3.3 G34偶然突變成為了一個潛在的診斷難題，究竟是原發(fā)性惡性GCTB，還是屬于骨肉瘤的一個特殊亞型，尚無統(tǒng)一認(rèn)識。鑒于骨肉瘤中H3.3 G34突變率低，作者建議國內(nèi)學(xué)者可以采取多中心合作研究模式來共同探討骨肉瘤尤其是富于巨細(xì)胞的骨肉瘤與惡性GCTB間的關(guān)系。

Denosumab是RANKLE抑制劑，通過RANKL/RANKLE通路抑制腫瘤的溶骨性破壞。越來越多的文獻(xiàn)報道，經(jīng)過denosumab治療后，可能會增加刮除術(shù)后患者的局部復(fù)發(fā)風(fēng)險，這可能是由于denosumab治療后引起腫瘤邊緣硬化，導(dǎo)致硬化帶里的腫瘤細(xì)胞不能被完全刮出所致[1]。本組2例經(jīng)denosumab治療的病例，組織學(xué)顯示大量未成熟骨化組織呈長條索狀、分枝狀排列或相互吻合，似低度惡性中央型骨肉瘤；破骨樣巨細(xì)胞顯著減少甚至消失；梭形細(xì)胞增生伴顯著纖維化，似非骨化性纖維瘤。2例H3.3 G34W蛋白均呈陽性，表現(xiàn)為腫瘤性單核細(xì)胞核彌漫強陽性。同時觀察到位于骨樣基質(zhì)中的瘤細(xì)胞也呈核陽性，提示經(jīng)denosumab治療后的腫瘤基質(zhì)細(xì)胞仍然存活并且具有成骨功能。這也從組織學(xué)角度證實了denosumab治療后的潛在復(fù)發(fā)風(fēng)險。

關(guān)于H3.3 G34W/L/R/V突變的作用機制尚無共識。在一項新近的研究中，Khazaei等[16]分析了細(xì)胞模型的表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組，并在單細(xì)胞分辨率下生成了GCTB原發(fā)性腫瘤和原位異種移植物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)H3.3 G34W通過異常的表觀遺傳重塑，改變了間充質(zhì)祖細(xì)胞的分化軌跡，使SPP1+(骨橋蛋白)的成骨樣祖細(xì)胞群向ACTA2+(平滑肌肌動蛋白)的肌纖維母細(xì)胞群轉(zhuǎn)化，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)配體，募集并激活破骨細(xì)胞，導(dǎo)致GCTB的發(fā)生。并提示這些表觀遺傳變化可能對GCTB的靶向治療起到重要作用。

關(guān)于H3F3A罕見突變類型是否與腫瘤生物學(xué)相關(guān)，由于病例少，目前尚無具有統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)報道。Schaefer等[4]對一組病例研究發(fā)現(xiàn)，其中第34例患者3年前空心針穿刺活檢，組織學(xué)呈經(jīng)典的GCTB形態(tài)，H3.3 G34W蛋白呈陰性；3年后手術(shù)標(biāo)本，組織學(xué)呈梭形細(xì)胞肉瘤形態(tài)，核異型明顯，核分裂易見，免疫組化檢測H3.3 G34W蛋白仍為陰性，基因檢測發(fā)現(xiàn)存在p.G34L突變，診斷為GCTB伴惡性轉(zhuǎn)化。本組發(fā)現(xiàn)1例p.G34L突變，系25歲女性患者，第1次在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院經(jīng)空心針穿刺診斷GCTB后，由于經(jīng)濟(jì)原因，放棄治療。4年后就診于我院，腫瘤位于左脛骨近端，體積巨大，大小25 cm×25 cm×20 cm，突破骨質(zhì)，累及肌肉及皮下脂肪組織，臨床考慮惡性。組織學(xué)上顯示破骨樣巨細(xì)胞數(shù)量減少，但并無明顯的惡變征象，免疫組化檢測H3.3 G34W蛋白為陰性，基因檢測為p.G34L突變。經(jīng)腫瘤切除并關(guān)節(jié)置換術(shù)治療，隨訪近4年，至今未復(fù)發(fā)。本例與Schaefer等[4]報道的第34例患者具有一定的相似性：第1次經(jīng)空心針穿刺獲得診斷，3～4年后手術(shù)治療，免疫組化檢測H3.3 G34W蛋白為陰性，基因檢測為p.G34L突變，臨床表現(xiàn)為惡性征象。p.G34L突變是否與更具侵襲性的生物學(xué)行為相關(guān)，尚需大樣本的研究。

本組免疫組化檢測H3.3 G34W的敏感性為94.1%，特異性為98%，H3F3A基因突變檢測敏感性為97.1%，特異性為100%。32例H3.3 G34W蛋白陽性者，其中31例(91.2%)檢出p.G34W突變，顯示H3.3 G34W蛋白表達(dá)與H3F3A測序間具有很好的相關(guān)性。因此，基于經(jīng)濟(jì)成本和時間成本考慮，建議日常診斷工作中，首選H3.3 G34W免疫組化檢測，但對于一些特殊病例，如具有不典型的臨床放射學(xué)表現(xiàn)和(或)組織形態(tài)學(xué)特征不典型病例，可以加做基因檢測，避免因罕見基因突變類型所致H3.3 G34W蛋白陰性而造成的漏診。另一方面，鑒于H3F3A的高突變率，并且H3.3 G34W突變具有驅(qū)動GCTB發(fā)生的作用，這也為潛在的基因靶向治療提供了依據(jù)。