彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中SAMD9L的表達(dá)及意義

繆小兵，何 松，陳卓琳，張邢松，徐小紅，周 穎

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常見的亞型，也是一組異質(zhì)性疾病，在組織病理學(xué)、分子學(xué)特征及臨床表現(xiàn)方面差異較大[1-3]。SAMD9L位于人類基因組染色體7q21，與其旁系同源SAMD9相鄰?，F(xiàn)已證實(shí)，SAMD9L在調(diào)控細(xì)胞增殖、腫瘤表型、炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用[4]。但SAMD9L在淋巴瘤中的表達(dá)和作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化EnVision法檢測SAMD9L在DLBCL中的表達(dá)及意義，為進(jìn)一步探索DLBCL的預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2013～2018年江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院確診的135例初治非特指型DLBCL患者。135例患者中男性60例，女性75例。年齡11～93歲，中位年齡66歲。結(jié)外累及≥2處37例，0～1處98例。Ann Arbor分期：Ⅰ+Ⅱ期49例，Ⅲ+Ⅳ期86例。按Hans分型，生發(fā)中心B細(xì)胞樣(germinal center B-cell-like, GCB)29例，非生發(fā)中心B細(xì)胞樣(non germinal center B-cell-like, non-GCB)106例。有B癥狀17例，無B癥狀118例。美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)體能狀態(tài)(performances status, PS)評分﹤2分18例，≥2分117例。國際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index, IPI)評分≤2分38例，>2分97例。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)正常30例，升高105例。白蛋白(albumin, ALB)正常105例，降低30例。無骨髓浸潤88例，有骨髓浸潤9例，另有38例無法評估。完全緩解(complete response, CR)或部分緩解(partial response, PR)75例，疾病穩(wěn)定(stable disease, SD)或進(jìn)展(progressive disease, PD)35例，另有25例無法評估。

1.2 免疫組化石蠟切片常規(guī)脫蠟后，使用EDTA進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后PBS洗滌，一抗4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，滴加二抗室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。所用一抗為兔抗人SAMD9L多克隆抗體，購自Proteintech公司，稀釋比1 ∶100。二抗為Dako REAL EnVision，購自Dako公司。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定SAMD9L定位于細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核，根據(jù)陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度和所占百分比進(jìn)行評分。按著色強(qiáng)度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細(xì)胞所占百分比評分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：總分1～4分定義為SAMD9L低表達(dá)，5～12分定義為SAMD9L高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SAMD9L表達(dá)與DLBCL臨床病理特征之間的關(guān)系采用Pearson χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，單因素和多因素預(yù)后分析采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL中SAMD9L表達(dá)與臨床病理特征及治療反應(yīng)的相關(guān)性SAMD9L主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分病例可觀察到細(xì)胞核著色。135例DLBCL患者中SAMD9L低表達(dá)99例，高表達(dá)36例(圖1、2)。SAMD9L表達(dá)與患者年齡(P=0.049)、B癥狀(P=0.003)、IPI評分(P=0.026)相關(guān)，其在年齡>60歲、有B癥狀以及高IPI評分患者中表達(dá)較高。SAMD9L低表達(dá)組和高表達(dá)組患者在性別、結(jié)外累及、Hans分型、Ann Arbor分期、ECOG PS評分、Ki-67增殖指數(shù)、骨髓浸潤、LDH水平、ALB水平以及治療反應(yīng)方面差異均無顯著性(P均>0.05，表1)。

表1 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中SAMD9L表達(dá)與臨床病理特征及治療反應(yīng)的相關(guān)性

圖1 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中SAMD9L高表達(dá)，EnVision法 圖2 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中SAMD9L低表達(dá)，EnVision法

2.2 SAMD9L表達(dá)與DLBCL患者預(yù)后的關(guān)系至末次隨訪，SAMD9L低表達(dá)組和高表達(dá)組分別有38例和28例患者死亡。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，SAMD9L高表達(dá)組較低表達(dá)組的總生存期(overall survival, OS)縮短(P<0.001，圖3)。單因素回歸分析顯示：年齡(P=0.001)、Ann Arbor分期(P=0.007)、B癥狀(P<0.001)、ECOG PS評分(P=0.008)、IPI評分(P<0.001)、LDH水平(P=0.001)、ALB水平(P<0.001)、治療反應(yīng)(P<0.001)以及SAMD9L表達(dá)(P<0.001)是患者預(yù)后的影響因素。將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入多因素回歸分析，年齡、Ann Arbor分期、ECOG PS評分、LDH水平已包含于IPI評分，不再納入多因素分析。多因素分析顯示：IPI評分(P=0.010)、治療反應(yīng)(P<0.001)是獨(dú)立的預(yù)后因素。SAMD9L表達(dá)水平是影響OS的相關(guān)因素，但非預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P=0.710，表2)。

表2 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后的單因素及多因素分析

圖3 Kaplan-Meier生存分析SAMD9L表達(dá)與

3 討論

DLBCL是發(fā)病率增長較快的惡性腫瘤之一，因其具有高度異質(zhì)性，給患者的診斷、分型和治療帶來較大困難。目前標(biāo)準(zhǔn)的一線治療可使約2/3的患者獲得長期緩解，但仍有1/3的患者原發(fā)耐藥或緩解后復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)難治性DLBCL患者的中位生存時(shí)間約6.3個(gè)月[5-7]。因此，深入探索DLBCL的耐藥機(jī)制，發(fā)現(xiàn)有效的預(yù)測指標(biāo)，尋找新的治療靶點(diǎn)，對于改善復(fù)發(fā)難治性DLBCL患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。

SAMD9L基因位于人類染色體7q21，并以頭到尾的方向與其緊密的旁系同源SAMD9相鄰。SAMD9L在人體各類組織中廣泛表達(dá)。SAMD9L與SAMD9具有約60%的氨基酸同一性，具有保守的功能結(jié)構(gòu)域，包括DNA/RNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、凋亡小體形成以及NTP水解活性。SAMD9和SAMD9L是兒童骨髓增生異常綜合征和一些多系統(tǒng)疾病(如MIRAGE綜合征、共濟(jì)失調(diào)癥)的易感基因[8]。SAMD9L在細(xì)胞增殖、腫瘤表型以及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4]。Wang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，SAMD9L在乙肝病毒相關(guān)肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)低于癌旁肝組織，敲低SAMD9L可通過促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；且敲低SAMD9L可通過活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展。Li等[9]報(bào)道，SAMD9和SAMD9L在腫瘤中的表達(dá)水平較低。SAMD9在侵襲性纖維瘤病、乳腺癌和結(jié)腸癌中的表達(dá)水平低于正常對照組織。SAMD9L在乳腺癌中的表達(dá)低于良性乳腺上皮。但SAMD9L在侵襲性纖維瘤病或結(jié)腸癌中的表達(dá)與正常對照組相比差異無顯著性。在血液系統(tǒng)腫瘤中，因7號(hào)染色體單體導(dǎo)致的SAMD9L缺失與髓系腫瘤的發(fā)生相關(guān)[10-11]。通過構(gòu)建SAMD9L缺陷型小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其造血干細(xì)胞集落形成能力及重構(gòu)能力增強(qiáng)，對細(xì)胞因子更敏感。這種調(diào)節(jié)生長的作用可能是通過SAMD9L編碼的蛋白在核內(nèi)體促進(jìn)溶酶體形成，細(xì)胞因子受體降解而加速實(shí)現(xiàn)的[12]。SAMD9L在淋巴瘤中的表達(dá)和作用目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SAMD9L表達(dá)與DLBCL患者年齡(P=0.049)、B癥狀(P=0.003)、IPI評分(P=0.026)相關(guān)，其在年齡>60歲、有B癥狀以及高IPI評分患者中表達(dá)較高。但SAMD9L低表達(dá)組和高表達(dá)組患者在性別、結(jié)外累及、Hans分型、Ann Arbor分期、ECOG PS評分、Ki-67增殖指數(shù)、骨髓浸潤、LDH水平、ALB水平以及治療反應(yīng)方面差異均無顯著性(P均>0.05)。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，SAMD9L高表達(dá)組較低表達(dá)組的OS顯著縮短(P<0.001)。單因素和多因素回歸分析顯示，SAMD9L表達(dá)水平是影響OS的相關(guān)因素，但非預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P=0.710)。與SAMD9L在其它腫瘤中發(fā)揮“抑癌”作用不同，SAMD9L高表達(dá)DLBCL患者的預(yù)后較差，可能與其所處環(huán)境類型不同有關(guān)，不同的腫瘤微環(huán)境可能導(dǎo)致SAMD9L發(fā)揮不同的功能，但其具體機(jī)制仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)深入探究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SAMD9L在患者年齡>60歲、有B癥狀以及高IPI評分DLBCL患者中表達(dá)較高。SAMD9L高表達(dá)DLBCL患者較低表達(dá)患者的OS顯著縮短，SAMD9L表達(dá)水平是影響OS的相關(guān)因素，但非預(yù)后的獨(dú)立影響因素。