胃癌中CX43表達及與mTOR/p70S6K信號通路的關系

劉莎莎，趙 楊，趙 醒，劉 歡，申興斌

胃癌是全球范圍內發(fā)病率及病死率均較高的惡性腫瘤，嚴重影響著人類的健康[1]。我國胃癌臨床診治特點是中晚期多見，以手術治療為主，術后化療+靶向治療為輔，患者存活期短[2]。目前臨床上用于治療胃癌的靶向藥物較少，迫切需要尋找新的治療靶點。有研究發(fā)現(xiàn)，連接蛋白43(connexin 43, CX43)介導的細胞間隙連接(gap junction intercellular communciation, GJIC)在腫瘤中的表達水平和膜定位可影響癌細胞的增殖、侵襲及轉移[3]。在惡性腫瘤中，PI3K/AKT/mTOR通路的異?；罨梢种颇[瘤細胞的凋亡并促進腫瘤細胞增殖及新生血管的形成[4]。其中下游mTOR/p70S6K信號通路被異常激活后，可使磷酸化的p70S6K轉錄和翻譯活性增強，促進細胞G1期→S期的轉換，導致腫瘤細胞的無限生長及增殖。CX43是否直接或間接地通過與mTOR/p70S6K的相互作用參與調節(jié)胃癌的發(fā)生、侵襲、轉移過程，目前尚未見報道。本文采用免疫組化法、Western blot法及qRT-PCR技術檢測CX43、mTOR和p70S6K蛋白及mRNA在胃癌及正常胃黏膜組織中的表達，并分析其相關性，為研究胃癌的發(fā)病機制及靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院存檔的60例胃癌手術切除標本(患者術前均未行放療及化療)及相應癌旁正常胃黏膜組織(距癌灶5 cm以上)，一部分新鮮組織置于-80 ℃冰箱保存用于Western blot及qRT-PCR實驗，另一部分組織制成蠟塊用于免疫組化染色。

1.2 免疫組化

1.2.1主要試劑 一抗兔抗人CX43多克隆抗體及mTOR單克隆抗體均購自杭州華安生物公司，兔抗人p70S6K多克隆抗體購自武漢ABclonal公司，免疫組化試劑及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.2.2染色步驟 所有標本固定后，常規(guī)脫水、石蠟包埋，5 μm厚切片，脫蠟及水化，抗原修復、封閉、滴加一抗等，具體步驟嚴格按SP試劑盒及DAB顯色說明書進行，采用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3結果判定 CX43、mTOR及p70S6K抗體陽性著色分布于細胞質，呈棕黃色顆粒，隨機選擇5個高倍視野，采用Vlom雙評分法進行評分：(1)按陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。(2)按染色強度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。將兩項得分結果相加作為最終結果：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中等陽性()，5～6分為強陽性()。

1.3 Western blot法

1.3.1主要試劑 一抗同免疫組化抗體試劑，兔單抗β-actin購自武漢ABclonal公司，RIPA裂解液購自索萊寶公司，BCA法蛋白定量試劑盒購自杭州聯(lián)科公司；Sample Buffer(5×)購自貝博公司；新快速SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自莊盟公司等。

1.3.2檢測步驟 取0.1 g新鮮胃癌及正常胃黏膜組織，嚴格按裂解液試劑盒說明提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，根據目的蛋白分子量大小分別制6%分離膠+5%濃縮膠和10%分離膠+5%濃縮膠，80 V條件電泳，待樣品越過兩種膠體分界面，改為120 V電泳，直至所需條帶跑出。200 mA低溫轉膜，時間視分子大小而定。一抗[β-actin(1 ∶100 000)、CX43(1 ∶6 000)、mTOR(1 ∶200)、p70S6K(1 ∶10 000)]搖勻2 h后4 ℃過夜。次日，5%脫脂奶粉搖勻封閉2 h，滴加稀釋后的二抗(1 ∶10 000)搖勻，約1 h，TBST清洗10 min×3次。ECL發(fā)光液按1 ∶1配置后，滴在濾紙輕度干燥后的PVDF膜上，于暗室內進行顯影，實驗結果以膠片上條帶的方式呈現(xiàn)。

1.3.3結果分析 所得圖像運用Image J分析得到灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參灰度值。

1.4 qRT-PCR

1.4.1主要試劑 RNA提取試劑盒購自Foregene公司，逆轉錄試劑盒及擴增試劑盒均購自武漢ABclonal公司等。各指標引物序列均經GeneCopoeia公司設計。

1.4.2檢測步驟 所用EP管、移液器及槍頭、八連管等均經無酶處理。嚴格按照RNA提取試劑盒步驟提取胃癌組織及正常胃黏膜組織中的總RNA，用分光光度計測定RNA濃度(以OD260/280比值在1.8～2.1為合格)。反轉錄為20 μL體系(總RNA 1 pg～1 μg，5×ABScript Ⅱ RT Mix 4 μL，Nuclease-free H2O補足至20 μL)，在PCR儀上按25 ℃ 5 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，12 ℃ Hold進行反轉錄。擴增為20 μL體系(2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，引物2 μL，Nuclease-free H2O 6 μL)，在CFX96 qRT-PCR儀按照95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30～34 s，40～45個循環(huán)進行操作。

1.4.3結果 所得擴增曲線、溶解曲線及CT值，計算2-△△Ct，其中ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組，數(shù)據匯總，對2-△△Ct進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 胃癌及正常胃黏膜組織中CX43、mTOR及p70S6K蛋白表達

2.1.1免疫組化結果 CX43、mTOR及p70S6K陽性均定位于細胞質，胃癌組織中CX43蛋白表達明顯低于正常胃黏膜組織(P<0.05，表1，圖1)。胃癌組織中mTOR及p70S6K蛋白表達則明顯高于正常胃黏膜組織(P<0.05，表1，圖2、3)。

表1 胃癌及正常胃黏膜組織中CX43、mTOR及p70S6K蛋白表達

2.1.2Western blot結果 胃癌組織中，CX43蛋白表達量低于正常胃黏膜組織，mTOR及p70S6K蛋白表達量則高于正常胃黏膜組織(P均<0.01，圖4)。

圖4 胃癌及正常胃黏膜組織中CX43、mTOR和p70S6K蛋白表達：

2.1.3qRT-PCR結果 胃癌組織中CX43 mRNA表達量低于正常胃黏膜組織，mTOR及p70S6K mRNA表達量則高于正常胃黏膜組織(P均<0.01，圖5)。

圖5 胃癌及正常胃黏膜組織中CX43、mTOR及p70S6K mRNA的表達

2.2 胃癌組織中CX43、mTOR及p70S6K表達與臨床病理特征的關系胃癌組織中CX43蛋白及mRNA隨著胃癌分化程度的降低、臨床分期越晚、浸潤程度越深、伴淋巴結轉移，其表達量降低，mTOR和p70S6K蛋白及mRNA表達則與CX43相反(P均<0.05，表2～4)。本實驗結果顯示，CX43、mTOR及p70S6K表達與腫瘤分化程度、TNM分期、浸潤深度及淋巴結轉移有關，與患者性別、年齡無關。

表2 胃癌組織中CX43、mTOR及p70S6K蛋白表達(免疫組化)與臨床病理特征的關系

2.3 胃癌組織中CX43、mTOR及p70S6K表達的相關性胃癌組織中CX43與mTOR及p70S6K蛋白的表達均呈負相關(r=-0.255，P<0.05；r=-0.273，P<0.05),mTOR與p70S6K蛋白表達呈正相關(r=0.701，P<0.01)；CX43與mTOR及p70S6K mRNA的表達均呈負相關(r=-0.642，P<0.01；r=-0.678，P<0.01)，mTOR與p70S6K mRNA表達呈正相關(r=0.630，P<0.01)。

表3 胃癌組織中CX43、mTOR及p70S6K蛋白表達(Western blot)與臨床病理特征的關系

表4 胃癌組織中CX43、mTOR及p70S6K mRNA表達與臨床病理特征的關系

3 討論

細胞間的通訊方式主要有間接通訊(如激素、生長因子及第二信使等)和細胞連接(包括封閉連接、錨定連接和通訊連接)。其中有關通訊連接的研究較多，GJIC是由6個相同或相似的連接蛋白(connexin, CX)環(huán)繞而成一直徑約1.5 mm的親水性跨膜孔道，孔道在相鄰細胞各占一半，其通過相互滑動的方式開啟或關閉，使得相對分子質量<1.0×104的小分子(如有機離子K+、Na+、Ca2+等)、第二信使(CGMP、CAMP等)及水溶性小分子量代謝物(如氨基酸、葡萄酸等)直接從一個細胞進入到相鄰細胞，參與細胞正常的增殖與分化、細胞穩(wěn)態(tài)的維持等過程。GJIC的功能下降或異常，可導致細胞增殖分化出現(xiàn)異常，促使腫瘤的形成。

目前發(fā)現(xiàn)的CX蛋白有21種，在胃組織中發(fā)現(xiàn)的類型有CX6、CX32和CX43，其中CX43與腫瘤的關系最為密切，因此其成為研究的熱點。Li等[5]通過電鏡觀察到在胃癌組織中CX43介導的GJIC結構遭到破壞，且隨著惡性程度的增加，破壞加重，由此推斷CX43介導的GJIC功能缺失或下降，可能是促癌變階段的重要機制。本實驗發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中CX43的表達明顯下降，且在低分化、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、浸潤全層、伴淋巴結轉移的胃癌組織中CX43的表達量低于高+中分化、臨床TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、浸潤未達全層、無淋巴結轉移的胃癌組織，表明CX43表達減少或缺如參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤及轉移。這與Tang等[6]的研究結果一致。趙宇等[7]研究發(fā)現(xiàn)CX43蛋白在肝細胞癌中的定位存在異常，其在正常細胞中均定位于細胞間相互接觸的細胞膜，在肝細胞癌中僅有極少量定位于胞膜，CX43表達多定位于細胞質，表達程度的減弱及定位的改變最終導致細胞膜上有功能性的GJ形成下降，這可能是肝細胞癌發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一。目前有研究通過一些手段預防或改變CX43在細胞膜上定位的恢復，或者上調CX43在細胞膜上的表達，使GJIC功能恢復，從而預防或抑制胃癌的進展。如Liu等[8]的研究發(fā)現(xiàn)HP感染相關的胃癌中GATA-3可直接與啟動子結合而抑制CX43的產生，使GATA-3沉默則可上調CX43的表達，從而抑制胃癌的進展。張立偉等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌中抑制磷酸化的細胞骨架蛋白(p-Ezrin)能夠減少CX43的磷酸化，恢復GJIC功能，從而抑制腫瘤發(fā)生。本實驗發(fā)現(xiàn)，在胃癌及正常胃黏膜組織中CX43陽性產物均位于細胞質內，可能與抗體的選擇有關，在胃癌中是否也存在CX43定位的異常仍需進一步探究。

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶相關激酶蛋白質家族成員。p70S6K屬于mTOR下游底物之一。激活的mTOR能促進p70S6K的磷酸化，磷酸化的p70S6K可以提高5′-TOR mRNA的翻譯效率，同時使p70S6K活性明顯增加，從而顯著增加蛋白質的合成，參與細胞的生長及增殖，過度激活mTOR/p70S6K信號通路，能夠促進癌細胞的增殖、血管形成、抑制細胞凋亡及自噬[10]。Liu等[11]和唐男等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在膽囊癌、卵巢上皮性癌中mTOR和p70S6K異常激活，且兩者表達呈正相關，均與腫瘤分化程度、TNM分期、有無淋巴結轉移等相關，與患者年齡、性別等無關。本實驗結果顯示，在胃癌組織中mTOR及p70S6K在基因及蛋白水平均存在過表達，并且隨著腫瘤惡性程度的增加、TNM分期越晚、浸潤程度加深、伴淋巴結轉移，胃癌組織中mTOR及p70S6K的表達量更多，其中p70S6K的表達量增加的尤為明顯，說明在mTOR過度激活后刺激更多的p70S6K活化，導致胃癌細胞的過度增殖。綜上可見，mTOR在腫瘤組織中高表達，提示mTOR/p70S6K信號通路的特異性激活可能參與了腫瘤的發(fā)生、浸潤及轉移過程。mTOR/p70S6K信號通路在多種腫瘤中被異常激活，因此其處于該信號通路的核心地位，同時也是治療腫瘤的潛在靶點。研究表明，雷帕霉素及其衍生物可以有效阻斷多種惡性腫瘤中mTOR和p70S6K的磷酸化，從而抑制腫瘤的生長。但從臨床試驗結果進行分析顯示[13-14]，在胃癌的抗mTOR單藥靶向藥物治療中，晚期胃癌患者的中位生存期及腫瘤控制率未顯示出該藥物的有效性?？赡苁且驗槔着撩顾丶捌漕愃莆锿ㄟ^負反饋引起Akt過度活化，減弱了其抗腫瘤作用，限制了單藥靶向治療的作用[15]。因此需要研究多點靶向聯(lián)合抑制劑，從而達到抑制胃癌細胞生長的作用。

Chen等[16]的研究結果表明，糖皮質激素通過抑制Akt/mTOR信號通路抑制骨組織中CX43的表達，是糖皮質激素引起骨質疏松的發(fā)病機制之一。Bi等[17]的研究發(fā)現(xiàn)在模擬糖尿病患者急性低血糖即高糖后低糖過程中，通過激活PI3K/Akt/mTOR和MEK/ERK1/2信號通路可下調H9c2心肌細胞CX43的表達。在胃癌中CX43是否直接或間接地通過與PI3K/Akt/mTOR信號通路的相互作用參與調節(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉移過程，目前未見相關報道。本實驗結果顯示，CX43表達降低和mTOR/p70S6K信號通路的激活均與胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉移有關。采用Pearson相關性分析結果顯示，胃癌組織中CX43與mTOR、p70S6K蛋白及mRNA表達均呈負相關。作者推測在胃癌中CX43表達下降，除了導致GJIC功能抑制或缺陷外，可能還通過與mTOR/p70S6K信號通路的相互作用參與調節(jié)胃癌的發(fā)生、侵襲及轉移過程，但具體作用機制仍有待進一步探究。這一發(fā)現(xiàn)為研究胃癌發(fā)病機制及靶向治療提供了研究方向。