基于RNA-Seq技術(shù)分析不同生物被膜形成能力的臨床耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌基因表達(dá)差異*

劉巍巍，國(guó)果，吳兆穎，毛成菊，李忠旬，賈利娜，尚小麗，彭建**，吳建偉**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體寄生蟲學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii，AB)生物被膜是疾病發(fā)病機(jī)理中重要的毒力因子[1]。與生物被膜感染相關(guān)的疾病發(fā)病率不斷上升，且治療更加困難。最常見的生物被膜感染包括口腔牙周炎、慢性中耳炎、鼻竇炎、尿路感染以及囊性纖維化患者的肺部感染等[2]。細(xì)菌通過附著在宿主組織(牙齒、黏膜表面等)形成生物被膜，抗生素難以徹底清除，導(dǎo)致慢性反復(fù)感染[3]；另一種情況是細(xì)菌對(duì)非生物表面的粘附，如在留置醫(yī)療器械或生物材料(中央靜脈導(dǎo)管、氣管導(dǎo)管、人工心臟瓣膜、隱形眼鏡等)表面形成生物被膜，并且細(xì)菌會(huì)從生物被膜上脫落并擴(kuò)散到機(jī)體周圍組織或血液中，進(jìn)一步加劇感染[4]。研究表明，生物被膜表型是異質(zhì)性的，不同的菌株能形成不同的生物被膜，白色念珠菌臨床分離株形成生物被膜強(qiáng)和弱的菌株導(dǎo)致的感染預(yù)后不同，與死亡率顯著相關(guān)[5]。研究報(bào)道，白色念珠菌中高生物被膜形成能力的菌株比低生物被膜形成能力的菌株具有更高的致病性[6]。與環(huán)境菌株相比，鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離菌株具有更高的形成強(qiáng)生物被膜的能力[7]。對(duì)100株分離自重癥監(jiān)護(hù)病房的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)58%的菌株表現(xiàn)出很強(qiáng)的生物被膜形成能力，且所有強(qiáng)生物被膜形成能力的菌株都為泛耐藥菌株[8]。臨床耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌(carbapenem-resistant AB，CRAB)是一種類似耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的超級(jí)耐藥菌，其形成生物被膜后對(duì)抗生素的耐藥性進(jìn)一步提高[9]。本研究中，采集臨床分離CRAB，通過對(duì)生物被膜形成能力強(qiáng)和弱的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較兩種不同生物被膜形成能力菌株的基因表達(dá)差異，探究導(dǎo)致其生物被膜形成差異的原因，以期為臨床CRAB生物被膜形成機(jī)制以及感染的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株 CRAB 4、13、55、78、117、177、191和196號(hào)菌株分離于臨床住院患者痰液、血液樣本。大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853為質(zhì)控菌，由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 Mueller-Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基、Trypticase Soy Broth(TSB)肉湯培養(yǎng)基和Luria-bertani(LB)固體培養(yǎng)基、結(jié)晶紫粉末均購(gòu)自北京索萊寶公司，溶菌酶(購(gòu)自上海生工公司)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(大連寶生物公司)，RIZOL(美國(guó)invitrogen公司)。恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)，細(xì)菌比濁儀購(gòu)自上海昕瑞有限公司，高壓蒸汽鍋購(gòu)自日本ALR公司，微量加樣槍、PCR擴(kuò)增儀、速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，ABI7300熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1臨床菌株鑒定及生物被膜的培養(yǎng)和收集 細(xì)菌的鑒定與藥敏試驗(yàn)均采用法國(guó)生物梅里埃VITEK-2全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)菌株的16SrRNA和rpoB基因進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和分析，以保證菌株鑒定的準(zhǔn)確性。選取生物被膜形成能力強(qiáng)(CRAB 4、55、78、117)的菌株作為強(qiáng)生物被膜(biofilm，BF)組，作為4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，菌株在形態(tài)和特性上相似。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液，用TSB培養(yǎng)基稀釋至每毫升106cfu。取菌液4 mL加入6孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，然后棄去游離菌液，PBS清洗后用細(xì)胞刮刀刮取生物被膜菌。選取生物被膜形成能力弱(CRAB 13、177、191、196)的菌株作為弱生物被膜(weak biofilm，WBF)組，作為4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，菌株在形態(tài)和特性上相似，余按BF組方法培養(yǎng)并收集生物被膜菌。

1.2.2RNA提取與質(zhì)量檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[10]的方法，先使用溶菌酶對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，再加入TRIZOL溶液裂解，冰上靜置15 min。加入氯仿200 μL混勻，冰上靜置5 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min。RNA位于上層水相中，小心吸取上清液，轉(zhuǎn)入新的離心管中。加入等體積的異丙醇混勻，室溫靜置10 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入75%乙醇(預(yù)冷)1 mL，輕輕吹打混勻，溶解沉淀，4 ℃，7 500 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥10 min。加入焦炭酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水30～50 μL溶解沉淀，分裝，置于-80 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA降解情況，通過分光光度計(jì)(NanoDrop ND-2000)測(cè)定RNA濃度。

1.2.3文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq) 提取到的RNA經(jīng)檢測(cè)合格后，去除Total RNA中的核糖體RNA(rRNA)，獲得mRNA。隨后加入fragmentation buffer將得到的mRNA隨機(jī)打斷成短片段，按照鏈特異性建庫(kù)的方式建庫(kù)[11]。文庫(kù)構(gòu)建完成后，先使用Qubit2.0 Fluorometer進(jìn)行初步定量，隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer對(duì)文庫(kù)的insert size進(jìn)行檢測(cè)，insert size符合預(yù)期后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)對(duì)文庫(kù)有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行Illumina測(cè)序。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 以鮑曼不動(dòng)桿菌AB030(NZ_CP009257.1)的基因組作為參考基因組，用Bowtie2軟件進(jìn)行基因組定位分析[12]。HTSeq v0.6.1用于計(jì)算映射到每個(gè)基因的讀數(shù)，使用DESeq軟件分析兩個(gè)比較組合之間的差異表達(dá)(每個(gè)組4個(gè)生物學(xué)重復(fù))。通過DESeq統(tǒng)計(jì)程序，將基于負(fù)二項(xiàng)式分布的模型確定數(shù)字基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)。使用Benjamini和Hochberg的方法來調(diào)整所得P值，設(shè)置差異基因篩選的標(biāo)準(zhǔn)[13]：校正后的P值 padj<0.05，且|log2(fold change)|>1。對(duì)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)進(jìn)行基因本體(geneontology，GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異基因 從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定得到的DEGs中挑取8個(gè)差異基因(表1)，利用qRT-PCR驗(yàn)證差異基因。按之前所述方法提取RNA后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系20 μL(cDNA模板2.0 μL、SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 10 μL、ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、ddH2O 6.0 μL、上下游引物各0.8 μL)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火31 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在ABI7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行，以AB 16SrRNA為內(nèi)參基因，目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT方法計(jì)算。

表1 Real-time PCR引物Tab.1 Real-time PCR primers

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量

總RNA條帶完整清晰，無雜帶，樣本無污染(圖1)。通過Agilent 2100 bioanalyzer精確檢測(cè)顯示，RIN值8～10，RNA完整性好；檢測(cè)RNA純度，OD260/280為1.8～2.2，OD260/230>1.8。樣品滿足后續(xù)建庫(kù)和試驗(yàn)要求。見表2。

注：M為marker條帶，1～4為BF組總RNA，5～8為WBF組總RNA。圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 RNA sepharose gel electrophoretogram

表2 RNA樣品質(zhì)量信息Tab.2 RNA sample general information

2.2 mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)

樣品測(cè)序結(jié)果顯示錯(cuò)誤率為 0.03%，顯示測(cè)序結(jié)果可靠。每組樣品的 clean reads 數(shù)據(jù)>1G ，測(cè)序深度足夠覆蓋所有可能存在的基因。Q20>97%，Q30>92%，實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的測(cè)序reads成功比對(duì)到基因組的比例高于82%，其中具有多個(gè)定位的測(cè)序序列占總體的百分比<7%，符合后續(xù)分析的要求。見表3。

表3 各樣品mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)Tab.3 Sample mRNA sequencing data

2.3 基因表達(dá)差異分析

DEGs的火山圖顯示，與WBF組比較，BF組有171個(gè)基因差異表達(dá)，包括106個(gè)上調(diào)(紅色)的基因和65個(gè)下調(diào)(綠色)的基因(圖2)。ATP相關(guān)基因：LamB/YcsF家族蛋白(IX87_RS04005)參與ATP水解等過程，其 log2(fold change)值為-3.48；ATP合酶亞基α(IX87_RS15035)、ATP合酶亞基β(IX87_RS15045)、ATP合酶亞基γ(IX87_RS15040)、ATP合酶亞基δ(IX87_RS15030)的log2(fold change)值分別為-2.1、-2、-2.3和-2.2。DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因：DNA結(jié)合蛋白(IX87_RS19850)的log2(fold change)值為3.8；AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(IX87_RS19260)、XRE家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(IX87_RS02480)、Lrp/AsnC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(IX87_RS02640)均為DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因，log2(fold change)值分別為2.7、2.1和1.7。菌毛合成相關(guān)基因：菌毛合成調(diào)控相關(guān)蛋白CsuA(IX87_RS06910)的log2(fold change)值為2.6。膜相關(guān)基因：外膜蛋白(IX87_RS01665)的log2(fold change)值為-2.1；外膜孔蛋白OmpW家族蛋白(IX87_RS06185)參與鐵的吸收和黏附素的結(jié)合過程，log2(fold change)值為2.4。上調(diào)的DEGs主要涉及DNA結(jié)合、膜蛋白、菌毛調(diào)控相關(guān)基因等，下調(diào)的DEGs主要涉及ATP的合成和分解、外膜蛋白等。見圖2。

注：紅、綠點(diǎn)分別為上調(diào)和下調(diào)的DEGs，藍(lán)點(diǎn)為不顯著DEGs。圖2 DEGs火山圖Fig.2 DEGs volcanoplot

2.4 差異基因GO富集分析

GO富集分析結(jié)果顯示最顯著的30個(gè)GO條，如陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(cation transmembrane transport)、質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(proton transmembrane transport)、嘌呤核糖核苷酸代謝過程(purine ribonucleotide metabolic process)、嘌呤核苷酸的生物合成過程(purine nucleotide biosynthetic process)、核糖核苷酸代謝過程(ribonucleotide metabolic process)、核糖核苷酸的生物合成過程(ribonucleotide biosynthetic process)、ATP代謝過程(ATP metabolic process)及ATP生物合成過程(ATP biosynthetic process)等顯著富集于生物過程；質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)雙扇形ATP酶復(fù)合物，催化結(jié)構(gòu)域(proton-transporting two-sector ATPase complex,catalytic domain)及質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶復(fù)合物(proton-transporting ATP synthase complex)顯著富集于細(xì)胞組分；ATP酶活性，與離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)耦合、旋轉(zhuǎn)機(jī)制(ATPase activity,coupled to transmembrane movement of ions,rotational mechanism)、活性離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性(active ion transmembrane transporter activity)等顯著富集于分子功能類別。見圖3。

注：(1)P<0.05。圖3 DEGs的GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of DEGs

2.5 差異基因KEGG富集分析

KEGG富集分析結(jié)果表明，DEGs參與的KEGG代謝通路中最顯著的通路有20條，分別為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解(valine,leucine and isoleucine degradation)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)、β-丙氨酸代謝(beta-alanine metabolism)、泛酸和CoA生物合成(pantothenate and CoA biosynthesis)、代謝途徑(metabolic pathways)、香葉醇的降解(geraniol degradation)、RNA降解(RNA degradation)、丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(alanine,aspartate and glutamate metabolism)、組氨酸代謝(histidine metabolism)、精氨酸和脯氨酸代謝(arginine and proline metabolism)、半乳糖代謝(galactose metabolism)、檸檬烯和蒎烯降解(limonene and pinene degradation)、硫代謝(sulfur metabolism)、抗生素的生物合成(biosynthesis of antibiotics)、脂肪酸代謝(fatty acid metabolism)、萬(wàn)古霉素耐藥(vancomycin resistance)、肽聚糖的生物合成(peptidoglycan biosynthesis)和甲烷代謝(methane metabolism)。見圖4。

2.6 DEGs的驗(yàn)證

從轉(zhuǎn)錄組差異基因中挑選8個(gè)基因，其中上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的基因分別為5和3個(gè)；采用qRT-PCR驗(yàn)證不同生物被膜形成能力的兩組菌株的差異，該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果趨勢(shì)一致，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。見圖5。

注：橫坐標(biāo)為基因富集指數(shù)，縱坐標(biāo)為信號(hào)通路名稱。圖4 DEGs的KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment scatter plot of DEGs

圖5 8個(gè)差異基因表達(dá)水平的比較(RNA-Seq、qTR-PCR)Fig.5 Expression of 8 differential genes(RNA-Seq，qTR-PCR)

3 討論

細(xì)菌耐藥問題一直備受關(guān)注，研究表明，細(xì)菌在受到抗菌藥物等外界壓力刺激下會(huì)發(fā)生耐藥基因的變化，上調(diào)耐藥基因的表達(dá)或進(jìn)化以獲得某些特性，導(dǎo)致多重耐藥、泛耐藥菌株的克隆流行[14-15]。近年來，CRAB的檢出率逐年上升，已被多次報(bào)道[16-17]。鮑曼不動(dòng)桿菌形成生物被膜是其重要的毒力因子，與一般的細(xì)菌導(dǎo)致的感染相比，生物被膜能為菌體提供持續(xù)的防護(hù)，幫助細(xì)菌適應(yīng)不利的外環(huán)境和躲避宿主的攻擊，形成穩(wěn)定釋放細(xì)菌的慢性感染源，導(dǎo)致感染反復(fù)發(fā)生，同時(shí)會(huì)增強(qiáng)對(duì)抗菌藥物的抵抗能力，可由敏感變成耐藥，給治療帶來更大的阻礙[18-19]。了解臨床CRAB形成不同生物被膜的分子機(jī)制，對(duì)其導(dǎo)致的嚴(yán)重感染的防治和診斷等研究有著重要的意義。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是研究基因表達(dá)變化的重要手段，轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定的生物學(xué)過程，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域[20]。經(jīng)RNA-Seq分析，將生物被膜形成能力強(qiáng)和弱的臨床分離CRAB生物被膜態(tài)菌進(jìn)行比較，獲得171個(gè)DEGs，其中106個(gè)基因?yàn)樯险{(diào)表達(dá)，65個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；隨機(jī)挑取了8個(gè)差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，表明測(cè)序結(jié)果可靠。DEGs主要包括ATP水解和合成相關(guān)基因、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、外膜蛋白以及菌毛調(diào)控基因。值得注意的是，與生物被膜形成能力弱組相比，生物被膜形成能力強(qiáng)組中菌毛調(diào)控相關(guān)基因CsuA表達(dá)上調(diào)，表明菌毛加快合成，促進(jìn)生物被膜的形成。細(xì)菌對(duì)宿主表面的粘附是形成生物被膜的第一步。菌毛則介導(dǎo)了細(xì)菌對(duì)非生物表面的粘附，幫助細(xì)菌在新的表面定殖[21]。研究表明，外膜蛋白參與生物被膜的形成，特別是在初始粘附階段發(fā)揮作用；相對(duì)于非生物表面，外膜蛋白OmpA被證明對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌19606粘附在生物表面的能力至關(guān)重要[22-23]。并且，CarO和OmpA等膜蛋白能和碳青霉烯酶OXA-23發(fā)生相互作用，從而提高對(duì)抗生素的耐藥性[24]。對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株與敏感菌株進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)孔蛋白OmpW在多重耐藥菌株BAA-1605中顯著上調(diào)[25]。本研究中，與WBF組相比，BF組外膜蛋白基因(IX87_RS01665)表達(dá)下調(diào)，孔蛋白OmpW基因(IX87_RS06185)表達(dá)上調(diào)。這表明膜蛋白相關(guān)基因的變化影響臨床CRAB形成不同的生物被膜，且影響其耐藥性。GO富集分析顯示差異表達(dá)基因顯著富集到陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、核酸及ATP的合成和代謝等生物合成過程中。KEGG富集分析主要涉及細(xì)菌的生化代謝途徑的改變，如各種氨基酸的代謝合成、氧化磷酸化等。以上結(jié)果都表明菌株之間的生化代謝途徑的改變對(duì)生物被膜形成能力的強(qiáng)弱有影響，而抗生素的生物合成、萬(wàn)古霉素耐藥通路的變化表明細(xì)菌生物被膜形成能力與其對(duì)抗生素的耐藥性有關(guān)。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，探討臨床CRAB生物被膜形成能力不同的菌株之間基因表達(dá)的差異，鑒定出信號(hào)傳導(dǎo)和代謝過程等途徑相關(guān)基因，下一步，將選擇部分基因進(jìn)行驗(yàn)證和功能分析，從而為后續(xù)的分子機(jī)制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。