白蛋白紫杉醇與五氟尿嘧啶聯(lián)合用藥對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖及周期的影響*

成興真，楊芳 ，王楊，聶微，劉澤瑩，王黔，嚴(yán)芝強(qiáng)**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 外科學(xué)教研室,貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 臨床血液教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心，貴州 貴陽(yáng) 550004；4.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 胃腸外科，貴州 貴陽(yáng) 550004)

白蛋白紫杉醇(albumin-bound paclitaxel,Nab-PTX)是一種新型無溶劑的紫杉醇(paclitaxel,PTX)納米制劑，具有微管抑制劑的作用，其抗腫瘤原理是通過促進(jìn)微管蛋白聚合以及穩(wěn)定微管導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞停滯在 G2-M 期，最終導(dǎo)致有絲分裂細(xì)胞死亡[1-2]。目前Nab-PTX已廣泛用于乳腺癌、肺癌和胰腺癌等腫瘤的治療，但日本胃癌治療指南(最新版)指出 Nab-PTX可用于胃癌治療[3]，發(fā)現(xiàn)在可切除胃癌的圍手術(shù)期、腹膜轉(zhuǎn)移、進(jìn)展期胃癌、不可切除及復(fù)發(fā)性胃癌等的治療中均表現(xiàn)出較好療效[4-7]，且國(guó)內(nèi)將 Nab-PTX應(yīng)用于胃癌治療的臨床報(bào)道也表明 Nab-PTX抗腫瘤效果良好[8-13]。五氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)作為各大指南推薦的胃癌一線化療藥[3，14-15]，其作用機(jī)制為抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，從而阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶核苷酸，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[16]。目前關(guān)于Nab-PTX聯(lián)合5-Fu對(duì)胃癌細(xì)胞的研究較少，且尚無研究表明Nab-PTX聯(lián)合5-Fu對(duì)胃癌細(xì)胞周期的作用影響，因此本研究通過研究Nab-PTX聯(lián)合5-Fu對(duì)胃癌細(xì)胞(AGS)增殖及周期的影響，為胃癌用藥提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1細(xì)胞、試劑及藥物 胃癌細(xì)胞株AGS購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，RMPI 1640、PBS緩沖液、普通胰酶(含EDTA)及不含EDTA胰酶、胎牛血清均購(gòu)于Biological Industries(BI，以色列)，Cell Counting Kit-8購(gòu)于Dojindo Laboratories(日本)，流式細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Becton,Dickinson and Company(BD，美國(guó))，Nab-PTX購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，5-Fu購(gòu)自天津金耀藥業(yè)有限公司。

1.1.2主要儀器 流式細(xì)胞儀Canto II plus (美國(guó),Becton,Dickinson and Company)、酶標(biāo)儀Varioskan LUX (美國(guó),Thermo scientific)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的 RMPI 1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞株AGS，并置于含 5% CO2的濕潤(rùn)空氣以及37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；胰酶(含EDTA)消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞單懸液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS 細(xì)胞以 1×104/孔接種于96孔板中，每孔加入200 μL完全培養(yǎng)基。24 h后去除培養(yǎng)基，PBS洗滌3次并向Nab-PTX組加入 Nab-PTX(濃度梯度為0.1、0.2、0.4 μmol/L)，5-Fu組加入5-Fu(濃度梯度分別為1、2、4 μmol/L)，Nab-PTX+5-Fu組加入Nab-PTX+5-Fu[濃度梯度分別為(0.1+1)、(0.2+2)、(0.4+4)μmol/L]，各200 μL,將只含200 μL RMPI 1640培養(yǎng)基的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的AGS細(xì)胞作為對(duì)照組(Ctrl組)，僅含200 μL RMPI 1640 培養(yǎng)基(不含AGS細(xì)胞)作為空白組。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，去原培養(yǎng)液；用 PBS 洗滌3次，加入100 μL的 RPMI 1640 培養(yǎng)液、每個(gè)孔10 μL CCK-8 溶液,在 37 °C 含 5 % CO2孵箱孵育1.5 h，使用酶標(biāo)儀在吸光度為 450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞增殖存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 取 2×105個(gè)對(duì)數(shù)期的AGS細(xì)胞，接種于6孔板中,待生長(zhǎng)至80%時(shí),分別加入 Nab-PTX(0.2 μmol/L)、5-Fu(2 μmol/L)、Nab-PTX+5-Fu[(0.2+2)μmol/L]；培養(yǎng)細(xì)胞24 h，用預(yù)冷PBS洗滌3次，加入不含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶消化，離心后收集細(xì)胞；收集細(xì)胞后加入 4 ℃ 預(yù)冷的70%乙醇固定24 h，1 000 r/min離心后去上清，使用預(yù)冷 PBS 洗滌細(xì)胞 3 次，后加入 500 μL Staining Buffer、25 μL PI、10 μL RNA 酶，避光 37 ℃ 水浴 30 min 后上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算每組細(xì)胞所處G0/G1、S以及G2/M期的比例，評(píng)估每組細(xì)胞的周期阻滯情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖

培養(yǎng)72 h時(shí),與Ctrl組比較，Nab-PTX組(0.4 μmol/L)、5-Fu組(2、4 μmol/L)及Nab-PTX+5-Fu組[(0.1+1)、(0.2+2)、(0.4+4)μmol/L]細(xì)胞存活率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；結(jié)果顯示，與Ctrl組比較，同一時(shí)間點(diǎn)(培養(yǎng)72 h)不同濃度的Nab-PTX組、5-Fu組、Nab-PTX+5-Fu組細(xì)胞存活率增殖能力均受到抑制，且隨濃度增加，細(xì)胞增殖存活率下降。同一濃度[Nab-PTX組(0.2 μmol/L)、5-Fu組(2 μmol/L)、Nab-PTX+5-Fu組(0.2+2)μmol/L]不同作用時(shí)間，各組細(xì)胞的存活率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，其中培養(yǎng)24 h時(shí)的Nab-PTX組和Nab-PTX+5-Fu組，培養(yǎng)48 h 時(shí)的5-Fu組和Nab-PTX+5-Fu組，培養(yǎng)72 h 時(shí)的3組與對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)的Ctrl組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示Nab-PTX、5-Fu、Nab-PTX+5-Fu抑制AGS細(xì)胞的增殖具有劑量-時(shí)間依賴性，Nab-PTX+5-Fu組較Nab-PTX組、5-Fu組能更有效抑制AGS細(xì)胞的增殖。見圖1。

注：A為 Nab-PTX、5-Fu、Nab-PTX+5-Fu不同濃度作用72 h對(duì)AGS細(xì)胞增殖能力的影響變化；B為Nab-PTX(0.2 μmol/L)、5-Fu(0.2 μmol/L)、Nab-PTX+5-Fu(0.2+2 μmol/L)作用不同時(shí)間對(duì)AGS細(xì)胞增殖能力的影響變化；(1)與Ctrl組相比，P<0.05。圖1 各組AGS細(xì)胞抑制率(CCK-8)Fig.1 Cell inhibition rates of AGS in each group (CCK-8)

2.2 細(xì)胞周期

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示：各組處理24 h后，與Ctrl組相比，5-Fu組G0/G1期比例明顯減少、S期比例明顯增加，Nab-PTX組及Nab-PTX+5-Fu組G2/M期比例明顯增加，組間對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Ctrl組相比，Nab-PTX組及Nab-PTX+5-Fu組G0/G1期比例明顯減少，Nab-PTX+5-Fu組S期比例明顯增加，5-Fu組G2/M期比例明顯減少，組間對(duì)比結(jié)果極具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此可見，Nab-PTX組使AGS細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，5-Fu組使細(xì)胞周期阻滯于S期，Nab-PTX+5-Fu組使AGS細(xì)胞周期阻滯在S期，且Nab-PTX+5-Fu組S期比例較5-Fu組增加，G2/M期較Nab-PTX組明顯減少。見圖2。

3 討論

目前胃癌的物治療仍以化療或新輔助化療為主，當(dāng)前各大指南推薦的化療藥物主要為5-Fu及其衍生物、鉑類、PTX及其衍生物等，而化療藥物的耐藥性成為胃癌有效治療的主要障礙[17]。實(shí)驗(yàn)研究及臨床試驗(yàn)表明Nab-PTX在胃癌治療中有明顯作用[7，18-19 ]，作為PTX制劑衍生物，Nab-PTX的抗腫瘤機(jī)制主要是誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白聚合，抑制其解聚，進(jìn)而有效抑制細(xì)胞有絲分裂過程中紡錘體及紡錘絲的形成，故導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)育在G2-M期受到阻滯和在有絲分裂時(shí)發(fā)生死亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。與PTX相比，Nab-PTX的優(yōu)勢(shì)在于不僅完全避免了激素脫敏處理，還改變了體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征、提高了患者的耐受劑量，提高藥物在腫瘤組織中蓄積[20-21]。一項(xiàng)三期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，Nab-PTX每周1次用藥的生存率不遜于PTX每周1次用藥的生存率,這種優(yōu)勢(shì)使其成為胃癌二線治療的潛在方案[19]。

注：A為Ctrl組AGS細(xì)胞，B為Nab-PTX組AGS細(xì)胞，C為5-Fu組AGS細(xì)胞，D為Nab-PTX+5-Fu組AGS細(xì)胞，E為各組AGS細(xì)胞24 h結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；與Ctrl組相比，(1)P<0.01，(2)P<0.05。圖2 Nab-PTX、5-Fu、Nab-PTX+5-Fu作用24 h對(duì)AGS細(xì)胞周期的影響Fig.2 The effects of Nab-PTX,5-Fu ,and Nab-PTX+5-Fu treatment for 24 h on AGS cell cycle

有研究表明，從3例胃癌患者手術(shù)標(biāo)本建立的人胃癌器官模型的研究中，Nab-PTX半數(shù)抑制率(IC50)明顯低于5-Fu及表柔比星，且隨著 Nab-PTX作用時(shí)間增加，腫瘤細(xì)胞的凋亡率明顯增加，Nab-PTX具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，可望成為治療GC患者的一線藥物[22]；研究還發(fā)現(xiàn)，Nab-PTX較5-Fu更能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且同樣表現(xiàn)出隨作用時(shí)間增加抑制率增加的現(xiàn)象。在本研究中發(fā)現(xiàn)，Nab-PTX聯(lián)合5-Fu作用于胃癌細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率高于 Nab-PTX、5-Fu單獨(dú)應(yīng)用時(shí)；且有研究證實(shí)，在胰腺癌細(xì)胞中，吉西他濱和 Nab-PTX聯(lián)合作用，可增強(qiáng)兩種藥物的細(xì)胞毒性作用，從而降低其劑量，減少不良反應(yīng)的發(fā)生[23]。由此推測(cè)，在將來胃癌的臨床治療中，Nab-PTX聯(lián)合5-Fu較 Nab-PTX或5-Fu單藥有更好的抗腫瘤作用。

眾所周知，細(xì)胞周期須經(jīng)歷DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期),DNA合成后期(G2期)以及細(xì)胞有絲分裂期(M期)，這些過程又可以劃分為DNA復(fù)制與染色體分裂兩個(gè)部分，而在整個(gè)增殖過程中，有著嚴(yán)密精確的調(diào)控機(jī)制，如CDKs正向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，同時(shí)CDKs依賴cyclins,cyclinD與CDK4/6結(jié)合在G1期末期發(fā)揮作用，細(xì)胞由G1期過渡到S期則需cyclinE與CDK2結(jié)合[24]，CDK2與cyclinB結(jié)合將促使細(xì)胞從S期進(jìn)入G2期，進(jìn)入M期則需要cyclinA與CDK1結(jié)合。在細(xì)胞周期中，生長(zhǎng)因子發(fā)揮著重要作用，但同時(shí)細(xì)胞周期也受到CKIs的反向調(diào)控作用，其發(fā)揮作用的機(jī)制主要是抑制CDKs與cyclins的結(jié)合。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，需在CDKs、cyclins、CKIs共同協(xié)調(diào)下完成，其監(jiān)控途徑又主要由在G1期向S期轉(zhuǎn)化起首要作用的pRb和DNA損傷檢查點(diǎn)上的p53發(fā)揮作用[25-27]。在胰腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Nab-PTX與吉西他濱聯(lián)用增強(qiáng)了細(xì)胞在S期的積累，由于在S期積累的細(xì)胞增加，導(dǎo)致G2期細(xì)胞的急劇減少[23]。同時(shí)通過對(duì)細(xì)胞周期信號(hào)蛋白的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)cyclinD1水平不受治療影響，而吉西他濱單獨(dú)或與 Nab-PTX聯(lián)合使用后，cyclinA2和cyclinE2水平升高。Nab-PTX聯(lián)合吉西他濱與吉西他濱單獨(dú)用藥相比，其cyclinB1的表達(dá)降低[23]。而cyclinB1參與S-G2細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變[25]，由此也佐證了聯(lián)合用藥G2/M期細(xì)胞的減少。由此推測(cè) Nab-PTX似乎干擾細(xì)胞S期的早期階段。本研究證實(shí)，Nab-PTX能將 AGS細(xì)胞株的細(xì)胞周期阻滯在G2/M期、5-Fu細(xì)胞周期阻滯發(fā)生在S期、Nab-PTX聯(lián)合5-Fu使細(xì)胞周期阻滯則發(fā)生在S期；相較于5-Fu單藥，Nab-PTX聯(lián)合5-Fu能使更多細(xì)胞阻滯于S期，由此推測(cè)Nab-PTX聯(lián)合5-Fu作用于胃癌細(xì)胞，一方面可能通過激活cyclinA2和cyclinE2表達(dá) ，使細(xì)胞阻滯在S期；Nab-PTX還可加強(qiáng)5-Fu對(duì)DNA的損傷作用，激活p53抑制CDK2與cyclinB，Nab-PTX同時(shí)激活Rb，使細(xì)胞周期不能順利進(jìn)入M期[27]。

綜上所述，Nab-PTX與5-Fu聯(lián)合用藥不僅能有效抑制細(xì)胞增殖，其抑制細(xì)胞增殖隨劑量及時(shí)間增加而增加，研究結(jié)果可為 Nab-PTX廣泛應(yīng)用于胃癌治療提供數(shù)據(jù)參考，而 Nab-PTX與5-Fu聯(lián)合用藥使細(xì)胞周期阻滯在S期，但其潛在機(jī)制有待進(jìn)一步探索。