植物DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)響應(yīng)Cd脅迫的研究進(jìn)展

王鶴潼，賈春云，張延召，趙強(qiáng)，李曉軍，鞏宗強(qiáng)，劉宛*

（1.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽110016；2.沈陽大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，沈陽110044；3.洛陽師范學(xué)院，河南 洛陽471022；4.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶163319）

Cd 是我國水體及農(nóng)田土壤污染危害最嚴(yán)重的一種重金屬元素。土壤Cd污染具有隱蔽性、長期性、不可逆性和高富集性等特點(diǎn)。據(jù)2014 年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，土壤重金屬Cd 污染面積大，Cd污染點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)7%，污染程度嚴(yán)重。有充分的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，Cd在生物體內(nèi)的半衰期長（18～30 a）、化學(xué)性質(zhì)活躍、遺傳毒性大[1-3]。土壤中的Cd 極易被植物吸收，富集在農(nóng)作物的可食部分，并通過食物鏈危害人體健康。目前，Cd 污染已經(jīng)成為影響我國未來農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和人體健康的環(huán)境問題之一[1-3]。

Cd 脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)出現(xiàn)不同形式的DNA損傷，例如堿基錯(cuò)配、堿基改變、DNA 氧化、DNA 加合物、DNA 單鏈斷裂（SSBs）、DNA 雙鏈斷裂（DSBs）、DNA 插入缺失環(huán)、DNA 鏈間交聯(lián)連接（Interstrand cross-links，ICLs）、DNA 鏈內(nèi)交聯(lián)和甲基化[1-4]。DNA損傷迅速誘導(dǎo)：（1）DNA 損傷響應(yīng)（DDR）信號(hào)，如毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變蛋白（ATM）、毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變相關(guān)蛋白（ATR）及其下游的信號(hào)通 路SOG1、BRCA1、MAD2、KU70、MRN（MRE11-RAD50-NBS1）復(fù)合體、單鏈結(jié)合蛋白（RPA）復(fù)合體。（2）細(xì)胞周期阻滯（如G1/S 或G2/M 期阻滯），細(xì)胞內(nèi)復(fù)制以及細(xì)胞凋亡。（3）不同形式的DNA 修復(fù)途徑。a.DNA 錯(cuò) 配 修 復(fù)（MMR）系 統(tǒng)，如MSH2、MSH3、MSH6、MSH7、MLH1、PMS1；b.堿基剪切修復(fù)（BER），poly（ADP-ribose）polymerase-1（PARP-1）等；c.核苷酸剪切修復(fù)（NER），XPB、XPD、p53 等；d.同源重組修復(fù)（HR），BRCA1、ATM、ATR 等；e.非同源末端連接修復(fù)（NHEJ），DNA-PK 等；f.ICLs 修復(fù)。如果DNA 損傷嚴(yán)重，則誘導(dǎo)細(xì)胞分裂停止、甚至細(xì)胞凋亡[1-8]。本文就Cd 脅迫條件下，植物細(xì)胞內(nèi)DNA MMR 系統(tǒng)對(duì)DNA 損傷的感知/修復(fù)、細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)上的作用機(jī)制，以及表觀遺傳因素如DNA 甲基化、染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾和非編碼RNA 修飾（如miRNAs/lncRNAs）等調(diào)控DNA MMR 基因的作用機(jī)理作簡要綜述。

1 Cd脅迫誘導(dǎo)植物細(xì)胞中的DNA損傷反應(yīng)

維持基因組的完整性對(duì)植物的生長、代謝和發(fā)育過程極為重要。當(dāng)植物進(jìn)行細(xì)胞分裂時(shí)，通過DNA復(fù)制形成的新生細(xì)胞從母細(xì)胞中獲得一套完整的基因組。但是在Cd 脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)出現(xiàn)不同形式的DNA 損傷，后者迅速誘導(dǎo)DDR 信號(hào)通路，如DNA 損傷的感知、DNA 修復(fù)因子的招募、DNA 修復(fù)途徑的啟動(dòng)和協(xié)調(diào)、細(xì)胞周期阻滯（如G1/S、S 或G2/M期阻滯）和細(xì)胞凋亡[2，4，7]。

1.1 感知Cd脅迫誘導(dǎo)的DNA損傷

許多研究結(jié)果表明，Cd 脅迫下，識(shí)別植物細(xì)胞內(nèi)不同種類DNA 損傷的感受器主要包括3 類：MutS、單鏈結(jié)合蛋白R(shí)PA（Replication protein A）復(fù)合體和MRN 復(fù) 合 體[2，4，7]。MutSα、MutSβ 和MutSg 是DNA MMR 系統(tǒng)中的3 種異源二聚體蛋白復(fù)合體，分別由MSH2/MSH6、MSH2/MSH3 和MSH2/MSH7 組成，其在DNA 損傷修復(fù)過程中的DNA 損傷識(shí)別、位點(diǎn)結(jié)合和細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激活過程中發(fā)揮不同作用[1-2，7]。MutSα 主要識(shí)別單個(gè)堿基錯(cuò)配，如氧化的堿基錯(cuò)配（Dihydro-8-oxo-guanine）、甲基化的堿基錯(cuò)配（O6meG：T和O6meG：C）和小的插入缺失環(huán)（IDL），這些單堿基錯(cuò)配主要來源于繞過DNA 損傷合成（TLS）途徑和/或易錯(cuò)DNA聚合酶（Error-prone polymerases）。MutSβ 主要感知IDL 和ICL。MutSg 識(shí)別G/G、G/A、A/A 和C/A 單堿基錯(cuò)配，但比MutSα 識(shí)別C/A 的能力更強(qiáng)[1，2，7，9]。另外，盡管紫外線（UV）誘導(dǎo)的DNA 損傷，如環(huán)丁酰環(huán)，即嘧啶二聚體（CPD）和（6-4）嘧啶-嘧啶酮二聚體（6-4-PP），主要由核酸剪切酶識(shí)別，但是由于在DNA 復(fù)制中CPD 和6-4-PP 等損傷位點(diǎn)會(huì)發(fā)生錯(cuò)配，因此也可被MutSα 識(shí)別，并誘導(dǎo)DNA 損傷反應(yīng)[9-10]。另外MutS，特別是MutSα 可以不依賴DNA 復(fù)制過程而識(shí)別基因組DNA 損傷，并誘導(dǎo)DNA 損傷信號(hào)，但是目前有關(guān)其詳細(xì)機(jī)理仍然不甚清楚[1-2]。

Zou 等[11]研究表明，人細(xì)胞通過ATR-ATRIP識(shí)別RPA-ssDNA（單鏈DNA）復(fù)合體，從而感知DNA復(fù)制脅迫和SSB；由于DNA 聚合酶解偶聯(lián)和DNA解螺旋，所以在復(fù)制叉上產(chǎn)生長片段的ssDNA。RPA感知/包裹ssDNA，依次招募Rad9-Hus1-Rad1 復(fù)合體和Rad17–replication factor C（RFC）復(fù)合體，并結(jié)合于ssDNA。上述過程亦發(fā)生于NER 和DSB 修復(fù)過程中[4]。當(dāng)DSB 存在于一條姊妹染色單體時(shí)，通過MRN復(fù)合體進(jìn)行識(shí)別DSBs 末端[4，12]。例如污染脅迫下，擬南芥mre11 和rad50 突變體幼苗表現(xiàn)出高度敏感性[4]，類似現(xiàn)象亦存在于脊椎動(dòng)物的胚胎細(xì)胞中[13]。而且，mre11 或rad50 突變體的有絲分裂細(xì)胞中出現(xiàn)高水平的染色體橋，表明基因組DNA 不穩(wěn)定性顯著增加[4]。與RPA 感受器相似，ICL 修復(fù)和DNA MMR 系統(tǒng)參與識(shí)別和修復(fù)DSBs[14]。盡管植物的三類DNA 損傷感受器均可以參與DDR 信號(hào)通路，但是我們對(duì)擬南芥和大豆的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DNA MMR 系統(tǒng)在修復(fù)Cd誘導(dǎo)DNA損傷方面的作用更為重要[1-2，7]。

1.2 Cd脅迫下DNA損傷激活A(yù)TR和ATM

ATM 和ATR 是含有絲氨酸/蘇氨酸的兩種關(guān)鍵蛋白激酶（300～500 kDa），屬于進(jìn)化上高度保守的磷脂酰肌醇蛋白激酶家族（PIKK）。在正常條件下，ATM 和ATR 以二聚體狀態(tài)存在，沒有活性。但在擬南芥DDR 中，Cd 脅迫引起的DNA 損傷可由MSH2 與MSH6 識(shí)別/感知，從而激活DNA 損傷檢驗(yàn)點(diǎn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[1-2，7，15-16]：（1）MSH2 可直接向ATR 傳遞損傷信號(hào)，通過PRD與Bridge結(jié)構(gòu)域構(gòu)象改變，激活A(yù)TR；（2）利用MSH2 產(chǎn)生γ-H2AX 位點(diǎn)，募集DNA 修復(fù)蛋白，可將DNA 損傷信號(hào)傳遞給ATM，使ATM 同源二聚體解離成單體，激活A(yù)TM 活性。在激活Cd誘導(dǎo)的DDR 信號(hào)途徑和維持基因組DNA 穩(wěn)定性方面，激活態(tài)的ATR/ATM 具有極大的促進(jìn)作用[2，15-16]。例如，ATR通常與組成性相互作用伴侶（IP）結(jié)合，形成ATRATRIP 復(fù) 合 體[4]。RPA 和MutS 識(shí) 別DNA 損 傷 后，與ATR-ATRIP 相互作用，從而激活依賴ATR 的DDR[11]；RPA-ssDNA 復(fù)合體于S 期復(fù)制叉部位形成，而招募MutS 與DNA 復(fù)制無關(guān)[17]。上述復(fù)合體形成后，ATR立即發(fā)生反式自磷酸化作用，與TopBP1對(duì)接后，進(jìn)一步增強(qiáng)ATR 的活性[18]。Yoo 等[19]報(bào)道，磷酸化的ATM與TopBP1 對(duì)接后，亦可以增加ATR 的活性。對(duì)DNA DSB而言，通過NBS1的C末端，ATM 被招募到DSB位點(diǎn)自磷酸化，從而激活有關(guān)DDR 信號(hào)途徑中的大量下游元件磷酸化。例如，具有重要功能的組蛋白變種H2AX 被磷酸化后，產(chǎn)生γ-H2AX[19-20]。在DNA DSB位點(diǎn)，這些γ-H2AX 招募DNA 修復(fù)蛋白后，可以進(jìn)一步增強(qiáng)DDR 信號(hào)[21]。植物ATM 突變體（Knock out，KO）或ATR-KO 幼苗，在沒有脅迫的正常情況下可以正常生長、開花、結(jié)實(shí)種子；擬南芥ATR-KO 幼苗對(duì)DNA 復(fù)制脅迫試劑（如阿非迪霉素、羥基脲）高度敏感，不能完成正常的生長發(fā)育；而DSB試劑（如離子輻射、甲基甲烷磺鹽）則顯著抑制擬南芥ATM-KO 幼苗的生長發(fā)育[21-22]。

1.3 Cd脅迫下ATR和ATM的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

Cd 脅迫下，ATR 和ATM 被DNA 損傷激活后，立即在DNA 損傷位點(diǎn)發(fā)揮作用，激活信號(hào)傳導(dǎo)通路下游的1 000 多種轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)亦在基因組水平上磷酸化700 多種底物。這些底物執(zhí)行一系列下游的信號(hào)傳導(dǎo)功能，包括激活DNA復(fù)制起點(diǎn)、穩(wěn)定/重新啟動(dòng)DNA 復(fù)制叉、修復(fù)不同種類的DNA 損傷、激活細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和細(xì)胞凋亡[1-2，4，7，21，23]。

1.3.1 Cd脅迫誘導(dǎo)的G2/M期阻滯

許多研究[1-2，7]報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)主要存在3 類細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)：G1/S 期檢驗(yàn)點(diǎn)、S 期檢驗(yàn)點(diǎn)和G2/M 期檢驗(yàn)點(diǎn)，它們均可以引起細(xì)胞周期阻滯。遺傳學(xué)和生物化學(xué)結(jié)果表明，細(xì)胞周期進(jìn)程至少被兩類蛋白復(fù)合體調(diào)控：細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（CDKs）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）。與動(dòng)物細(xì)胞類似，不同的CDKs/Cyclins 復(fù)合體在細(xì)胞周期的不同階段推動(dòng)細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)，其中Cyclins 為調(diào)節(jié)因子，分子量為45～60 Ku。植物Cyclins具有多樣性，目前至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4種Cyclins（A、B、D、H）。植物中亦存在廣泛的CDKs家族，目前已在苜蓿、水稻、擬南芥、豌豆以及玉米等多種植物中發(fā)現(xiàn)了編碼CDKs 的基因[24]。通過對(duì)苜蓿、煙草及擬南芥等植物的研究表明，植物中至少存在4 種不同的CDKs：最典型的一種CDK 包含PSTAIRE 序列，在G1/S 及G2/M 期轉(zhuǎn)換中具有重要作用；另外一種CDK 是植物特有的，具有PPTALRE 序列，其活性水平在G2 晚期及M 期達(dá)到峰值，這種CDKs 與植物有絲分裂特性有關(guān)[2，24]。逆境脅迫條件下，細(xì)胞中不同種類的DNA 損傷激活細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)，抑制CDKs/Cyclins 復(fù)合體的活性，從而引起不同種類的細(xì)胞周期阻滯[1-2，7，24]。

ATR 和ATM 下游的很多蛋白激酶可以在檢驗(yàn)點(diǎn)信號(hào)傳導(dǎo)過程中調(diào)控細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)。盡管不同物種間感知DNA 損傷的機(jī)制是保守的，但是植物缺乏與哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)信號(hào)途徑中某些同源的基因，如p53和Chk1/2激酶[4]。但是，植物會(huì)利用一些特殊的蛋白酶響應(yīng)DDR 信號(hào)，從而阻滯細(xì)胞周期，如SOG1（γ 射 線 反 應(yīng) 抑 制 劑1，Suppressor of gamma response1）被作為是植物中p53 的對(duì)應(yīng)組分[25-26]。目前，SOG1 調(diào)控G2/M 期阻滯的詳細(xì)機(jī)理仍然不清楚，但是SOG1 是以依賴ATM 的方式，通過靶向CDK的抑制劑，抑制CDKA；1 的活性，從而促進(jìn)細(xì)胞周期從G1/S期到M 期的運(yùn)轉(zhuǎn)[4，25-26]。另外一種組分是存在于動(dòng)/植物細(xì)胞中的WEE1 蛋白激酶，其優(yōu)先被ATR激活，降低CDK 活性（如植物特有的CDKB1；1），從而導(dǎo)致G2/M期的阻滯[1-2，7，27]。

在Cd 誘導(dǎo)的DDR 中，G2/M 期阻滯存在于動(dòng)/植物細(xì)胞中，有利于維持基因組DNA 的穩(wěn)定性和完整性[1-2]。例如，植物細(xì)胞中G1/S 或G2/M 期細(xì)胞阻滯的調(diào)控主要依賴于DNA MMR 系統(tǒng)中的MutS 識(shí)別DNA損傷，依次激活A(yù)TR，從而抑制B-type CDK（CDKB1；1）[2]。我們?cè)贑d 脅迫下擬南芥/大豆MSH2-KO 和MSH6-KO幼苗的實(shí)驗(yàn)中，亦得到相似的結(jié)果；而且大豆耐Cd 品種CN20 可以將G2/M 阻滯轉(zhuǎn)化為G1/S 阻滯[1，7，27]。

1.3.2 Cd脅迫誘導(dǎo)的植物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和細(xì)胞死亡

Xu 等[28]報(bào)道，嚴(yán)重DNA 脅迫條件下，為了減輕DNA 損傷累積的風(fēng)險(xiǎn)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡（PCD），以清除嚴(yán)重受損傷的細(xì)胞，這是生物生存的一種適應(yīng)反應(yīng)機(jī)制。類似PCD 的情況亦存在于植物的分生組織細(xì)胞中[4]。但是，動(dòng)物和植物所利用的PCD 機(jī)制不同：動(dòng)物通過p53 磷酸化激活PCD信號(hào)；植物是利用SOG1 激活PCD 信號(hào)通路，因?yàn)橹参镏腥狈53 蛋白。例如，離子輻射和/或DSB 藥物處理后，植物SOG1-KO 不能誘導(dǎo)依賴ATM 磷酸化SOG1 的PCD 信號(hào)，明顯增加了死亡細(xì)胞的比例[29]。Sherrer 等[30]研究證實(shí)，Cd 在細(xì)胞內(nèi)的主要靶位點(diǎn)為DNA MMR 系統(tǒng)。Cd 脅迫下，隨著動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)DNA損傷的增加，MSH2參與招募DNA 雙鏈斷裂修復(fù)蛋白和HR；嚴(yán)重的DNA 損傷則減弱DDR，如降低DNA MMR 系統(tǒng)中關(guān)鍵基因（如MSH2、MSH3、MSH6）的修復(fù)能力和DNA MMR 系統(tǒng)對(duì)HR 的招募能力等，從而產(chǎn)生PCD[31]。

如果哺乳動(dòng)物或人細(xì)胞中一旦出現(xiàn)有絲分裂異常和細(xì)胞內(nèi)復(fù)制現(xiàn)象，則表明嚴(yán)重的疾病災(zāi)難（如癌癥）即將發(fā)生；而植物細(xì)胞出現(xiàn)DNA 脅迫時(shí)，則誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和細(xì)胞凋亡[4]。植物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制是DNA 脅迫的顯著標(biāo)記之一，而且亦偶爾存在于植物正常生長和發(fā)育的細(xì)胞中。很多研究表明，DNA DSBs 是刺激植物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的主要影響因素[7，23]。與誘導(dǎo)細(xì)胞死亡不同，ATM 和ATR 在調(diào)控植物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制方面起到多信號(hào)同步作用，即ATMSOG1 和ATR-SOG1 信號(hào)負(fù)責(zé)激活植物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。例如，在博來霉素脅迫下，ATM/ATR-KO（雙突變體）植株幼苗細(xì)胞的DNA 損傷水平增加，內(nèi)復(fù)制明顯受到抑制；植物SOG1-KO 幼苗細(xì)胞中DSBs水平明顯增加，亦出現(xiàn)類似的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制現(xiàn)象[23]。但是，在Cd 脅迫下，擬南芥MSH2–KO 和MSH6–KO 幼苗中，ATMSOG1信號(hào)途徑在激活細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程中起到明顯的關(guān)鍵作用，不存在ATR-SOG1 信號(hào)途徑，因?yàn)槿笔腗MR 到ATR 的信號(hào)瀑布[7，32]。另外，在土豆MSH2-KO幼苗中，觀察到明顯的多倍體或非整倍體細(xì)胞，說明DNA MMR 系統(tǒng)在阻止細(xì)胞內(nèi)復(fù)制方面具有關(guān)鍵的促進(jìn)作用[32]。

1.3.3 Cd脅迫下HR和DNA MMR系統(tǒng)的激活

DNA 修復(fù)系統(tǒng)在感知DNA 損傷、激活細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)、修復(fù)不同種類的DNA 損傷、維持基因組DNA的穩(wěn)定性和保證DNA 復(fù)制的精確性等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。DNA修復(fù)系統(tǒng)主要包括6類[1-8]。通常情況下，上述DNA 修復(fù)系統(tǒng)借助于組蛋白修飾和依賴于ATR/ATM 信號(hào)途徑，參與DDR 信號(hào)[33-34]。盡管不同種類的DNA 損傷對(duì)應(yīng)于不同的DNA 修復(fù)系統(tǒng)，但是DDR 信號(hào)通路中不同修復(fù)系統(tǒng)之間亦存在相互作用。例如，早在1970 年即發(fā)現(xiàn)，NER 和HR 參與ICL修復(fù)過程；DNA MMR 系統(tǒng)招募HR 相關(guān)蛋白，盡管有關(guān)詳細(xì)機(jī)制不甚清楚[14，35]。

由于激活不同種類的DNA 損傷修復(fù)蛋白依賴于細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)或DDR 信號(hào)通路，因此不同蛋白激酶會(huì)被選擇性地招募于DNA 損傷位點(diǎn)。例如，正常條件下，NER 在整個(gè)細(xì)胞間期發(fā)揮作用，而且在G0～G1 期和G2～M 期檢驗(yàn)點(diǎn)出現(xiàn)兩個(gè)活性高峰；紫外線誘導(dǎo)的DNA 損傷，僅在S 期以依賴于ATR 的方式激活NER[36-37]。但是，在g射線脅迫下，NER的活性高峰在G0～G1期檢驗(yàn)點(diǎn)顯著增加，而在G2～M 期檢驗(yàn)點(diǎn)則降低[38]。類似情況亦存在于HR 和NHEJ 過程中，HR 主要在姊妹染色單體完成復(fù)制的G2 期和S 期發(fā)揮作用；而在G1 期，NHEJ 的作用明顯大于HR[39-40]。與HR 的作用類似，DNA MMR 系統(tǒng)亦在G2 期發(fā)揮作用，通過MutS 識(shí)別不同種類的DNA 損傷，引起G2/M期阻滯[1-2，7]。因此，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果建議，由Cd 誘導(dǎo)的DNA損傷主要被DNA MMR系統(tǒng)和HR修復(fù)。

2 植物DNA MMR 系統(tǒng)在Cd 誘導(dǎo)DDR 信號(hào)通路中的多重功能

2.1 DNA MMR系統(tǒng)的主要作用

DNA MMR 系統(tǒng)是一種DNA 復(fù)制后修復(fù)，在感知DNA 損傷、激活細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)、確?；蚪MDNA 的穩(wěn)定性和DNA 復(fù)制的精確性，以及修復(fù)Cd 誘導(dǎo)的DNA 損傷等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且MSH2參與招募DNA 雙 鏈 斷 裂 修 復(fù) 蛋 白[1-2，7，41]。Culligan 等[42]首 次 報(bào)道了關(guān)于植物DNA MMR 家族方面的研究工作。植物DNA MMR 家族為MutS-MutL 系統(tǒng)，其中與DNA MMR 反 應(yīng) 有 關(guān) 的MutS 同 系 物（MutS homologues，MSH）為MSH2、MSH3、MSH6 和MSH7，MutL 同系物（MutL homologues，MLH）為MLH1、MLH3 和PMS1。植物DNA MMR 家族中，3 個(gè)異源二聚體MutSα（MSH2 / MSH6）、MutSβ（MSH2 / MSH3）和MutSγ（MSH2/MSH7）具有識(shí)別不同種類DNA 損傷，并結(jié)合在DNA 鏈接上招募MutL 和激活檢測(cè)點(diǎn)的作用；MutL合體由兩個(gè)異源二聚體MutLα（MLH1/PMS1）和MutLβ（MLH1/MLH3）組成，正常情況下MutLα 的功能 明 顯 大 于MutLβ[2，9，42-43]。異 源 二 聚 體MutLα 和MutLβ 與結(jié)合在DNA 鏈上的MutSα、MutSβ 或MutSγ形成臨時(shí)復(fù)合體，并與有關(guān)酶相互作用，從而啟動(dòng)DNA MMR 反應(yīng)；MutSα-MutLα 復(fù)合體征募ATR-AT?RIP/ATM 到DNA損傷位點(diǎn)，啟動(dòng)DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂進(jìn)程，最終完成修復(fù)含錯(cuò)配堿基的DNA序列[1-2，9，30，42-43]。

DNA 錯(cuò)配被識(shí)別后，異源二聚MutLα 與結(jié)合在DNA 鏈上的MutSα、MutSβ 或MutSγ 形成臨時(shí)復(fù)合體；DNA 夾鉗（Clamp）PCNA 與RFC 結(jié)合后，與MutLα相互作用，從而發(fā)揮PMS1 的內(nèi)切酶活性；通過切割不連續(xù)鏈，MutLα 為EXO1 5′-3′外切酶產(chǎn)生新的進(jìn)入位點(diǎn)，此過程對(duì)3′-末端參與的錯(cuò)配剪切是必需的，并被PCNA–RFC 促進(jìn)[1-2，9，43]。然而，在5′-末端，PCNA-RFC 參與剪切的作用非常有限[2，44-45]。因?yàn)镻CNA 僅參與DNA 復(fù)制機(jī)制的一部分，DNA MMR 識(shí)別與DNA 復(fù)制偶聯(lián)僅占DNA MMR 功能的10%～15%，或者二者之間毫無關(guān)系[46]。切除DNA 錯(cuò)配堿基可以由依賴EXO1 的機(jī)制完成，亦可能二者之間沒有相 關(guān) 性[47]。FEN1 內(nèi) 切/PMS1 內(nèi) 切/EXO1 外 切DNA 錯(cuò)配堿基后，RPA 結(jié)合/保護(hù)ssDNA，并且促進(jìn)外切作用的結(jié)束；最后，DNA 聚合酶d 合成新的DNA 片段填補(bǔ)被切除的堿基，DNA 連接酶Ⅰ連接新合成的DNA 鏈，從而完成修復(fù)含錯(cuò)配堿基的DNA序列[2，7，30]。

2.2 DNA MMR系統(tǒng)招募和促進(jìn)HR修復(fù)

HR修復(fù)在有絲分裂和減數(shù)分裂同源染色體的配對(duì)和分離過程中具有切除DSBs 的重要作用。Mimi?tou 等[48]報(bào)道，HR 依賴同源配對(duì)的姊妹染色單體，可以修復(fù)有絲分裂過程中的斷裂染色體。HR在SSR修復(fù)和恢復(fù)停止/損傷DNA的復(fù)制叉過程中亦具有重要作用。HR 啟動(dòng)核苷酸水解產(chǎn)生DSBs 的3′ssDNA 片段，此反應(yīng)由參與DNA MMR 系統(tǒng)的MRE11 或EXO1完成[48]。外切酶切除后，ssDNA 與RPA 形成復(fù)合體，依賴輔助因子取代RAD51，形成的RAD51 核蛋白細(xì)絲有助于DNA 片段的侵入和交換，最終形成Holliday聯(lián)接體（HJ）[49]。最新研究證實(shí)，HR 過程中，BRCA1與RAD51 結(jié)合（后者是BRCA1 發(fā)揮作用的早期標(biāo)志）后，DNA 雙鏈斷裂修復(fù)（DNA double-strand break repair，DSBR）和依賴于DNA 合成鏈退火（Synthesisdependent strand annealing，SDSA）修復(fù)途徑迅速執(zhí)行功能，但是其反應(yīng)產(chǎn)物不同[39]。在SDSA 模型中，經(jīng)過DNA 片段的置換，單鏈延伸，并退火到另一斷裂鏈末端的ssDNA，然后進(jìn)行缺口處的DNA 合成和連接，從而產(chǎn)生非交叉鏈（Non-crossover）產(chǎn)物。在DSBR模型中，由供體雙螺旋（D-環(huán)）作為DNA 置換鏈，結(jié)合于DSB 的另一端后，引發(fā)前導(dǎo)鏈的第二輪DNA 合成，并進(jìn)一步形成一個(gè)雙鏈HJ（dHJ）中間體，最后dHJ 降解產(chǎn)生交叉鏈產(chǎn)物，或者非交叉鏈產(chǎn)物[48]。

在Cd 誘導(dǎo)的植物DDR 信號(hào)傳導(dǎo)過程中，識(shí)別DNA 損 傷 后，MutS 異 源 二 聚 體（MutSα、MutSβ 和MutSγ）中的MSH2 不僅招募MutLα、PCNA 和EXO1，而且招集ATR/ATM 和BRCA1，共同進(jìn)行DNA MMR、DSBs 或者ICLs 修復(fù)[35]。盡管HR 過程中MSH2 招募的詳細(xì)機(jī)制不清楚，但是卻發(fā)現(xiàn)：（1）HR修復(fù)的SDSA途徑與MMR 同樣發(fā)生于減數(shù)分裂期G2 期，在HR 修復(fù)中優(yōu)先發(fā)揮作用，通過ATR 促進(jìn)基因轉(zhuǎn)換，從而產(chǎn)生非交叉鏈產(chǎn)物，即不需要形成HJ；（2）HR 修復(fù)的DSBR 途徑會(huì)形成dHJ，并可產(chǎn)生交叉鏈產(chǎn)物，使與DNA 復(fù)制相關(guān)的DNA 損傷被HR 修復(fù)；（3）在兩條單鏈DNA 片段退火中，MSH2 抑制同源二聚體HJ 的形成，且招募SGS1[50-51]。這些結(jié)果說明，在HR 過程中，DNA MMR 系統(tǒng)在G2 期阻滯中以依賴ATR 的方式優(yōu)先激活SDSA 途徑，在此過程中由于MSH2 抑制同源重組，所以MLH1不會(huì)與MLH3形成MutLβ、不參與交叉鏈的形成，MLH1 主要與PMS1 結(jié)合形成MutLα，參與DNA MMR過程[2，52-54]。

2.3 MLH1以依賴于ATM的方式參與MAPK信號(hào)

Kim 等[55]報(bào)道，在DDR 信號(hào)通路中，與MSH2 迅速被激活不同，MLH1 以依賴于c-Abl 的方式在HR、DNA MMR 系統(tǒng)和ATM 參與的MAPK 信號(hào)瀑布中均發(fā)揮重要作用。脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生DNA 損傷后，盡管ATM 和ATR 均有活性，但是ATM（不是ATR）快速激活來源于c-Abl 活化的MAPK 信號(hào)通路[56-57]。MLH1 參與上述調(diào)控過程，特別是在脅迫激活蛋白激酶/Jun-N 末端蛋白激酶（JNKs）依賴的MAPK 信號(hào)途徑中發(fā)揮重要作用，此結(jié)果在人MLH1-KO 細(xì)胞系響應(yīng)N-甲基-N′硝基-N′-亞硝基胍（MNNG）脅迫過程中亦得到了證實(shí)[55]。Mao 等[58]研究證實(shí)，在人體外/內(nèi)細(xì)胞系的HR 和MAPK 信號(hào)通路中，MLH1 和miR-422a 形成反饋循環(huán)，表明MutLα 可以刺激miRNAs 的生物合成。我們的研究結(jié)果表明，擬南芥/大豆MLH1-KO 幼苗在響應(yīng)Cd 脅迫誘導(dǎo)的DDR 過程中，MLH1 參與了依賴于ATM 的信號(hào)通路[1-2，7]。Cd 脅迫下，DNA MMR 系統(tǒng)功能正常的植株細(xì)胞將被阻滯在G2/M期，但是植株MSH2-KO細(xì)胞則被阻滯在依賴于ATM 的G1/S 期；在 植 株MSH2-KO/MLH1-KO 細(xì) 胞中，依賴于ATM 的G1/S 期阻滯則明顯降低，表明在動(dòng)/植物細(xì)胞響應(yīng)Cd 誘導(dǎo)的DDR 過程中，MLH1 參與了依賴于ATM 的MAPK 信號(hào)通路[2，7]。因此，MLH1作為多功能蛋白，具有如下重要作用：（1）MLH1 與PMS1結(jié)合形成MutLα，修復(fù)DNA 損傷；（2）當(dāng)MutS 繞過DNA 損傷識(shí)別時(shí)，MLH1 參與ATM 激活的MAPK信號(hào)傳導(dǎo)；（3）MutLα參與miRNAs的生物合成；（4）在DNA 損傷不存在的條件下，MLH1 與MSH3 結(jié)合，參與減數(shù)/有絲分裂M期的同源重組過程[2，58]。

3 DDR 信號(hào)通路中表觀遺傳對(duì)DNA MMR 系統(tǒng)的調(diào)控作用

表觀遺傳是指在基因組DNA 序列不變的情況下基因表達(dá)發(fā)生變化的現(xiàn)象。表觀遺傳參與植物的生長、發(fā)育、代謝、衰老、死亡、脅迫響應(yīng)等重要生命過程，并在其中發(fā)揮了重要作用。表觀遺傳學(xué)作為一門新興學(xué)科在近20 年間得到了快速發(fā)展，成為當(dāng)前植物、動(dòng)物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[59]。目前，植物表觀遺傳學(xué)的相關(guān)研究主要集中在模式植物擬南芥和主要作物（如水稻、玉米、小麥）的DNA 甲基化、組蛋白修飾、RNA 甲基化、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA 修飾等方面，并且取得了許多重要成果。傳統(tǒng)遺傳學(xué)產(chǎn)生的遺傳變異是穩(wěn)定的，很少逆轉(zhuǎn)，而表觀遺傳現(xiàn)象與環(huán)境條件變化之間密切相關(guān)，表觀遺傳變異通常是可逆轉(zhuǎn)的。因此，表觀遺傳現(xiàn)象具有以下特點(diǎn)：DNA序列未發(fā)生改變；具有跨代遺傳特性；對(duì)表型調(diào)控具有可逆性[59]。

3.1 DNA甲基化

DNA 甲基化主要發(fā)生于二核苷酸CpG 位點(diǎn)，由DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶（Dnmts）家族催化S-腺苷蛋氨酸（SAM）上的一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶（C）的第5 位碳原子上形成5mC[59]。DNA 甲基化是在DNA 水平上調(diào)控基因表達(dá)的表觀修飾方式之一，主要是通過阻止轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于DNA 鏈上發(fā)揮作用。DNA 甲基化水平會(huì)改變基因表達(dá)，從而影響DNA 修復(fù)、細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和脅迫響應(yīng)[60-65]。M?ki-Nevala 等[66]報(bào)道，基因啟動(dòng)子區(qū)域中CpG 島（CpG 含量大于50%的區(qū)域）很容易被甲基化，從而導(dǎo)致基因表達(dá)的沉默。研究發(fā)現(xiàn)，人結(jié)腸直腸癌（CRC）DNA MMR 系統(tǒng)中，hMSH2/hMLH1 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島超甲基化（Hyper-methylation）可抑制hMSH2h/hMLH1基因的功能，而且hMSH2h/hMLH1 基因表達(dá)降低與其啟動(dòng)子區(qū)高甲基化水平密切相關(guān)[66-67]。Leong 等[67]報(bào)道，人散發(fā)性腫瘤中DNA MMR 功能失活是由hMLH1 基因啟動(dòng)子部位的甲基化引起的。Loktionov等[68]研究證明，人hMLHl啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是指示CRC形成的表觀遺傳生物標(biāo)記物（Epigenetic biomarker）。近年來，很多研究表明，CpG 甲基化亦是人CRC 和胃癌的分子生物標(biāo)記物[69-71]。而且，人結(jié)腸癌細(xì)胞DNA損傷后，MutSα 可以招募DNMT1，從而在CpG 島高甲基化誘導(dǎo)hMLH1 基因功能失活過程中起到促進(jìn)作用[72-73]。有關(guān)植物基因組CpG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)以及甲基化多態(tài)性研究，主要集中在植物甲基化狀態(tài)如何調(diào)控植物的生長發(fā)育或逆境脅迫與基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性[2，60-65，74-76]。例如，逆境脅迫下，植物體內(nèi)脅迫反應(yīng)基因表達(dá)上調(diào)與基因組甲基化水平密切相關(guān)[76]。Cd 脅迫誘導(dǎo)擬南芥幼苗細(xì)胞內(nèi)DNA 甲基化水平明顯上升[65]。但是，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cd 脅迫下，擬南芥DNA MMR 系統(tǒng)中MSH2 和MLH1 基因啟動(dòng)子部位的CpG 甲基化水平?jīng)]有顯著改變[2]。正常情況下，植物MSH2 和MLH1 基因啟動(dòng)子部位的CpG 甲基化含量明顯高于動(dòng)物和人體[2]。因此，Cd 脅迫下，DDR 信號(hào)通路中植物DNA CpG 甲基化狀態(tài)對(duì)DNA MMR系統(tǒng)中關(guān)鍵基因表達(dá)的調(diào)控作用不明顯。

3.2 組蛋白修飾

染色質(zhì)是由DNA、RNA 和蛋白質(zhì)組成的核蛋白復(fù)合體，在有絲分裂過程中，染色質(zhì)有利于DNA 執(zhí)行功能，并調(diào)控DNA復(fù)制、基因表達(dá)和保護(hù)DNA避免受到傷害。組蛋白是染色質(zhì)的基本組分，由兩個(gè)拷貝H2A、H2B、H3 和H4 形成的8 聚體。每個(gè)組蛋白8 聚體由147 bp 的DNA 片段組裝為核小體，而且染色質(zhì)中的組蛋白與DNA 含量比為1∶1。組蛋白上的氨基酸殘基可以發(fā)生很多共價(jià)修飾，進(jìn)而改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)型，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄激活或沉默。常見氨基酸殘基的修飾種類包括組蛋白乙?；?去乙?；⒓谆?去甲基化、泛素化/去泛素化和磷酸化/去磷酸化[2，59]。正常情況下，組蛋白H3 第4 位與第36 位賴氨酸二或三甲基化（H3K4me2、H3K4me3、H3K36me2、H3K36me3）、H3和H4 的乙?；腔钴S的甲基化轉(zhuǎn)錄信號(hào)組分，而H3K9me3和H3K27me3則是不活躍的甲基化狀態(tài)，這些被修飾的H3 亦與DNA 損傷水平和DNA 修復(fù)功能密切相關(guān)[77]。例如，DNA DSBs 可以誘導(dǎo)染色質(zhì)組分中的組蛋白H2AX 磷酸化（g-H2AX），而組蛋白乙?；梢哉{(diào)控DSBs 修復(fù)，因?yàn)橐蕾囉谝阴；慕M蛋白參與DSBs 損傷識(shí)別，而組蛋白脫乙?；福℉DAC）則參與DSBs 損傷信號(hào)傳導(dǎo)。因此，這些組蛋白修飾在NHEJ和HR修復(fù)途徑中具有重要作用[33，78]。

H3K36 甲基化可以改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象和一系列生理生化過程，特別在DNA MMR 系統(tǒng)中亦發(fā)揮重要作用。例如，小鼠胚胎Dnmt1-KO 干細(xì)胞中，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）顯著增加，表明DNA 甲基化參與了小鼠DNA MMR 過程[79]。人Dnmt1-KO 細(xì)胞中組蛋白H3甲基化后，改變了染色質(zhì)的構(gòu)象，導(dǎo)致MutL的多種功能顯著減弱，盡管DNA MMR 關(guān)鍵基因啟動(dòng)子部位CpG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)沒有變化[78，80]。近年來，Li等[81-82]研究表明，人細(xì)胞DNA 損傷后，H3K36me3 招募MutSα，與MSH6 蛋白的PWWP 域相互作用，改變了MutSα 的構(gòu)象，從而影響DNA 損傷反應(yīng)的識(shí)別信號(hào)，誘導(dǎo)MSI 增加，但是其DNA MMR 系統(tǒng)中關(guān)鍵基因的表達(dá)沒有明顯變化。人組蛋白H3K36附近的H3第34 位甘氨酸（H3G34）突變同樣可以抑制DNA MMR 功能，增加MSI，從而誘發(fā)癌癥的形成[83]。因此，人H3K36me3在維持正常DNA MMR系統(tǒng)功能方面是一種重要的組蛋白修飾。但是，有關(guān)植物組蛋白甲基化修飾在調(diào)控DNA MMR 系統(tǒng)中的作用，目前尚未見報(bào)道。

3.3 miRNA對(duì)植物DNA MMR系統(tǒng)的調(diào)控作用

后基因組時(shí)代的開啟，為研究者們打開了探索新知識(shí)的大門。盡管非編碼RNAs（ncRNAs），如miRNAs、長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNAs，lncRNAs）和環(huán)狀RNA 等不編碼蛋白，但可以直接在RNA 水平發(fā)揮功能[59]。其中miRNAs 是一類約有22 個(gè)核苷酸（nt）的內(nèi)源性、非編碼單鏈小RNA，通過和靶基因mRNA 上的一些特定序列結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因mRNA 被剪切或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)細(xì)胞內(nèi)的DDR、DNA 修復(fù)途徑、細(xì)胞的分化/增殖和凋亡等多種代謝過程發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[84]。DNA 損傷誘導(dǎo)小RNA 的大量產(chǎn)生，并積累于DSB 位點(diǎn)附近。這些小RNA 參與DNA 修復(fù)途徑的選擇和DNA 修復(fù)信號(hào)傳導(dǎo)通路，但是不參與DNA 損傷的識(shí)別[85-86]。最新研究證實(shí)，人癌癥細(xì)胞中，靶向DNA MMR 基因的miRNAs調(diào)控DNA MMR 關(guān)鍵基因的表達(dá)，亦影響MSI[87-90]。例如，Bobowicz 等[87]報(bào)道，與人DNA MMR 功能缺失的結(jié)腸癌T2-T3N0 細(xì)胞系相比，DNA MMR 功能正常細(xì)胞系中miR592 的表達(dá)增加了11.9 倍。人CRC 細(xì)胞系中，miR21 過表達(dá)會(huì)明顯降低MSH2 和MSH6 蛋白的表達(dá)；然而，miR21 表達(dá)降低則明顯增加此二種蛋白的表達(dá)[88]。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果表明，miR155 可以靶向人CRC 細(xì)胞系中MLH1、hMSH2 和hMSH6 基因mRNAs 的3′UTR 區(qū)域，從而降低其相應(yīng)編碼蛋白的表達(dá)[89]。同樣，人CRC 腫瘤活組織檢查結(jié)果表明，miR-155過表達(dá)與MSH2和MLH1蛋白表達(dá)降低之間呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系[89]。上述結(jié)果表明，DNA MMR 功能缺失的人CRC 腫瘤細(xì)胞中，DNA MMR 基因與miRNAs 之間的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制被嚴(yán)重干擾，從而導(dǎo)致DNA MMR 系統(tǒng)中關(guān)鍵基因的異常表達(dá)[17，90]。Mao 等[58]研究證實(shí)，在人體外/內(nèi)細(xì)胞系中，miR-422a結(jié)合于MLH1 3′端非編碼區(qū)，從而抑制MLH1 的表達(dá)；而且，MLH1 和miR-422a 形成反饋循環(huán)（Feed?back loop），可以刺激某些miRNAs的生物合成。近年來有多位學(xué)者認(rèn)為，miRNAs 可以作為反式激活元件（Trans-activating elements），從而調(diào)控等位基因和基因的表達(dá)[91]。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，miRNAs 在非孟德爾（Non-Mendelian）調(diào)控DNA MMR 基因表達(dá)過程中具有重要作用。

近年來，全基因組表達(dá)結(jié)果表明，植物miRNAs通過和靶基因mRNA上的一些特定序列結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因mRNA降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控植物的生長、發(fā)育和逆境響應(yīng)信號(hào)系統(tǒng)[92]。例如，miRNAs不僅在植物的時(shí)序轉(zhuǎn)換、花器官發(fā)育、土豆塊莖形成和豆科結(jié)瘤中具有關(guān)鍵調(diào)控作用，而且也參與多種植物（如擬南芥、小麥、大麥、水稻等）對(duì)生物脅迫和非生物脅迫（如微生物浸染，重金屬Cd、鉻、砷，缺硫、氮、磷，干旱和鹽堿等）的響應(yīng)過程[93-99]。不同植物中，參與生物/非生物脅迫的保守和非保守miRNAs包括：miR156a-f/h、miR166、miR167c-d、miR170、miR171b - c、miR172a / b-5p / c、miR395、miR397、miR472-5p、miR846-3p/5p、miR5651、miR5995b 和miR8182[76，100]。更為重要的是，逆境脅迫發(fā)生時(shí)，一些miRNAs 會(huì)表達(dá)上調(diào)，而另一些miRNAs 則表達(dá)下調(diào)。miRNAs正是通過下調(diào)脅迫應(yīng)答過程中的負(fù)調(diào)節(jié)子靶基因或者上調(diào)脅迫應(yīng)答過程中的正調(diào)節(jié)子靶基因，以減弱脅迫引起的毒性效應(yīng)，從而發(fā)揮miRNAs重要的生理調(diào)控作用[2，51，76，92，100]。另外，F(xiàn)u等[92]從油菜中分離到一系列miRNAs，并且驗(yàn)證了根系中有22 個(gè)miRNAs、地上部有29 個(gè)miRNAs 響應(yīng)Cd 脅迫。miR?NAs 調(diào)控水稻耐Cd 研究亦有其他報(bào)道[100-103]。探討miRNAs及其靶向基因可以深入了解植物響應(yīng)重金屬脅迫的調(diào)控機(jī)理[103]。在生態(tài)毒理學(xué)研究領(lǐng)域中，擬南芥細(xì)胞中靶向DNA MMR 系統(tǒng)關(guān)鍵基因（如MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、MSH7 和PMS1）的miRNAs 鑒定及其在Cd 脅迫下調(diào)控DNA MMR 系統(tǒng)、脅迫響應(yīng)系統(tǒng)、DNA 損傷和細(xì)胞周期G1/S 或G2/M 期阻滯的機(jī)制研究，目前國內(nèi)外報(bào)道尚少。然而，本科題組利用miRNAs 測(cè)序和生物信息分析，篩選出了靶向擬南芥DNA MMR 系統(tǒng)中關(guān)鍵基因（如MSH2、MSH3、MSH6、MSH7、MLH1和PMS1）的miRNAs；利用煙草雙螢火素酶報(bào)告系統(tǒng)，驗(yàn)證了3 個(gè)miRNAs（miRNA172b-5p，miRNA172e-5p 和miRNA472-3p）靶向MSH6，并且響應(yīng)Cd 脅迫[3]。這些結(jié)果表明，miRNAs 對(duì)Cd 脅迫下植物DNA MMR基因具有關(guān)鍵調(diào)控作用。

3.4 lncRNAs對(duì)植物DNA MMR系統(tǒng)的調(diào)控作用

lncRNAs 是一類長度超過200 nt 的非蛋白編碼RNA，大多數(shù)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。lncRNAs可分為正義lncRNAs、反義lncRNAs、雙向lncRNAs、基因內(nèi)lncRNAs 和基因間lncRNAs 5 種主要類型[104]。lncRNAs 能利用其一級(jí)核苷酸序列或高級(jí)結(jié)構(gòu)來結(jié)合DNA、RNA 以及蛋白質(zhì)，并參與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，其具體機(jī)制包括基因印記、順式（Cis）調(diào)節(jié)、染色質(zhì)重塑及剪切調(diào)控等[105-106]。例如，lncRNAs 可以通過Cis 調(diào)節(jié)方式參與基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。Cis 調(diào)控作用是指lncRNAs 對(duì)調(diào)節(jié)序列與被調(diào)節(jié)的編碼序列位于同一條DNA 鏈上的編碼蛋白基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。而反義lncRNAs 與鄰近蛋白基因在基因組上以頭對(duì)頭的方式反向排列和轉(zhuǎn)錄，由于其具有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元或轉(zhuǎn)錄區(qū)與蛋白編碼基因存在重疊，在轉(zhuǎn)錄后甚至是轉(zhuǎn)錄過程中并不需要轉(zhuǎn)運(yùn)或再處理，可以通過Cis 調(diào)節(jié)鄰近基因的表達(dá)[105]。因此，反義lncRNAs 可以通過對(duì)序列位于同一條DNA鏈上的鄰近編碼基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，即Cis調(diào)控方式，參與一系列細(xì)胞核內(nèi)基因水平的生物學(xué)過程[106]。

目前，在擬南芥、小麥、玉米、高粱和楊樹等植物中，很多l(xiāng)ncRNAs 已經(jīng)被篩選出來，它們的表達(dá)具有組織和脅迫特異性[107-114]。植物lncRNAs 亦可以與DNA、RNA 以及蛋白質(zhì)相互作用，并且在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中具有調(diào)控功能。在細(xì)胞核中，lncRNAs 可以通過順/反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用改變基因的表達(dá)，或者類似于組蛋白或者可變剪切作用，調(diào)控蛋白質(zhì)代謝[104，115-116]；在細(xì)胞質(zhì)中，lncRNAs 參與形成蛋白復(fù)合體、抑制miRNAs 參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，從而影響靶向mRNA 的穩(wěn)定性以及降解和翻譯過程[117-118]。目前，盡管調(diào)控植物DNA MMR 系統(tǒng)的lncRNAs 尚沒有報(bào)道，但是參與DNA 修復(fù)（如HR 和NHEJ）、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的某些lncRNAs 已經(jīng)被篩選出來[119-120]。lncRNAs 具有調(diào)控植物DNA MMR 系統(tǒng)的潛在可能性，可能不久的將來會(huì)有科學(xué)報(bào)道[2]。

4 結(jié)論

植物DNA MMR 系統(tǒng)在修復(fù)Cd 誘導(dǎo)的DNA 損傷方面發(fā)揮重要作用。Cd 脅迫下，植物基因組DNA 不穩(wěn)定性明顯增加，導(dǎo)致DNA 復(fù)制過程中復(fù)制滑移和堿基錯(cuò)配頻次增加；另外，DNA 損傷通過跨DNA 損傷（Translesion）復(fù)制途徑導(dǎo)致DNA 錯(cuò)配損傷明顯增多。DNA 錯(cuò)配損傷主要在G2 期被MutS（如MSH2、MSH3、MSH6、MSH7）識(shí)別，從而激活DNA MMR 系統(tǒng)；然后MSH2 繼續(xù)激活A(yù)TR/ATM，從而誘導(dǎo)DDR 信號(hào)系統(tǒng)，包括招募其他DNA 修復(fù)系統(tǒng)（如HR、NHEJ）等有關(guān)酶，參與依賴于ATM 的MAPK 信號(hào)傳遞，識(shí)別/修復(fù)DNA 損傷，調(diào)控細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)、內(nèi)復(fù)制和程序性細(xì)胞死亡。在植物MutS 功能正常情況下，Cd 誘導(dǎo)的DNA 損傷激活A(yù)TR 后，MutS 引起G2/M 期阻滯，降低細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，增加DNA MMR 和HR 無差錯(cuò)修復(fù)活性，以及顯著降低程序性細(xì)胞死亡的可能性，從而增強(qiáng)植物對(duì)Cd 脅迫的耐性。然而，MSH2、MSH3、MSH6、MSH7 缺失的植株將會(huì)繞過（Override）DNA MMR 系統(tǒng)參與的DDR 響應(yīng)，釋放出MLH1，從而導(dǎo)致植株對(duì)Cd 脅迫的微弱耐性。因此，在不改變植物細(xì)胞內(nèi)DNA MMR 基因DNA 序列的前提下，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平，即調(diào)控ncRNAs（miRNAs、lncRNAs 等），分別構(gòu)建植物DNA MMR 系統(tǒng)中關(guān)鍵基因（如MSH2、MSH3、MSH6、MSH7、MLH1和PMS1）的ncRNAs敲減/過表達(dá)轉(zhuǎn)基因品系，一方面可以進(jìn)一步明確Cd的毒理機(jī)制；另一方面可以改造DNA MMR 系統(tǒng)中不同基因的轉(zhuǎn)基因品系功能，分別篩選改良性狀良好、對(duì)Cd耐性強(qiáng)的品系，從而獲得具有較高DNA MMR 系統(tǒng)活性、功能以及強(qiáng)耐Cd 性能的轉(zhuǎn)基因品系，從而為早期生物診斷、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)、培育新型、高效的抗逆境植物品種和生物修復(fù)Cd污染土壤提供科學(xué)依據(jù)。