小反芻獸疫病毒芯片式數(shù)字PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

楊鳴發(fā)，馬云云，于志亞，劉家森，康洪濤，姜 騫，曲連東

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/自然疫源性人畜共患病團(tuán)隊(duì)，黑龍江哈爾濱 150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

小反芻獸疫（peste des petits，PPR）是由副黏病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一種急性烈性傳染病，在我國(guó)和許多國(guó)家都有報(bào)道，可導(dǎo)致綿羊和山羊出現(xiàn)急性發(fā)熱、眼鼻分泌物增多、口腔炎癥、腹瀉和肺炎等癥狀[1]。PPRV 基因組全長(zhǎng)為15 948 nt，為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA 病毒，其6 種基因編碼的8 種蛋白分別為N-P（C/V）-M-F-H-L。其中，N 蛋白為病毒核蛋白，是含量最高的編碼蛋白，具有保護(hù)病毒RNA 免受核糖核酸酶I 破壞的功能，與RNA 結(jié)合作為病毒轉(zhuǎn)錄的模板[2]。PPRV于2007 年首次在我國(guó)被發(fā)現(xiàn)[3]。PPRV 宿主范圍廣，可感染包括山羊和綿羊在內(nèi)的多種小反芻動(dòng)物，野生動(dòng)物亦可感染，駱駝和水牛也有被PPRV 感染的報(bào)道[4]。對(duì)于PPR 的診斷方法目前以病毒分離鑒定、中和試驗(yàn)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）為主。前兩種方法所需時(shí)間較長(zhǎng)，不適于PPR 的快速診斷，而RT-qPCR 具有敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短、無(wú)須核酸電泳等優(yōu)點(diǎn)，是傳統(tǒng)PCR不能比擬的。相比于RT-qPCR，芯片式數(shù)字PCR（chip-based digital polymerase chain reaction，cdPCR）在單分子層面上的檢測(cè)為絕對(duì)定量，可以徹底擺脫對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的依賴(lài)而直接給出靶序列的拷貝數(shù)，從而提高了試驗(yàn)結(jié)果在批內(nèi)和批間的穩(wěn)定性，甚至能用來(lái)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)。cdPCR 已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了高通量樣品條件下的自動(dòng)化操作，同時(shí)可以從大量樣品中直接定量核酸，更適合復(fù)雜背景中的突變檢測(cè)和高污染樣品中的核酸定量，從而提高核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度[5-6]。為此，本研究以PPRV-N基因的保守區(qū)域序列為研究對(duì)象，采用cdPCR 技術(shù)進(jìn)行PPRV 檢測(cè)，并通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件及特異性、敏感性、重復(fù)性等一系列試驗(yàn)，初步建立了PPRV cdPCR 檢測(cè)方法。該方法具有高通量、絕對(duì)定量、快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，從而為PPR 的早期診斷、流行病學(xué)調(diào)查和檢驗(yàn)檢疫提供了高效檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

PPRV Nigeria75/1 疫苗株核酸，由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病中心饋贈(zèng)；犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、山羊痘 病 毒（goatpox virus，GTPV）、副流感病毒5 型（parainfluenza virus 5，PIV5）和口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）等核酸，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所（CAAS-HVRI）獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/自然疫源性人畜共患病團(tuán)隊(duì)保存。用于檢測(cè)的綿羊和山羊臨床樣本47 份，儲(chǔ)存時(shí)間為2016—2017年，均由本實(shí)驗(yàn)室滅活處理保存。

QuantStudio?3D 數(shù)字PCR 儀和QuantStudio?3 和5 熒光定量PCR 儀，均購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司。QuantStudio? 3D 數(shù) 字PCR Master Mix，產(chǎn)自Thermo Fisher（美國(guó)）；AxyPrepTM質(zhì)粒提取試劑盒，產(chǎn)自QIAGEN（德國(guó)）；SuperScript III/PlatinumTaqOne-step RT-PCR Kit、MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit 膠回收試劑盒，均購(gòu)自Takara 公司。

1.2 引物和探針

應(yīng) 用MegAlign 軟件對(duì)GenBank 中所有的PPRV 全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，選取N基因中特異性編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)引物和探針。利用Primer Premier 6 對(duì)設(shè)計(jì)的引物（PPRV-N-F：CTCGGAAATCGCCTCACAGAC；PPRV-N-R：CAAATGGGTCCGAAGGAAGG）進(jìn)行分析，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為166 bp，探針序列為FAMCGCCTACACCAGCGACCAGAGAAGAAG-BHQ（探針5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ）。所有引物和探針均由吉林庫(kù)美生物科技有限公司合成。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品制備與稀釋

采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒添加M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，以上游引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。對(duì)利用PPRV Nigeria 75/1 疫苗毒株設(shè)計(jì)的N基因引物進(jìn)行序列擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期大小為166 bp；使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit，將PCR產(chǎn)物連接至pMDTM18-T 載體，得到重組質(zhì)粒pMDTM18-N。使用分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度。質(zhì)粒濃度計(jì)算公式為

本研究標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為1.22×1012copies/μL，相對(duì)分子質(zhì)量為58 040 g/mol。用ddH2O 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10 倍系列稀釋?zhuān)?1 個(gè)稀釋度（1.22×1012～1.22×102copies/μL），以此構(gòu)建RTqPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 cdPCR 反應(yīng)體系和條件優(yōu)化

在QuantStudio? 3D 數(shù) 字PCR 儀上進(jìn)行cdPCR。配制反應(yīng)混合液體系：3D Digital PCR Master Mix 7.5 μL，上下游引物各1.0 μL，探針1.0 μL，ddH2O 1.5 μL，cDNA 模 板3.0 μL，最終體 積 為15.0 μL。將固態(tài)芯片放在固定器上，吸取配制好的反應(yīng)液均勻滴涂在芯片上，然后將芯片插入加載器上紫外膠連，插入后15 s，取出芯片。將芯片放入QuantStudio 3D Digital PCR Instrument 儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：96 ℃ 10 min；60 ℃ 2 min，98 ℃30 s，39 個(gè)循環(huán)；60 ℃ 2 min，4 ℃ 60 min。擴(kuò)增完成后，利用QuantStudio? 3D AnalysisSuite?軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每個(gè)樣本重復(fù)試驗(yàn)3 次。利用QuantStudio? 3 和5 Real time PCR 儀進(jìn)行RTqPCR。反應(yīng)程序：50 ℃ 10 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 s，60 ℃ 20 s，共40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)總體系 為25.0 μL，其中質(zhì)粒3.0 μL，SuperScript III/PlatinumTaqOne-step RT-PCR reaction mix 12.5 μL，SuperScript III/PlatinumTaqOne-step RT-PCR enzyme mix 0.5 μL，ROX 染料0.5 μL，探針（5 pmol/μL）0.5 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各1.0 μL，無(wú)核酸酶水6.0 μL。每個(gè)樣本重復(fù)試驗(yàn)3 次。

1.5 敏感性試驗(yàn)

為確定檢測(cè)閾值，將制備的PPRV cDNA 標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)作10 倍稀釋?zhuān)?.22×105～1.22×10-3copies/μL 9 個(gè)濃度梯度）進(jìn)行cdPCR 檢測(cè)，并將cdPCR 檢測(cè)方法與RT-qPCR 進(jìn)行比較，每個(gè)稀釋度樣品重復(fù)3 次。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取PPRV cDNA 標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)作10 倍稀釋?zhuān)?.22×104～1.22×100copies/μL 5 個(gè)濃度梯度）進(jìn)行cdPCR 和RT-qPCR 檢測(cè)，分析組間重復(fù)性，不同稀釋度3 次重復(fù)，同時(shí)進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性評(píng)價(jià)。

1.7 特異性試驗(yàn)

利用建立的cdPCR 方法引物分別檢測(cè)CDV、NDV、GTPV、FMDV、PIV5 等病毒 的DNA 或cDNA，以PPRV 標(biāo)準(zhǔn)品1.22×105copies/μL 的cDNA 作為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O 作為陰性對(duì)照，進(jìn)行特異性評(píng)價(jià)。

1.8 臨床樣本檢測(cè)

采集2016—2017 年黑龍江省牧羊場(chǎng)47 份臨床樣本，包括肺、腸、脾、淋巴結(jié)和血液。所有臨床樣本提取組織RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 進(jìn)行PPRV RT-qPCR 和cdPCR 檢測(cè)，記錄陽(yáng)性檢出率，比較兩種方法的檢測(cè)靈敏度。

2 結(jié)果

2.1 引物篩選及標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建

選取PPRVN基因編碼區(qū)序列同源性和保守性較高的區(qū)域設(shè)計(jì)引物。引物序列覆蓋39 株N基因編碼區(qū)核苷酸（上游引物起始位點(diǎn)PPRVN-F：1182～1202；下游引物起始位點(diǎn)PPRV-N-R：1327～1347），與OIE 推薦驗(yàn)證的引物位點(diǎn)相似（圖1）。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，RT-qPCR產(chǎn)物顯示擴(kuò)增片段大小為166 bp。將PCR 產(chǎn)物克隆到pMDTM18-T 載體后構(gòu)建重組質(zhì)粒PPRV dsDNA 標(biāo)準(zhǔn)品。質(zhì)粒pMDTM18-N 標(biāo)準(zhǔn)拷貝數(shù)為1.22×1012copies/μL。

圖1 PPRV N 基因引物靶序列的位置

2.2 RT-qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMDTM18-N 連續(xù)10 倍稀釋構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行RT-qPCR。以質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.990，斜率為-2.33，截距為37.068（圖2）。

圖2 建立的RT-qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 cdPCR 反應(yīng)條件確定及判定

圖3-A 為芯片的掃描結(jié)果散點(diǎn)圖，藍(lán)色為陽(yáng)性反應(yīng)單元，黃色為陰性反應(yīng)單元。由圖可見(jiàn)，反應(yīng)體系均勻涂布整個(gè)芯片，且封閉制作質(zhì)量較好。散點(diǎn)圖（圖3-B）用兩種顏色表示，分別顯示了FAM 熒光基團(tuán)擴(kuò)增與未擴(kuò)增的PCR 孔分布。選取FAM 和BHQ 兩種熒光通道，可以在平面上顯示兩種熒光的分布強(qiáng)度，黃色對(duì)應(yīng)于較低熒光的未擴(kuò)增孔，而藍(lán)色對(duì)應(yīng)于明顯較高熒光的擴(kuò)增孔。未擴(kuò)增孔和擴(kuò)增孔之間的分布具有良好的區(qū)分性。統(tǒng)計(jì)柱形圖（圖3-C）顯示了芯片陰性反應(yīng)單元和陽(yáng)性反應(yīng)單元的分布，可以看出陰性和陽(yáng)性反應(yīng)單元之間形成獨(dú)立的峰型。使用軟件分析1.22×（105～102）copies/μL 4 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果見(jiàn)圖3-D。每個(gè)稀釋度作3 次重復(fù)，在每組中計(jì)算平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM），以估計(jì)3 個(gè)試驗(yàn)的方差，每個(gè)樣本代表試驗(yàn)獨(dú)立性（P＜0.05）。

圖3 cdPCR 反應(yīng)條件建立

2.4 敏感性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)品pMDTM18-N 連續(xù)進(jìn)行10 倍稀釋?zhuān)?.22×1012～1.22×102copies/μL）后進(jìn)行PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的cdPCR 檢測(cè)引物最低靈敏度為1.22×102copies/μL（圖4-A）。比較OIE 推薦引物的靈敏度1.22×105copies/μL（圖4-B），顯示cdPCR引物敏感性高于OIE推薦引物1 000倍。cdPCR 在每個(gè)15.0 μL 反應(yīng)體系中，最低靈敏度為（0.44±0.14）copies/μL。RT-qPCR 的檢測(cè) 限 為1.22×10-1copies/μL，而cdPCR 為1.22×10-3copies/μL，說(shuō)明cdPCR 比RT-qPCR 靈敏度高100 倍（表1）。

表1 cdPCR 和RT-qPCR 方法的敏感性試驗(yàn)比較結(jié)果

圖4 不同引物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 特異性和重復(fù)性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)結(jié)果（表2、圖5）顯示，這兩種方法均能特異性檢測(cè)到PPRV，且與其他5 種病毒及陰性對(duì)照無(wú)交叉反應(yīng)。對(duì)RT-qPCR 和cdPCR 檢測(cè)的重復(fù)性進(jìn)行評(píng)估，并結(jié)合定量結(jié)果變異系數(shù)（CV）來(lái)確定檢測(cè)準(zhǔn)確性。結(jié)果（表3）顯示：cdPCR 的CV 范圍為0.56%～10.73%，RT-qPCR 為3.11%～50.43%。這些結(jié)果表明，cdPCR 檢測(cè)方法的重復(fù)性良好。

圖5 RT-PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果

表2 cdPCR 和RT-qPCR 方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果

表3 cdPCR 和 RT-qPCR 的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測(cè)

采用RT-qPCR 和cdPCR 方法對(duì)47 份臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果（表4）顯示，cdPCR 的檢出率為25.5%，高于RT-qPCR 的17.0%。但兩種方法的檢測(cè)結(jié)果均顯示，血液樣品的檢出率較低，肺、腸和淋巴結(jié)樣品的檢出率較高。

表4 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果 %

3 討論

PPRV 屬于OIE 規(guī)定的須通報(bào)動(dòng)物疫病，我國(guó)法定的一類(lèi)動(dòng)物疫病。2013—2016 年我國(guó)許多地區(qū)暴發(fā)了PPR，嚴(yán)重威脅我國(guó)動(dòng)物疫病防疫安全[6]。我國(guó)對(duì)PPR 采取相應(yīng)的控制和撲滅措施，使疫情得到有效控制，目前只有零星地區(qū)散發(fā)疫情。PPRV對(duì)熱、干燥和紫外線比較敏感，因此在自然環(huán)境中的存活時(shí)間較短，但是在雨季和冬季會(huì)容易流行。PPRV 在我國(guó)傳播的形式以輸入性傳播為主，集中在引種方面。引種時(shí)一旦沒(méi)有做好及時(shí)的隔離和處置，就會(huì)有疫情地方性流行的風(fēng)險(xiǎn)。顯然，早期快速和精準(zhǔn)診斷在PPR 的防治方面將發(fā)揮著重要作用。

PCR 方法具有快速、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但它需要后續(xù)電泳等處理，易出現(xiàn)假陽(yáng)性和交叉污染[7]。相比傳統(tǒng)PCR，cdPCR 具有更高的敏感性和特異性，同時(shí)縮短了檢測(cè)時(shí)間，無(wú)須核酸電泳，結(jié)果直接讀取，方便基層沒(méi)有實(shí)驗(yàn)技術(shù)背景的工作人員操作。近年來(lái) RT-qPCR 的應(yīng)用已經(jīng)改善了PPRV 核酸擴(kuò)增方法[8]。該方法的靈敏度相對(duì)比常規(guī)RT-PCR 高10～100 倍，并且降低了污染風(fēng)險(xiǎn)。盡管RT-qPCR 核酸擴(kuò)增方法在病原檢測(cè)領(lǐng)域快速發(fā)展，但同時(shí)也伴隨著一系列問(wèn)題。例如：基于CT和ΔCT值的樣品和/或標(biāo)準(zhǔn)品之間的相互依賴(lài)關(guān)系，在RT-qPCR 中，試驗(yàn)理想情況下需要在同一PCR 反應(yīng)板上運(yùn)行每個(gè)靶標(biāo)的所有樣品，最大限度地減少操作失誤[9]。事實(shí)上，對(duì)于分布在多個(gè)位置之間的同一樣品，要獲得重復(fù)性好的試驗(yàn)數(shù)據(jù)一直是RT-qPCR 的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。盡管RT-qPCR 已廣泛用于核酸定量，但它需要將未知物與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較以獲得定量信息。RT-qPCR基于熒光探針在PCR 的每個(gè)循環(huán)后監(jiān)控?cái)U(kuò)增的模擬檢測(cè)量，當(dāng)樣品的目標(biāo)檢測(cè)率低且差異基因表達(dá)水平低時(shí)，該技術(shù)檢測(cè)能力受到限制。而相比RTqPCR，cdPCR 則不需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接給出靶序列的拷貝數(shù)，更加適合低拷貝核酸樣品的檢測(cè)。

本研究成功建立了一種cdPCR 檢測(cè)方法用于PPR 診斷，顯示出比OIE 推薦引物具有更高的靈敏度。cdPCR 相比RT-qPCR 在PPRV 特異性檢測(cè)方面無(wú)明顯差別，而在靈敏性方面比RT-qPCR 提高100 倍，且無(wú)需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相對(duì)病原濃度較少的樣品中可發(fā)揮更高的靈敏度優(yōu)勢(shì)，同時(shí)樣品處理也減少了“動(dòng)手”所需的時(shí)間，并且芯片的密封可最大程度地減少非特異擴(kuò)增子和其他核酸的污染。綜上所述，本研究建立的cdPCR 檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際生產(chǎn)中可為預(yù)防PPR 早期流行提供一種快速有效的診斷和定量方法。