豚鼠氣單胞菌引起山羊猝死的鑒定

黃紫貝，管飄萍，郭 鑫，王海燕，焦庫(kù)華，劉文博，4

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；4.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物疾病檢測(cè)與技術(shù)服務(wù)中心，江蘇揚(yáng)州 225009）

氣單胞菌屬早期曾歸屬于弧菌科，后來研究發(fā)現(xiàn)氣單胞菌與弧菌的同源性不高，于是將氣單胞菌屬自弧菌科移出[1]，現(xiàn)已獨(dú)立為氣單胞菌科[2]。它包括3 個(gè)復(fù)合群，分別是維羅納氣單胞菌復(fù)合群、嗜水氣單胞復(fù)合群和豚鼠氣單胞復(fù)合群[3]。臨床上的感染主要由豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌以及溫和氣單胞菌單獨(dú)或混合引起，主要發(fā)生于水生動(dòng)物，如：Zhu 等[4]研究報(bào)道了野生花鼓魚的不斷死亡是由維氏溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和嗜水氣單胞菌混合感染所致，陳翠珍等[5]研究報(bào)道了鰱鳙打印病是由豚鼠氣單胞菌引起的，樊海平等[6]報(bào)道了歐洲鰻鱺敗血癥與豚鼠氣單胞菌有關(guān)，徐海圣等[7]研究報(bào)道中華絨螯蟹的“抖抖病”也是由豚鼠氣單胞菌引起的。

豚鼠氣單胞菌是直桿狀、兼性厭氧革蘭氏陰性菌，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，廣泛存在于淡水、污水及土壤[2]。近年來發(fā)現(xiàn)，豚鼠氣單胞菌不僅可感染魚類、兩棲類等，還可感染哺乳類動(dòng)物，至今已有狐貍[8]、熊貓[9]、羊駝[10]、林麋[11]等發(fā)病致死的報(bào)道。2020 年Giannattasio-Ferraz 等[12]從健康小母牛尿液中也分離到豚鼠氣單胞菌。自2019 年以來，氣單胞菌屬中至少有19 種被認(rèn)為對(duì)人類有危害，導(dǎo)致廣譜感染[13]。目前，國(guó)內(nèi)未見豚鼠氣單胞菌引起山羊感染的報(bào)道。本研究首次從山羊的內(nèi)臟及組織病料樣品中分離得到豚鼠氣單胞菌，并對(duì)其進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)及致病性試驗(yàn)，以期為養(yǎng)殖和防疫人員做好該病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源及背景

2020 年5 月5 日，江蘇省某養(yǎng)殖場(chǎng)送檢2 只病死山羊。據(jù)了解，發(fā)病山羊10 d 前購(gòu)進(jìn)，已注射小反芻獸疫疫苗，但未進(jìn)行羊痘和羊梭菌疫苗免疫。部分山羊出現(xiàn)咳嗽、拉稀、猝死，死亡率為11.36%（25/220），疑為產(chǎn)氣莢膜梭菌感染。采集2 只病死山羊的腸道、肝臟、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)等病變組織器官進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 細(xì)菌分離

取病死山羊的肝臟、腎臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)以及十二指腸和盲腸內(nèi)容物，分別無(wú)菌接種于產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基平板（購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，37 ℃過夜；挑取典型菌落進(jìn)行純化，純化3 代后挑取單個(gè)菌落，在血平板上37 ℃培養(yǎng)，觀察菌落特征，并進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

1.3 生化試驗(yàn)

利用生化編碼鑒定管（購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司），對(duì)所分離的菌株進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定。具體操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)參照鑒定管說明書。

1.4 16S rRNA 基因擴(kuò)增和序列分析

利用煮沸裂解法提取細(xì)菌DNA 模板：用接種環(huán)挑取純培養(yǎng)后的單菌落，置于裝有200 μL 超純水的滅菌管中，100 ℃熱變性10 min，取2 μL上清作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（TaKaRa16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit 試劑盒）。將純化的DNA 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，并進(jìn)行BLAST 以確定其分類。

1.5 藥敏試驗(yàn)

取分離菌株采用紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)（藥敏紙片購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司），具體操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)參照藥敏紙片產(chǎn)品說明書。

1.6 致病性試驗(yàn)

挑取單個(gè)純化菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃ 150 r/min 培養(yǎng)18 h，細(xì)菌平板計(jì)數(shù)含量為1.76×1011CFU/mL。將小鼠分為4 組，每組3 只，其中1～3 組分別腹腔注射0.3 mL 梯度（5.28×1010、5.28×109、5.28×108CFU/mL）的細(xì)菌懸液，第4組小鼠注射等量無(wú)菌PBS 作為空白對(duì)照，每隔2 h觀察和記錄小鼠發(fā)病和死亡情況，持續(xù)1 周，分析菌株致病性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鏡檢

厭氧培養(yǎng)24 h 后，大腸和小腸內(nèi)容物在培養(yǎng)基上出現(xiàn)密集的黑色菌落（圖1-A），其他臟器病料中未分離出細(xì)菌。該菌在血瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)過夜后形成2 mm 大小，圓形、光滑、濕潤(rùn)、稍凸、灰白色或淡灰色菌落（圖1-B）。挑選單菌落純培養(yǎng)后鏡檢，發(fā)現(xiàn)分離菌為革蘭氏陰性短桿菌，排列成單或成雙，兩端鈍圓（圖1-C）。

圖1 分離菌株的菌落形態(tài)及革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

2.2 生化試驗(yàn)

將分離菌接種于細(xì)菌生化微量鑒定管培養(yǎng)過夜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌生化特性符合豚鼠氣單胞菌生化特性（表1）。

表1 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 16S rRNA 基因擴(kuò)增和序列分析

對(duì)分離菌株16SrRNA 基因進(jìn)行BLAST 比對(duì)，并通過系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，該序列與豚鼠氣單胞菌具有高度同源性，達(dá)99.92%（圖2）。綜合臨床癥狀、鏡檢結(jié)果、生化反應(yīng)結(jié)果以及16SrRNA基因序列測(cè)定與分析結(jié)果，確定該病原菌為豚鼠氣單胞菌。

圖2 基于16S rRNA 基因序列親緣關(guān)系進(jìn)化樹

2.4 藥敏試驗(yàn)

分別用21 種常用抗菌藥物對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌株僅對(duì)呋喃唑酮敏感，對(duì)多黏菌素B 和環(huán)丙沙星介于敏感與耐藥之間，而對(duì)其余 18 種抗菌藥物均耐藥（表2）。

表2 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 致病性試驗(yàn)

第1 組小鼠2 h 后皆出現(xiàn)萎靡不振、四肢站立不穩(wěn)、厭食等癥狀，24 h 內(nèi)全部死亡，其他攻毒組在72 h 內(nèi)全部死亡（表3）。剖檢死亡小鼠發(fā)現(xiàn)，心臟、肺臟淤血（圖3-A），十二指腸出血，腸壁水腫（圖3-B）。對(duì)照組小鼠未出現(xiàn)明顯臨床癥狀（圖3-C、D），1 周后試驗(yàn)結(jié)束，剖檢亦未見明顯病理變化。將病變組織無(wú)菌劃線接種在血平板上分離培養(yǎng)，通過16SrDNA 測(cè)序和生化鑒定分析，確定與之前從猝死羊體內(nèi)所分離的豚鼠氣單胞菌生化特性和序列基本一致。

表3 細(xì)菌致病性試驗(yàn)分組情況

圖3 SPF 小鼠攻毒1 周后剖檢結(jié)果

3 討論

近年來山羊養(yǎng)殖方式發(fā)生了改變，逐漸向集約化、規(guī)?；约案叽拆B(yǎng)殖發(fā)展，使山羊運(yùn)動(dòng)范圍小、運(yùn)動(dòng)量小、微環(huán)境條件差。養(yǎng)殖方式的改變，導(dǎo)致山羊抵抗力下降，繼而各種條件致病菌趁虛而入，造成感染發(fā)病，甚至山羊大規(guī)模死亡，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成一定危害和損失。目前有關(guān)山羊繼發(fā)細(xì)菌感染報(bào)道最多的是產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的梭菌病，而對(duì)其他菌造成的急性死亡認(rèn)識(shí)很少，以至于出現(xiàn)急性死亡病例時(shí)就會(huì)認(rèn)為是產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的，從而出現(xiàn)臨床誤診。在分離本細(xì)菌時(shí)，雖然使用產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基，且培養(yǎng)出黑色的，類似于產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落，但并不意味分離出的細(xì)菌就一定是產(chǎn)氣莢膜梭菌，必須進(jìn)一步鑒定。本研究團(tuán)隊(duì)臨床上對(duì)羊猝死病例使用該培養(yǎng)基分離出不少其他梭菌（另文發(fā)表）。本研究在臟器中未分離出細(xì)菌，可能是由于該菌主要在腸道內(nèi)增殖，毒素迅速出現(xiàn)，造成山羊突然死亡，未造成菌血癥，也未通過血液進(jìn)入臟器和淋巴結(jié)。

耐藥試驗(yàn)結(jié)果顯示，此豚鼠氣單胞菌分離株具有廣泛的耐藥性，對(duì)18 種抗菌藥物耐藥，僅對(duì)呋喃唑酮敏感，因此在診療中需針對(duì)性地選用敏感的抗菌藥物。Wu 等[14]研究了酵母糖蛋白（YG）對(duì)從魚肝臟中分離得到的豚鼠氣單胞菌抗菌活性，并描述了其可能的抗菌機(jī)制，旨在尋找傳統(tǒng)抗菌藥物的潛在替代品。本研究希望為養(yǎng)殖者在養(yǎng)殖過程中合理應(yīng)用抗菌藥物提供參考，以減少耐藥菌株產(chǎn)生的可能性。

作為條件致病菌，豚鼠氣單胞菌較容易感染有免疫功能缺陷的患者，可引起胃腸炎、血流感染、呼吸系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染、眼部感染、腦膜炎及肝膿腫等[15]。Kimura 等[16]評(píng)估了日本的菌血癥發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)豚鼠氣單胞菌是航空菌血癥的常見病原體。2015 年李任文等[17]報(bào)道過一位男性因被青蟹咬傷致豚鼠氣單胞菌感染休克死亡的案例。2018 年有文獻(xiàn)報(bào)道了類似霍亂的氣單胞菌感染病例[18]。Sharma 等[19]曾對(duì)禽類及牛羊等動(dòng)物源食品進(jìn)行氣單胞菌分離鑒定及小鼠致病性試驗(yàn)，結(jié)果從雞中分離到具腸毒性的豚鼠氣單胞菌。氣單胞菌菌種越來越與胃腸道感染有關(guān)，盡管在屬之間以及內(nèi)部的致病性和毒力上有明顯差異[18]。小鼠致病性試驗(yàn)說明該菌具有一定的致病性，但其主要感染水生動(dòng)物和兩棲類動(dòng)物，因而關(guān)于陸生動(dòng)物感染致死的報(bào)告較少[20]。而且豚鼠氣單胞菌作為一種典型的人-獸-魚共患病原菌，其可能會(huì)感染更多患有潛在疾病的老年人及動(dòng)物，因此人們要對(duì)該屬有更廣泛的認(rèn)識(shí)，要深入了解潛在新物種、不同尋常的抵抗機(jī)制和具有不同病程疾病的混合感染引發(fā)的問題，加強(qiáng)對(duì)該菌的監(jiān)測(cè)，切斷其傳播途徑，減少該菌在不同宿主間的循環(huán)。