葡萄炭疽病病原鑒定及防治藥劑篩選

羅 躍，劉阿麗，劉旭東，韓 磊，姚小龍，胡安龍，吳小毛

(1 貴州大學(xué)作物保護研究所，貴陽，550025；2 貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴陽，550025；3 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽，550025)

葡萄炭疽病又名晚腐病、苦腐病，是葡萄近成熟期的主要真菌病害之一[1]。我國葡萄種植區(qū)內(nèi)炭疽病普遍發(fā)生，尤其在南方產(chǎn)區(qū)、北方環(huán)渤海產(chǎn)區(qū)等，西北產(chǎn)區(qū)基本不發(fā)生[2-3]。當(dāng)前研究表明，引起葡萄炭疽病的病原菌主要有膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides和尖孢炭疽菌Colletotrichumacutatum，但如殼皮炭疽菌Colletotrichumcrassipes、Colletotrichumfructicola等一些新的致病菌種也在不斷被發(fā)現(xiàn)報道[4-5]。膠孢炭疽菌屬半知菌亞門(Deuteromycotina)、黑盤孢目(Melanconiales)、炭疽菌屬(Colletotrichum)[6]。葡萄炭疽病主要在轉(zhuǎn)色期至成熟期的果實上發(fā)生，當(dāng)前報道中不同病原侵染后引發(fā)的病癥描述較為相近，病原菌侵染果實后起初在表面形成褐色斑點，病斑擴大后中心轉(zhuǎn)黑凹陷并產(chǎn)生輪紋狀黑點，環(huán)境濕度大時病部生出粉色黏狀物，最終導(dǎo)致果實皺縮腐爛[2，7]。

近年來，隨著貴州省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整及脫貧攻堅工作的推動，葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，貴陽市花溪區(qū)為貴州省的葡萄主要產(chǎn)區(qū)之一，炭疽病隨著種植面積不斷擴大而在葡萄上的危害日益嚴重，高溫多雨季節(jié)最有利于其發(fā)生[8]，每年造成葡萄產(chǎn)業(yè)的損失達10%～20%，嚴重時可達30%以上，對葡萄的品質(zhì)和產(chǎn)量影響較大[9]。化學(xué)藥劑仍是當(dāng)前防治炭疽病的主要措施[10]，但化學(xué)農(nóng)藥長期單一及不合理使用，導(dǎo)致葡萄炭疽病病原菌對部分藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性[11-12]。如鄧維萍等[13]發(fā)現(xiàn)烯唑醇和腈菌唑在不合理使用情況下，使得炭疽病菌產(chǎn)生抗藥性；葉佳等[14]研究表明，浙江葡萄炭疽病病菌對甲基硫菌靈已產(chǎn)生了嚴重抗藥性，防治效果明顯降低。引起葡萄發(fā)生炭疽病的病原菌種類不一，不同病原對同種藥劑的敏感性存在差異的可能較大，且病原菌的抗藥性存在時空差異，因此，明確貴陽市花溪區(qū)葡萄炭疽病的病原種類，篩選出具有針對性的高效防治藥劑，并將作用機理不同的藥劑進行混配，選出共毒系數(shù)較高的組合供生產(chǎn)上施藥參考，對當(dāng)?shù)仄咸烟烤也〉姆乐魏脱泳彶≡顾幮缘漠a(chǎn)生具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試分離物：葡萄品種為巨玫瑰，葡萄炭疽病病樣采于貴陽市花溪區(qū)葡萄基地。

7種供試殺菌劑原藥：97%苯醚甲環(huán)唑(江蘇耕耘有限責(zé)任公司)；98%吡唑醚菌酯(湖北康寶泰精細化工有限公司)；98%肟菌酯、95%啶氧菌酯、98%雙苯菌胺、95%唑菌酯、96%丁香菌酯(沈陽化工研究院有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄炭疽病病原鑒定

采用組織分離法[15]進行分離。在葡萄果皮表面病健交界處剪取適當(dāng)大小組織塊放在無菌濾紙上，用75%乙醇表面消毒35 s，無菌水沖洗3次，置于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，挑取菌落邊緣菌絲進行純化，重復(fù)純化直至得到單一菌株，將純化后的菌株轉(zhuǎn)接于PDA試管斜面4 ℃保存。

觀察記錄PDA平板上該病原菌菌落的形態(tài)、顏色等特征。黑光燈照射產(chǎn)孢培養(yǎng)后，在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子的大小形態(tài)并拍照。

根據(jù)柯赫氏法則進行回接試驗，測定分離菌株的致病性。采用注射法將孢子懸浮液接種在葡萄果實上。將接種后的葡萄果實置于含濾紙和脫脂棉的保鮮盒中保濕培養(yǎng)，控制培養(yǎng)的溫度和濕度條件，觀察發(fā)病癥狀。

參照陳吉良等[16]的方法提取病原菌DNA。利用真菌通用引物ITS4和ITS5對病原菌rDNA的ITS區(qū)域進行PCR擴增。25 μLPCR反應(yīng)體系包括：正反向引物各1.0 μL；DNA模板1.0 μL；ddH2O 9.5 μL；2×PCR Master Mix (含2xTaq DNA Polymerase，2×PCR Buffer，2xdNP)12.5 μL。PCR反應(yīng)擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工(上海)生物工程股份有限公司測序，用Chromas軟件分析序列并上傳到GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中，通過BLAST進行同源序列比對分析，采用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 防治藥劑篩選

采用菌絲生長速率法[17]進行藥劑毒力測定。將7種藥劑都配制成母液后，將母液稀釋成至少5個濃度梯度，然后以體積比1∶9加入PDA培養(yǎng)基中，充分搖勻后制成含藥平板。使用直徑5 mm的打孔器打出菌餅接種于含5個濃度供試藥劑的9 cm PDA平板中央，以等量無菌水與PDA混勻制成平板作為空白對照，每個處理重復(fù)3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)。3～5 d后，采用十字交叉法測量各平板的菌落直徑，運用DPS 13.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算各藥劑對葡萄炭疽病菌菌絲生長抑制的回歸方程、EC50值。

菌絲生長抑制率=

將苯醚甲環(huán)唑與吡唑醚菌酯，苯醚甲環(huán)唑與啶氧菌酯進行組合配比，按質(zhì)量濃度8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8等不同比例混合并稀釋到試驗所需要的各濃度處理，分別以混合的單劑作為對照，并設(shè)空白對照，每個處理重復(fù)3次，求得各配比的毒力回歸方程及其EC50值。根據(jù)共毒系數(shù)法求出毒力指數(shù)、理論毒力指數(shù)、實際毒力指數(shù)及混劑的共毒系數(shù)CTC值，并以此進行綜合評價，CTC>120表示增效作用，80

實測藥劑毒力指數(shù)(ATI)=

混劑的理論毒力指數(shù)(TTI)

=(藥劑A的毒力指數(shù)×Ax)

+(藥劑B的毒力指數(shù)×Bx)

Ax—藥劑A在混劑中的百分含量；Bx—藥劑B在混劑中的百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄炭疽病病原鑒定結(jié)果

試驗結(jié)果看出，病原菌在PDA平板上的菌落呈圓形，菌落邊緣平整，菌絲為白色或灰白色，絨狀或絮狀(如圖1a、圖1b)。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株分生孢子橢圓形，無色、單孢，有隔，具1～2個油球，圓筒形，兩端鈍圓，大小為(13.1～17.2) μm×(3.4～4.8)μm(如圖1c)。分生孢子萌發(fā)時產(chǎn)生的附著孢深褐色，為球形或橢圓形。

注：a、b為菌落形態(tài)，c為分生孢子。

用注射法將孢子懸浮液回接到健康的葡萄果實上，癥狀與自然發(fā)病的炭疽病無異。根據(jù)柯赫氏法則，將發(fā)病果實重新進行組織分離，純化培養(yǎng)，其菌落形態(tài)特征與接種菌株一致。

對供試菌株的基因組rDNA-ITS進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序獲得大小為566 bp的DNA片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2a所示。將其與GenBank中已有序列進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)該菌株rDNA-ITS序列與膠孢炭疽菌的同源性達100%。采用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖2b)，菌株與膠孢炭疽菌有較高的支持率聚在一支，鑒定結(jié)果表明該病原菌為膠孢炭疽菌。

注：a中1表示DNA marker (D2000)，2為對照，3表示分離菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物。

2.2 防治葡萄炭疽病化學(xué)藥劑篩選結(jié)果

試驗結(jié)果看出，7種供試藥劑對菌株均有一定的抑制作用，但敏感性存在差異。從藥劑的EC50值來看，丁香菌酯的抑制作用最強，EC50值為0.18 mg/L；其次為苯醚甲環(huán)唑和雙苯菌胺，EC50值分別為1.18 mg/L和1.34 mg/L；吡唑醚菌酯和啶氧菌酯也較敏感，EC50值分別為4.01 mg/L和5.09 mg/L；而肟菌酯和唑菌酯的敏感性相對較低，其EC50值分別為14.37 mg/L和25.88 mg/L(見表1)。

表1 不同殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用

試驗結(jié)果看出，吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑不同比例組合對供試菌株的菌絲生長抑制差異明顯。吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑的質(zhì)量比為8∶1和4∶1時CTC>120，CTC值分別為168.69和152.89，表現(xiàn)為增效作用，增效效果顯著。吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑的質(zhì)量比為1∶4時，其CTC值為112.62，表現(xiàn)為相加作用。此外，當(dāng)質(zhì)量比為2∶1、1∶2、1∶1和1∶8時，表現(xiàn)為拮抗作用(見表2)。

表2 吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑混配抑制效果

試驗結(jié)果看出，啶氧菌酯和苯醚甲環(huán)唑不同比例組合對供試菌株表現(xiàn)出不同程度的抑制效果。其中啶氧菌酯與苯醚甲環(huán)唑的質(zhì)量比為8∶1和1∶4時，增效作用最好，CTC值分別為192.69和197.21，明顯大于120，增效效果顯著。啶氧菌酯與苯醚甲環(huán)唑的質(zhì)量比為4∶1、2∶1時，其CTC值分別為103.30和108.29，表現(xiàn)為相加作用。此外，當(dāng)質(zhì)量比為1∶1、1∶2和1∶8時，表現(xiàn)為拮抗作用(見表3)。

表3 啶氧菌酯與苯醚甲環(huán)唑混配抑制效果

3 結(jié)論與討論

本研究對采自貴陽市花溪區(qū)葡萄基地的葡萄炭疽病病樣進行病原菌的分離純化，通過致病性測定發(fā)現(xiàn)，該菌株具有較強的致病能力，所分離菌株形態(tài)特征與李洋等[18]、鄧維萍[5]等研究結(jié)果相一致。結(jié)合rDNA-ITs序列分析，鑒定該菌株為膠孢炭疽菌。采用菌絲生長速率法對7種殺菌劑原藥進行了室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明，7種殺菌劑對葡萄炭疽病病菌均有一定的抑制作用，其中丁香菌酯對膠孢炭疽菌菌絲生長的抑制作用最強，EC50值為0.18 mg/L，病原菌對苯醚甲環(huán)唑、雙苯菌胺、吡唑醚菌酯和啶氧菌酯也較敏感，EC50值分別為1.19、1.34、4.01、5.09 mg/L，而對肟菌酯和唑菌酯的敏感性相對較低。孫行杰等[19]、楊敬輝等[12]研究表明，苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯對葡萄炭疽病病菌菌絲具有較強的抑制作用，與本試驗結(jié)果基本相一致，但本試驗中苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯的EC50值于高孫行杰等[19]、楊敬輝等[12]的研究結(jié)果，可能是由于不同地區(qū)病原菌抗藥性水平差異導(dǎo)致。

苯醚甲環(huán)唑?qū)偃蝾悮⒕鷦?，主要通過干擾病原菌細胞麥角甾醇的合成達到抑菌效果，而啶氧菌酯和吡唑醚菌酯是線粒體呼吸抑制劑，通過阻止病原菌細胞中細胞色素b和C1間電子傳遞而抑制線粒體呼吸作用。將吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑、啶氧菌酯與苯醚甲環(huán)唑等作用機理不同的殺菌劑進行混配組合，結(jié)果表明，吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑的質(zhì)量比為8∶1和4∶1時，共毒系數(shù)(CTC)分別為168.69和152.89，表現(xiàn)為增效作用；啶氧菌酯與苯醚甲環(huán)唑的質(zhì)量比為8∶1和1∶4時，CTC值分別為192.69和197.21，增效效果顯著；其中啶氧菌酯與苯醚甲環(huán)唑質(zhì)量比1∶4時，增效最明顯。通過藥劑間混配，不僅可以擴大協(xié)同增效藥劑的殺菌譜，還可延緩葡萄炭疽病菌抗藥性的產(chǎn)生，延長藥劑的使用壽命。本研究結(jié)果表明，丁香菌酯、苯醚甲環(huán)唑、雙苯菌胺、吡唑醚菌酯和啶氧菌酯對該病原菌均有較好的抑制作用，該結(jié)果可為葡萄炭疽病的田間選藥防治提供一定的理論參考。