多核和雙核絲核菌侵染水稻過程中細胞超微結構變化及細胞壁降解酶活性的差異

魏松紅,段 淯,張 優(yōu),張照茹,李昕洋,劉 偉,王海寧

（沈陽農業(yè)大學植物保護學院,沈陽110161）

絲核菌屬（Rhi zoctonia）真菌隸屬于擔子菌門（Basidiomycota），根據(jù)細胞核數(shù)量，該屬真菌可分為單核絲核菌、雙核絲核菌和多核絲核菌[1-2]。絲核菌屬真菌大多數(shù)種類為植物病原菌，常導致多種農作物病害，如水稻紋枯病、小麥紋枯病、馬鈴薯黑痣病以及煙草靶斑病等。其中水稻紋枯病是我國水稻三大病害之一，水稻紋枯病優(yōu)勢病原菌為多核絲核菌——立枯絲核菌（Rhizoct oni a solani），而雙核絲核菌——水稻絲核菌（Rh izoctonia oryzae-sativae）也可侵染水稻，但致病力較弱[3]。張照茹等[4]利用不同絲核菌屬真菌的特異性引物對分離自我國東北地區(qū)的214株水稻紋枯病菌進行病原菌種類鑒定，結果表明：供試菌株分屬于立枯絲核菌和水稻絲核菌，占比分別為92.52%和7.48%。張優(yōu)等[5]利用水稻品種遼星1號對分離自我國東北地區(qū)的112株立枯絲核菌（多核菌株）和20株水稻絲核菌（雙核菌株）進行致病性測定，結果表明：多核菌株和雙核菌株間致病力差異明顯，多核菌株均屬強或中等致病型，雙核菌株均屬中等或弱致病型。

絲核菌屬植物病原菌具有典型的死體營養(yǎng)型病原菌侵染特征，死體營養(yǎng)型植物病原真菌在侵入寄主時主要有三大致病因子：機械侵入、細胞壁降解酶和毒素[6]。絲核菌屬植物病原菌機械侵入方式主要是以菌絲直接穿透水稻表面細胞和形成侵染墊和附著胞等侵染結構進行侵染。MATSUURA[7]通過掃描電子顯微鏡觀察了立枯絲核菌侵染水稻的侵染過程，結果表明：病原菌菌絲體首先在寄主表面擴展，之后形成初級分枝和側枝，側枝頂端膨大形成附著胞或側枝聚集在一起形成侵染墊，附著胞和侵染墊再形成侵染釘侵入水稻組織。多數(shù)植物病原真菌可分泌多種細胞壁降解酶，能夠破壞寄主細胞壁結構。陳夕軍等[8]利用3,5-二硝基水楊酸法對接種至Marcus培養(yǎng)液和水稻葉鞘的立枯絲核菌產生的細胞壁降解酶種類及酶活性進行了測定，結果表明：立枯絲核菌在人工培養(yǎng)和活體接種條件下可產生PG酶、PMG酶、Cx酶、PGTE酶和PMTE酶，其中PG酶、Cx酶和PMG酶活性較高,而PGTE酶和PMTE酶活性很低。毒素是植物病原菌代謝過程中產生的對寄主有害的非酶類化合物，能在很低的濃度下破壞植物的正常生理功能[9]。陳夕軍等[10]利用薄層色譜、高效液相色譜、紅外光譜和氣質聯(lián)用對立枯絲核菌（R.solani）毒素組分進行了測定，結果表明：立枯絲核菌毒素中含有葡萄糖、N-乙酰氨基甘露糖和蔗糖，不含苯甲酸、苯乙酸及其衍生物。

本研究選取3株立枯絲核菌（多核菌株）和2株水稻絲核菌（雙核菌株），利用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡對兩者侵染水稻葉片的超微結構進行觀察；利用3,5-二硝基水楊酸法對病原菌產生的細胞壁降解酶種類及活性進行測定，明確不同種類及核相的絲核菌對水稻葉片致病過程中主要細胞壁降解酶種類，探究菌株致病力與細胞壁降解酶種類及活性間的相關性；利用實時熒光定量PCR技術對多核菌株與雙核菌株在侵染過程中PG基因的表達情況進行分析，研究結果可為絲核菌屬植物病原菌致病機制、水稻紋枯病抗病育種以及綜合防控奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試多核菌株為立枯絲核菌（R.solaniAG1-IA）LND06、LND18和LND21，雙核菌株為水稻絲核菌（R.oryzae-sativaeAG-Bb）JLS07和JLS10，均保存于沈陽農業(yè)大學植物保護學院水稻病害研究室。供試水稻品種為遼星1號，由遼寧省農業(yè)科學院提供。供試Trizol提取試劑盒（B511321）和反轉錄試劑盒（B639277）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

供試PDA培養(yǎng)基用于供試菌株活化[11]；Marcus培養(yǎng)基用于誘導供試菌株產生細胞壁降解酶；誘導供試菌株產生PG、PMG、PGTE和PMTE酶時，以柑橘果膠為底物；誘導供試菌株產生Cx酶時，以羧甲基纖維素鈉為底物[12]。

1.2 方法

1.2.1 病原菌侵染結構的顯微觀察 將供試菌株LND06和JLS10分別于PDA培養(yǎng)基活化2d和5d，待供試水稻生長至4葉期時，打取直徑5mm的菌餅接種至稻苗第2葉中央，分別于接種后0，12，24，48，72h時進行取樣。

與不同接種時間的接種樣品病健交界處切取1 mm2作為觀察樣品，根據(jù)日立Regulus 8100冷場發(fā)射掃描電鏡和蔡司LSM 510透射電子顯微鏡操作說明進行樣品制備、觀察和拍照。

1.2.2 病原菌細胞壁降解酶的提取與活性測定 將供試菌株LND06、LND18、LND21、JLS07和JLS10于PDA培養(yǎng)基活化后，打取5塊直徑5mm菌餅接種至100mL Marcus培養(yǎng)液中，28℃靜置培養(yǎng)6d，過濾后4℃、15000r·min-1離心20min，保留上清液（粗酶液）備用。

用3,5-二硝基水楊酸法制作葡萄糖標準曲線和半乳糖醛酸標準曲線，按BRADFORD法[13]制作牛血清蛋白標準曲線。

Cx活性測定參考胡長志等[14]報道的方法進行；PG和PMG活性測定參考王丹等[15]和DOUAIBER等[16]報道的方法進行；PGTE和PMTE活性測定參考高增貴等[17]報道的方法進行。

1.2.3 病原菌PG基因的表達差異 將供試菌株LND06、LND18、LND21、JLS07和JLS10于PDA培養(yǎng)基活化，待供試水稻生長至4葉期時，打取直徑5mm的菌餅接種至稻苗第2葉中央，分別于接種后0，12，24，36，48，72h時取樣，液氮速凍后-80℃保存，每個處理3次重復。

利用DNAMAN軟件設計供試菌株LND06、LND18、LND21、JLS07和JLS10P G基因及內參基因引物（表1）。多核菌株（LND06、LND18和LND21）PG基因序列為NCBI網站下載序列（登錄號為KP896519），雙核菌株（JLS07和JLS10）P G基因序列為對菌株JLS07進行高通量測序所得。

表1 水稻紋枯病菌多核菌株與雙核菌株P G基因熒光定量PCR引物序列Table 1 Fluorescent quantitative PCR primer sequence of multinucleate isolates and binucleate isolates

將水稻葉片樣品在Trizol中充分研磨，50mg樣品使用0.5mL Trizol，按Trizol提取試劑盒（B511321）提取方法提取總RNA，用反轉錄試劑盒（B639277）進行cDNA合成。

利用TB GreenPremix Ex Ta qTMⅡ（Tli RNaseH Plus）熒光定量PCR試劑盒（RR820Q，Takara公司）進行熒光定量PCR反應。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 試驗所得數(shù)據(jù)結果采用SPSS 17.0軟件進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 絲核菌多核菌株與雙核菌株侵染過程中菌絲及水稻葉片細胞結構的顯微觀察

2.1.1 多核菌株與雙核菌株侵染過程中菌絲結構的掃描電鏡觀察 由圖1可知，多核菌株LND06在侵染12h時，菌絲已生長至水稻葉片表面，已有侵染墊形成；在侵染24h時，菌絲豐富、侵染墊數(shù)量達到最多；在侵染48h和72h時，侵染墊數(shù)量并沒有顯著增加。雙核菌株JLS10在侵染12h時，菌絲未生長至水稻葉片表面，在侵染24h時，水稻葉片表面形成少量侵染墊，在48h和72h時，菌絲密集程度及侵染墊的數(shù)量逐漸增多但顯著少于多核菌株LND06。

圖1 絲核菌多核（LND06）與雙核菌株（JLS10）侵染過程的掃描電鏡觀察Figure 1 Scanning electron microscopic observation on the infection process of multinucleate isolates(LND06)and binucleate isolates(JLS10)of Rhi zoctini a spp.

2.1.2 多核菌株與雙核菌株侵染過程中水稻葉片細胞結構的透射電鏡觀察 由圖2可知，病原菌侵染水稻葉片前，水稻細胞核清晰，葉綠體結構完整，被膜清晰，線粒體膜清晰，嵴明顯。多核菌株LND06侵染水稻葉片12h時，水稻葉綠體膨脹、形狀不規(guī)則；侵染24h時，水稻葉綠體膜消解；侵染48h時，葉綠體內部結構解體，可觀察到菌絲。雙核菌株JLS10在侵染水稻葉片12h和48h時，水稻葉肉細胞內的細胞器均無明顯變化；在侵染48h時，可觀察到菌絲。

圖2 絲核菌多核（LND06）與雙核菌株（JLS10）侵染過程的透射電鏡觀察Figure 2 Transmission electron microscopic observation on the infection process of multinucleate isolates(LND06)and binucleate isolates(JLS10)of Rh izoct inia spp.

2.2 絲核菌多核與雙核菌株細胞壁降解酶的活性差異

由圖3可知，供試多核菌株5種細胞壁降解酶活性顯著高于雙核菌株，供試多核菌株（LND06、LND18和LND21）PG、PMG、Cx、PGTE和PMTE活性平均值分別為677.06，457.43，279.91，27.07，22.10U·mg-1。供試雙核菌株（JLS07和JLS10）PG、PMG、Cx、PGTE和PMTE活性平均值分別為46.07，32.64，42.64，11.12，8.42U·mg-1。供試多核菌株間5種細胞壁降解酶活性具有顯著性差異，其中供試多核菌株LND06產生的5種細胞壁降解酶活性最高，其PG、PMG、Cx、PGTE和PMTE活性分別為860.46，567.89，336.94，35.65，24.67U·mg-1。供試雙核菌株間差異較小，僅在PGTE和PMTE活性具有顯著性差異。

圖3 絲核菌多核與雙核菌株細胞壁降解酶活性差異Figure 3 Difference of activity of CWDEs of multinucleate isolates and binucleate isolates of Rhi zoctini a spp.

2.3 絲核菌多核與雙核菌株染水稻過程中PG基因表達量的差異分析

由圖4可知，多核菌株（LND06、LND18和LND21）和雙核菌株（JLS07和JLS10）在侵染水稻過程中P G基因表達均呈先上升后下降的趨勢，供試多核菌株在侵染水稻過程中不同時間點P G基因的表達量均高于雙核菌株。供試多核菌株LND06、LND18和LND21的P G基因表達量均在侵染第24h達到最高，其相對表達量分別為6.33，5.09，3.66；供試雙核菌株JLS07和JLS10的PG基因表達量均在侵染第48h達到最高，其相對表達量分別為0.77和0.48。

圖4 絲核菌多核菌株與雙核菌株侵染水稻葉片過程中PG基因表達情況Figure 4 Expression of PG gene in rice leaves infected by multinucleate isolates and binucleate isolates of Rh izoct inia spp.

3 討論與結論

絲核菌屬真菌可導致多種農作物病害的發(fā)生，可侵染水稻的絲核菌屬病原菌種類及融合群主要為多核絲核菌立枯絲核菌的AG1-IA、AG1-IB、AG1-IC、AG4-HGⅠ、AG4-HGⅡ、AG5、AG6-GW融合群、水稻斑枯絲核菌（R.or yzae）和雙核絲核菌的水稻絲核菌AG-Bb融合群[18-19]，其中立枯絲核菌AG1-IA融合群是水稻紋枯病的優(yōu)勢病原菌。多核絲核菌和雙核絲核菌在生物學特性、致病力和藥劑敏感性等方面均存在較大差異[20-21]。分析菌株間致病力差異對于研究絲核菌屬病原菌導致的水稻病害的發(fā)生流行以及種群動態(tài)具有重要意義。本研究結果表明：在侵染水稻葉片過程中，多核菌株菌絲密集程度及侵染墊的數(shù)量顯著多于雙核菌株。多核菌株在侵染24h時，可觀察到水稻葉片內部器官開始分解。雙核菌株在侵染48h時，僅觀察到菌絲，未發(fā)現(xiàn)水稻葉片內部器官分解。多核菌株與雙核菌株均可以產生PG、PMG、Cx、PGTE和PMTE，且PG酶活性均最高，多核菌株與雙核菌株產生酶種類相同而活性不同，供試多核菌株的細胞壁降解酶活性顯著高于雙核菌株。P G基因在多核菌株與雙核菌株侵染過程中均上調表達，多核菌株在24h時表達量最高，雙核菌株在48h時表達量最高，其后下降，多核菌株的表達量明顯高于雙核菌株。

在自然環(huán)境中，絲核菌屬真菌常存在致病力分化現(xiàn)象，這種致病力分化主要是由于菌絲融合產生的異核現(xiàn)象或有性繁殖產生擔孢子提高了基因重組的頻率[22-23]。LIU等[24]認為立枯絲核菌中dsRNA的存在減弱了菌株的致病力。周夢琳等[25]對立枯絲核菌不致病菌株Rs3和野生型菌株侵染水稻時的侵染結構進行觀察，發(fā)現(xiàn)Rs3不能正常形成侵染墊和附著胞結構。進一步的重測序結果表明：與野生型菌株相比，Rs3菌株的基因組存在大量的SNP和Indel，主要涉及菌絲生長相關的Actin基因，致病相關的cAMP通路、MAPK通路、鈣離子信號通路以及效應因子等。DORRANCE等[26]認為立枯絲核菌致病力與其生存環(huán)境和營養(yǎng)環(huán)境有關。曾泉等[27]研究結果表明以蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉、氯化銨、硝酸鉀為氮源培養(yǎng)的立枯絲核菌均表現(xiàn)出較強的致病力，而以甘氨酸和尿素為氮源培養(yǎng)的立枯絲核菌致病力相對較弱。本研究以2種可侵染水稻的不同核相的絲核菌屬真菌為研究對象，初步明確了二者間致病力差異的產生原因是由于侵染過程中菌絲擴展速度、侵染墊形成數(shù)量、細胞壁降解酶活性以及PG基因表達量，研究結果可為進一步了解絲核菌屬真菌和水稻紋枯病菌的致病機制奠定理論基礎。