自然狀態(tài)下油松感染松材線(xiàn)蟲(chóng)后的生理響應(yīng)

秦世杰，祁金玉，劉仁軍，陳鳳毛，郝德君，李治鑫，孫守慧

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,沈陽(yáng)110161；2.沈陽(yáng)市森林資源監(jiān)測(cè)中心,沈陽(yáng)110136；3.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京210037）

松材線(xiàn)蟲(chóng)?。≒ine wilt disease）是一種由松材線(xiàn)蟲(chóng)（Bursaphel enchus x yloph ilus）引起的松科植物毀滅性的世界性森林病害。我國(guó)自1982年首次在南京中山陵發(fā)現(xiàn)以來(lái)，該病不斷擴(kuò)散蔓延，造成大量的松樹(shù)死亡，成為近幾十年來(lái)我國(guó)發(fā)生和危害最為嚴(yán)重的林業(yè)病害[1]。截止到2020年，該病害已在我國(guó)18個(gè)省的666個(gè)縣級(jí)行政區(qū)發(fā)生[2]，累計(jì)致死松樹(shù)10億多株，造成經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1000億元[3]。短短幾十年間，該病由南向北快速擴(kuò)散，從熱帶和亞熱帶地區(qū)逐步入侵至暖溫帶，突破了10℃年均溫度線(xiàn)，最北端已到遼寧北部多個(gè)縣區(qū)，直接對(duì)我國(guó)東北地區(qū)大量的松林資源和景區(qū)造成了嚴(yán)重的威脅[4,5]。

植物受害蟲(chóng)或病原菌侵染后體內(nèi)活性氧（ROS）迸發(fā)是植物對(duì)外界生物刺激應(yīng)答的早期反應(yīng)之一，在植物防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要作用[6]。SOD、CAT、POD作為植物體重要的保護(hù)酶，可以通過(guò)清除多余的ROS來(lái)保護(hù)植物細(xì)胞免遭氧化損傷[7]。植物苯丙烷類(lèi)代謝途徑生成抗病次生物質(zhì)木質(zhì)素、植保素和酚類(lèi)化合物等[8]，是植物抗病反應(yīng)中重要的代謝途徑之一。研究表明，劍麻苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因廣泛參與調(diào)控纖維發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答[9]，也有研究證明PAL參與了黑米（black rice）對(duì)水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）的抗性[10]。逆境條件下，植物通過(guò)大量積累甜菜堿、升高可溶性蛋白含量從而提高植物適應(yīng)不良環(huán)境的能力[11-12]。植物防御反應(yīng)的誘導(dǎo)是由多種信號(hào)物質(zhì)共同調(diào)控的，SA、JA等內(nèi)源激素是植物抗蟲(chóng)和病原菌中的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[13]，其受生物或非生物等外源信號(hào)刺激后可迅速發(fā)生變化，進(jìn)而促使植物體形成防御性物質(zhì)。

目前，我國(guó)自然感染松材線(xiàn)蟲(chóng)病的松樹(shù)種類(lèi)有16種。其中，遼寧地區(qū)主要以油松（P.t abulae formi s）、紅松（P.k oraiensis）和落葉松（Larixspp.）為主[14-16]。油松做為沈陽(yáng)市的市樹(shù)，是沈陽(yáng)市油松櫟林群落中的主要樹(shù)種，同時(shí)在遼寧西北地區(qū)的水土保持中發(fā)揮著重要作用[17]。國(guó)內(nèi)對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的致病機(jī)理研究多以試驗(yàn)室接種松樹(shù)幼苗為主，胡凱基等[18]研究發(fā)現(xiàn)，油松苗接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后有較高的致死率，2009年陜西省也曾發(fā)現(xiàn)自然狀態(tài)下油松也可感染松材線(xiàn)蟲(chóng)病[14]。徐華潮[19]對(duì)黑松和馬尾松被松材線(xiàn)蟲(chóng)自然侵染后不同感病階段針葉光合作用、針葉光譜特征、含水量、色素、抗氧化酶活性、還原糖與礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的變化以及對(duì)各階段松樹(shù)組織的影響進(jìn)行過(guò)研究。但油松大樹(shù)自然狀態(tài)下感染松材線(xiàn)蟲(chóng)后其生理指標(biāo)的變化規(guī)律尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以沈陽(yáng)市東陵公園內(nèi)70年生的油松為研究對(duì)象，測(cè)定受害油松與健康油松生理生化指標(biāo)的變化，探討寄主樹(shù)木對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)入侵的生理反應(yīng)，以期為進(jìn)一步深入研究松材線(xiàn)蟲(chóng)致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)地設(shè)置在沈陽(yáng)市東陵公園，位于市區(qū)東北部丘陵地帶，海拔約90m（41°49′52.37″N～41°51′18.11″N，123°35′2.00″E～123°37′42.40″E）。林分組成以油松（P.tab ul ae f or mis）為主，占75%；落葉松（Lari x gmelinii）次之，占15%；另外，樟子松（P.sylvestr i s.var.mongol i ca）、榆樹(shù)（Ulmus pumila）、蒙古櫟（Quer cus mongoli ca）和皂莢（Gl ed i tsia s inensis）等闊葉樹(shù)占10%。油松為林分主要喬木樹(shù)種，樹(shù)齡約70年，胸徑27.48～44.55cm。

通過(guò)流脂法和定期取樣法來(lái)確定自然狀況下受害的樣株，同時(shí)在未發(fā)病區(qū)域設(shè)置取樣對(duì)照區(qū)。本文根據(jù)徐華潮[19]的劃分標(biāo)準(zhǔn)，參照其感病早期和感病后期的癥狀劃分標(biāo)準(zhǔn)確定本研究中的受害前期和受害后期兩個(gè)階段。受害前期小枝針葉為灰綠色并稍微下垂，但1年生針葉為綠色；受害后期小枝針葉發(fā)白、變黃，下垂程度更為嚴(yán)重，1年生針葉開(kāi)始變?yōu)榛揖G色并稍微下垂；健康對(duì)照小枝上針葉全部為綠色。于2019年10月分別選取受害前期、受害后期、健康（對(duì)照組）油松樣樹(shù)各3株，每株上各剪取3個(gè)枝條，摘取其1a生針葉立即放入液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。在測(cè)定時(shí)將每株樹(shù)上3個(gè)枝條的針葉混合為1個(gè)樣本，重復(fù)3次。

1.2 生理指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 酶活性測(cè)定 過(guò)氧化物酶（POD）活性采用POD試劑盒（試劑盒購(gòu)自南京建成公司，下同）測(cè)定。將各處理針葉0.1g加入1.0mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，4℃冷凍離心(8000g)10min，取上清，置冰上待測(cè)。分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至470nm，蒸餾水調(diào)零。POD檢測(cè)工作液(在試劑1中加入14μL試劑2和9.5μL試劑3，混勻)在25℃水浴10min以上。加入10μL待測(cè)液和190μL工作液于微量石英比色皿中，在分光光度計(jì)470nm下測(cè)定吸光值，每隔1min讀數(shù)1次，共測(cè)4min，取平均值，以每分鐘A470變化0.01為1個(gè)酶活單位(U)。

超氧化物歧化酶（SOD）活性采用SOD試劑盒測(cè)定。將各處理針葉0.1g加入1.0mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，4℃冷凍離心(8000g)10min，取上清，置冰上待測(cè)。分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm。將試劑1和試劑2按照200∶1的比例混勻配制為工作液，試劑3蒸餾水稀釋50倍，試劑45mL蒸餾水溶解。依次在微量石英比色皿中加入10μL待測(cè)液(測(cè)定管，對(duì)照管內(nèi)加入10μL蒸餾水)、10μL試劑3、160μL工作液、20μL試劑4。充分混勻，室溫靜置30min后，450nm處測(cè)定各管吸光值。

過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用CAT試劑盒測(cè)定。將各處理針葉0.1g加入1.0mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，4℃冷凍離心(8000g)10min，取上清，置冰上待測(cè)。分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至240nm，蒸餾水調(diào)零。CAT檢測(cè)工作液在25℃水浴10min以上，迅速加入10μL待測(cè)液和190μL工作液于微量石英比色皿中，在分光光度計(jì)240nm下測(cè)定吸光值，每隔1min讀數(shù)1次，共測(cè)4min，取平均值，以每分鐘A240變化0.01為1個(gè)酶活單位(U)。

脂氧合酶（LOX）活性采用LOX試劑盒測(cè)定。將各處理針葉0.1g加入1mL試劑1進(jìn)行冰浴勻漿，4℃冷凍離心(16000g)20min，取上清，置冰上待測(cè)。分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到280nm，蒸餾水調(diào)零。CAT檢測(cè)工作液（試劑3中加入10mL試劑2，振蕩混勻1min）在30℃水浴10min以上。依次在微量石英比色皿中加入20μL待測(cè)液（測(cè)定管，對(duì)照管內(nèi)加入20μL蒸餾水）和180μL工作液，30℃反應(yīng)30min后，280nm處測(cè)定各管吸光值。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性采用PAL試劑盒測(cè)定。將各處理針葉0.1g加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，4℃冷凍離心(10000g)10min，取上清，置冰上待測(cè)。分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至290nm，蒸餾水調(diào)零。試劑2加入4mL蒸餾水充分溶解待用。依次在測(cè)定管（96孔UV板）中加入5μL待測(cè)液、145μL試劑1、40μL試劑2，在對(duì)照管（96孔UV板）中加入150μL試劑1、40μL試劑2，混勻，30℃準(zhǔn)確反應(yīng)30min，再分別加入10μL試劑3，混勻，靜置10min后，290nm處記錄測(cè)定各管吸光值。

1.2.2 可溶性蛋白和丙二醛（MDA）含量測(cè)定 可溶性蛋白含量采用蛋白含量測(cè)定試劑盒測(cè)定。將各處理針葉0.1g加入1.0mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，4℃冷凍離心(10000g)10min，取上清，置冰上待測(cè)。分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到562nm，蒸餾水調(diào)零?？扇苄缘鞍缀繙y(cè)定工作液（試劑A和B按照50∶1的比例混合，蓋緊后充分混勻）置于60℃水浴預(yù)熱30min。依次在微量石英比色皿中加入4μL待測(cè)液（測(cè)定管；對(duì)照管內(nèi)加入4μL蒸餾水；標(biāo)準(zhǔn)管內(nèi)加入4μL標(biāo)準(zhǔn)品）、200μL工作液?；靹蚝笾糜?0℃保溫30min，于562nm處測(cè)定各管吸光值。

MDA含量采用MDA含量試劑盒測(cè)定。將各處理針葉0.1g加入1.0mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，4℃冷凍離心(8000g)10min，取上清，置冰上待測(cè)。將試劑170℃加熱并振蕩以促進(jìn)溶解，吸取0.3mL試劑1于1.5mL離心管中，再加入0.1mL待測(cè)液，混勻。95℃水浴中保溫30min，置于冰浴中冷卻，25℃離心(10000g)10min。吸取200μL上清液于微量石英比色皿中，測(cè)定532nm和600nm處的吸光值。

1.2.3 類(lèi)黃酮和甜菜堿含量測(cè)定 類(lèi)黃酮含量采用植物類(lèi)黃酮試劑盒測(cè)定。將各處理樣本針葉烘干至恒重，粉碎，過(guò)40目篩之后，稱(chēng)取0.02g，加入2mL提取液，60℃振蕩提取2h，25℃離心(10000g)10min，取上清待測(cè)。分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至510nm，蒸餾水調(diào)零。在微量石英比色皿中加入108μL待測(cè)液（測(cè)定管，空白管內(nèi)加入108μL蒸餾水）、6μL試劑1，混勻，25℃靜置6min，再加入6μL試劑2，混勻，25℃靜置6min，再加入80μL試劑3，混勻，25℃靜置15min，測(cè)定510nm處各管吸光值。

甜菜堿含量采用甜菜堿試劑盒測(cè)定。將各處理樣本針葉烘干至恒重，粉碎，過(guò)40目篩之后，稱(chēng)取0.02g，加0.8mL水，置于60℃提取30min，期間不斷震蕩。再加入200μL提取液，混勻后25℃離心(10000g)10min，取上清液待測(cè)。分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至525nm。將試劑1每瓶加20mL蒸餾水溶解，加390μL濃鹽酸調(diào)pH值為1。在測(cè)定管中加入300μL待測(cè)液，空白管內(nèi)加入300μL蒸餾水，各加入500μL試劑1，充分混勻，4℃中反應(yīng)2h，25℃離心(12000g)10min，棄上清液。各加入500μL 99%乙醚，混勻后25℃離心(12000g)10min，棄上清液。置于通風(fēng)櫥使殘余乙醚自然揮發(fā)干凈。再各加入300μL 70%丙酮，震蕩使沉淀充分溶解，取200μL于96孔板，記錄各管在525nm處吸光值。

1.2.4 游離水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）含量測(cè)定 SA含量采用SA測(cè)定試劑盒測(cè)定：稱(chēng)取0.3g樣本，放入研缽中磨碎，加入1.0mL預(yù)冷的90%甲醇水溶液，4℃浸提過(guò)夜。離心（8000g）10min，取上清液，殘?jiān)?.5mL 90%甲醇水溶液浸提2h，離心后取出上清液，合并兩次上清，40℃減壓蒸發(fā)至不含有機(jī)相（0.3mL水溶液），加入20μL 1mg·mL-1三氯乙酸水溶液，混勻震蕩1min。加入1mL的乙酸乙酯與環(huán)己烷的混合液[1∶1（v/v）]萃取兩次，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相至新的EP管，氮吹吹干，加入0.5mL流動(dòng)相溶解，混勻，針頭式過(guò)濾器過(guò)濾后待測(cè)，檢測(cè)結(jié)果是植物樣本中游離SA。開(kāi)啟電腦、檢測(cè)器和泵，安裝上色譜柱，打開(kāi)軟件，在方法組中設(shè)置進(jìn)樣量10μL，流速0.8mL·min-1，柱溫30℃，保留時(shí)間40min，熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)294nm，發(fā)射波長(zhǎng)426nm，設(shè)置完畢保存方法組。用流動(dòng)相過(guò)柱子，待基線(xiàn)穩(wěn)定后開(kāi)始加樣。

JA含量采用JA試劑盒測(cè)定。稱(chēng)取0.3g樣本，加入1mL試劑1研磨成漿，加入1.0mL試劑2，震蕩混勻后移入EP管內(nèi)，超聲提取30min，離心（8000g）10min，取出上清液，殘?jiān)屑尤?.3mL提取液，復(fù)提1次，合并兩次上清液，氮吹儀上冰浴吹至不含有機(jī)相，水相用試劑6萃取脫色3次，除去有機(jī)相調(diào)節(jié)pH值為2.5～3.0，試劑7萃取3次，氮?dú)獯蹈伞＜尤?00μL試劑3復(fù)溶，加入20μL試劑4，混勻后25℃常溫放置30min。加入20μL試劑5，混勻后25℃常溫放置30min。冰水水浴中氮?dú)獯蹈?。加?.5mL流動(dòng)相復(fù)溶，取適量溶液用針頭式過(guò)濾器過(guò)濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶?jī)?nèi)待測(cè)。HPLC液相條件：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%磷酸水溶液，等度洗脫，（60%的A+40%的B）。開(kāi)啟電腦、檢測(cè)器和泵，安裝上色譜柱，打開(kāi)軟件，在方法組中設(shè)置進(jìn)樣量10μL，流速0.8mL·min-1，柱溫30℃，走樣時(shí)間為40min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為210nm，設(shè)置完畢保存方法組。用流動(dòng)相過(guò)柱子，待基線(xiàn)穩(wěn)定后開(kāi)始加樣。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SPSS 22.0軟件做ANOVA單因素方差分析及差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染松材線(xiàn)蟲(chóng)不同發(fā)病時(shí)期的抗氧化酶活性變化

4種抗氧化酶在受害前期、受害后期和健康對(duì)照組的活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。POD活性從小到大依次為：對(duì)照組[(43.05±5.23)U·g-1]、受害前期[(51.51±6.14)U·g-1]、受害后期[(86.30±9.38)U·g-1]。受害前期較對(duì)照組POD活性升高19.66%，但無(wú)顯著性差異；受害后期較對(duì)照組升高100.46%，差異性極顯著（p＜0.01）；受害后期較受害前期升高67.52%，差異性極顯著（p＜0.01）（圖1A）。SOD活性從小到大依次為：受害前期[(700.31±76.50)U·g-1]、受害后期[(829.57±93.14)U·g-1]、對(duì)照組[(893.10±24.17)U·g-1]。受害前期較對(duì)照組下降21.58%，差異性顯著（p＜0.05）；受害后期較受害前期升高18.45%，但無(wú)顯著性差異；受害后期較對(duì)照組下降7.11%，亦無(wú)顯著性差異；受害后期較受害前期升高18.45%，同樣無(wú)顯著性差異（圖1B）。CAT活性從小到大依次為：受害前期[(44.67±4.37)U·g-1]、受害后期[(56.59±6.56)U·g-1]、對(duì)照組[(67.84±8.04)U·g-1]。受害前期較對(duì)照組下降34.15%，差異性極顯著（p＜0.01）；受害后期較對(duì)照組下降16.58%，但無(wú)顯著性差異；受害后期較受害前期升高26.68%，亦無(wú)顯著性差異（圖1C）。LOX活性從小到大依次為：受害前期[(10.59±1.36)U·g-1]、對(duì)照組[(11.46±0.85)U·g-1)、受害后期[(13.45±1.80)U·g-1）。受害前期較對(duì)照組下降7.64%，但無(wú)顯著性差異；受害后期較對(duì)照組升高17.32%，亦無(wú)顯著性差異；受害后期較受害前期升高27.04%，差異性顯著（p＜0.05）（圖1D）。

圖1 油松針葉在不同受害時(shí)期抗氧化酶活性Figure 1 Antioxidant enzyme activity of Pinus tabulae formis needles at different injury stages

2.2 感染松材線(xiàn)蟲(chóng)不同發(fā)病時(shí)期的PAL活性

PAL在受害前期、受害后期和健康對(duì)照組的活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。PAL活性從小到大依次為：受害后期[(41.31±5.28)U·g-1]、受害前期[(59.13±6.26)U·g-1]、對(duì)照組[(66.04±8.09)U·g-1]。受害前期較對(duì)照組下降10.47%，但無(wú)顯著性差異；受害后期較對(duì)照組下降37.44%，差異性極顯著（p＜0.01）；受害后期較受害前期下降30.13%，差異性顯著（p＜0.05）（圖2）。

圖2 油松針葉在不同受害時(shí)期PAL活性Figure 2 Activities of PAL in needles of Pinus tabulaeformis at different injury stages

2.3 感染松材線(xiàn)蟲(chóng)病不同時(shí)期的可溶性蛋白和MDA含量

可溶性蛋白和MDA在受害前期、受害后期和健康對(duì)照組的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。Spr含量從小到大依次為：對(duì)照組[(43.31±4.75)mg·g-1]、受害前期[(52.11±6.14)mg·g-1]、受害后期[(57.34±3.70)mg·g-1]。受害前期較對(duì)照組升高20.31%，但無(wú)顯著性差異；受害后期較對(duì)照組升高32.39%，差異性顯著（p＜0.05）；受害后期較受害前期升高10.04%，但無(wú)顯著性差異（圖3A）。MDA含量從小到大依次為：對(duì)照組[(14.30±1.71)nmol·g-1]、受害后期[(18.17±1.62)nmol·g-1]、受害前期[(23.74±2.78)nmol·g-1]。受害前期較對(duì)照組升高65.98%，差異性極顯著（p＜0.01）；受害后期較對(duì)照組升高27.07%，但無(wú)顯著性差異；受害后期較受害前期下降23.44%，差異性顯著（p＜0.05）（圖3B）。

圖3 油松針葉在不同受害時(shí)期Spr、MDA含量Figure 3 Content of Spr and MDA in needles of Pinus tabulae formis at different injury stages

2.4 感染松材線(xiàn)蟲(chóng)不同發(fā)病時(shí)期的類(lèi)黃酮、甜菜堿含量

類(lèi)黃酮和甜菜堿在受害前期、受害后期和健康對(duì)照組的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。類(lèi)黃酮含量從小到大依次為：受害后期[(16.60±2.15)mg·g-1]、對(duì)照組[(19.23±1.96)mg·g-1]、受害前期[(26.34±3.33)mg·g-1]。受害前期較對(duì)照組升高37.01%，差異性顯著（p＜0.05）；受害后期較對(duì)照組降低13.66%，但無(wú)顯著性差異；受害后期較受害前期下降36.99%，差異性極顯著（p＜0.01）（圖4A）。甜菜堿含量從小到大依次為：對(duì)照組[(4.71±0.58)mg·g-1]、受害后期[(5.41±0.68)mg·g-1]、受害前期[(6.54±0.84)mg·g-1]。受害前期較對(duì)照組升高38.87%，差異性顯著（p＜0.05）；受害后期較對(duì)照組升高17.89%，但無(wú)顯著性差異；受害后期較受害前期下降17.27%，亦無(wú)顯著性差異（圖4B）。

圖4 油松針葉在不同受害時(shí)期類(lèi)黃酮、甜菜堿含量Figure 4 Content of flavonoid and betaine in the needles of Pinus tabulae formis at different injury stages

2.5 感染松材線(xiàn)蟲(chóng)不同發(fā)病時(shí)期的SA和JA含量

SA和JA在受害前期、受害后期和健康對(duì)照組的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。SA含量從小到大依次為：對(duì)照組[(120.04±24.36)ng·g-1]、受害前期[(256.02±21.11)ng·g-1]、受害后期[(467.75±47.84)ng·g-1]。受害前期較對(duì)照組升高135.99%，差異性極顯著（p＜0.01）；受害后期較對(duì)照組升高347.71%，差異性極顯著（p＜0.01）；受害后期較受害前期升高211.73%，差異性極顯著（p＜0.01）（圖5A）。JA含量從小到大依次為：對(duì)照組[(1.82±0.33)μg·g-1]、受害前期[(2.06±0.22)μg·g-1]、受害后期[(2.45±0.11)μg·g-1]。受害前期較對(duì)照組升高13.48%，但無(wú)顯著性差異；受害后期較對(duì)照組升高34.97%，差異性顯著（p＜0.05）。受害后期較受害前期升高18.94%，亦無(wú)顯著性差異（圖5B）。

圖5 油松針葉在不同受害時(shí)期SA、JA含量Figure 5 Content of SA and JA in needles of Pinus tabulaefor mis at different injury stages

3 討論與結(jié)論

植物在逆境脅迫下體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），如果在植物體內(nèi)沒(méi)有及時(shí)被清除，將會(huì)對(duì)植物體的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生極其嚴(yán)重的毒害作用，為維持正常的生長(zhǎng)，植物將會(huì)通過(guò)抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化劑對(duì)其進(jìn)行清除[20]。CAT、POD、SOD是植物體內(nèi)主要的活性氧清除酶，它們的變化可以反映植物的抗逆性[21]。本試驗(yàn)中，油松大樹(shù)受松材線(xiàn)蟲(chóng)感染后，在受害前期SOD、CAT含量均顯著性下降，這與黑松及濕地松幼苗接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后在12～72h的變化趨勢(shì)一致[22]。此結(jié)果表明，油松大樹(shù)受松材線(xiàn)蟲(chóng)感染后，SOD、CAT活性受到抑制，致使抗氧化酶活性降低。POD一般被認(rèn)為是植物體重要的抗病酶，但研究表明，脅迫條件下POD活性快速升高，對(duì)植物自身有傷害作用[23]。油松大樹(shù)受松材線(xiàn)蟲(chóng)感染后，POD活性持續(xù)上升，這與黑松、馬尾松、火炬松幼苗上接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后，48h 3種松樹(shù)針葉內(nèi)POD活性迅速上升，并在96h出現(xiàn)第2次高峰的結(jié)果一致[24]。嚴(yán)東輝等[25]發(fā)現(xiàn)松材線(xiàn)蟲(chóng)的體外酶有POD，因此，其活性的持續(xù)升高可能也與松材線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量的增多有關(guān)。MDA是膜脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一，表示膜脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。本試驗(yàn)中油松大樹(shù)受松材線(xiàn)蟲(chóng)感染后，受害前期MDA含量極顯著性提高，與黑松幼苗接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后，在12～72h的變化趨勢(shì)一致[22]。MDA含量的增加表示著細(xì)胞膜脂質(zhì)的過(guò)氧化程度加重，這可能是由于在受害前期SOD、CAT含量顯著性下降所引起的。在受害后期雖然SOD、CAT含量有所升高，MDA含量有所下降，但膜脂過(guò)氧化已經(jīng)導(dǎo)致薄壁細(xì)胞受損嚴(yán)重并大量死亡，油松小枝的生長(zhǎng)勢(shì)逐漸下降，趨于死亡。

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白的增加和積累能提高植物細(xì)胞的保水能力，高濃度的可溶性蛋白能維持較低的滲透勢(shì)，幫助植物抵抗環(huán)境脅迫，保護(hù)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜活性[12]。本試驗(yàn)中油松大樹(shù)受松材線(xiàn)蟲(chóng)感染后，可溶性蛋白含量持續(xù)增高，這與4～5年生黑松、馬尾松在接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后3～7d可溶性蛋白含量增高趨勢(shì)一致[26]。在受害前期可能是由于松材線(xiàn)蟲(chóng)脅迫致使油松出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，可溶性蛋白含量陡然升高，用以增加細(xì)胞的滲透勢(shì)來(lái)抵御不良環(huán)境。受害后期可溶性蛋白含量雖然有所增加但與受害前期沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），這個(gè)結(jié)果和4～5年生黑松接種松材線(xiàn)蟲(chóng)7d后可溶性蛋白開(kāi)始下降并于15d后低于對(duì)照[26]的結(jié)論不一致，原因可能是油松大樹(shù)分泌可溶性蛋白的應(yīng)激反應(yīng)時(shí)間更長(zhǎng)，但單純通過(guò)提高可溶性蛋白的含量并不能有效地抵御松材線(xiàn)蟲(chóng)帶來(lái)的傷害。植物體內(nèi)類(lèi)黃酮化合物有驅(qū)蟲(chóng)、抗病菌、抗氧化、視覺(jué)吸引等功效，謝佳璇[27]研究表明，葉片中總類(lèi)黃酮含量與葉片提取物的抗氧化活性呈顯著正相關(guān)。甜菜堿是一種廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)維持細(xì)胞穩(wěn)定的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。在逆境條件下，植物體通過(guò)大量積累甜菜堿來(lái)降低滲透脅迫對(duì)細(xì)胞膜的損傷，保護(hù)三羧酸循環(huán)過(guò)程中主要酶的活性，穩(wěn)定多肽在光合作用中的功能[11,28]，從而提高植物適應(yīng)不良環(huán)境的能力。葉施和根施外源甜菜堿均能減少葉片相對(duì)膜透性和MDA含量的升高，顯著提高SOD、POD、CAT的活性[29]。本試驗(yàn)中，類(lèi)黃酮和甜菜堿含量均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，這與濕地松、黑松幼苗接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后類(lèi)黃酮含量先增加后下降的趨勢(shì)相同[30]。這樣的變化趨勢(shì)與SOD、CAT、LOX酶活性的變化趨勢(shì)呈負(fù)相關(guān)，與MDA含量變化趨勢(shì)呈正相關(guān)，表明松材線(xiàn)蟲(chóng)感染油松大樹(shù)后，SOD、CAT、LOX等抗氧化酶活性受到了抑制，油松通過(guò)增加可溶性蛋白、類(lèi)黃酮、甜菜堿等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和次生代謝物質(zhì)來(lái)抵御松材線(xiàn)蟲(chóng)的造成的傷害。在受害后期，SOD、CAT、POD、LOX活性均有所增強(qiáng)以祛除多余的活性氧，可溶性蛋白雖有所增加，但和受害前期沒(méi)有顯著性差異，甜菜堿含量有所下降，類(lèi)黃酮含量更是顯著性下降。苯丙氨酸解氨酶（PAL）與植物次生物質(zhì)木質(zhì)素、黃酮類(lèi)色素、異黃酮類(lèi)植保素的合成相關(guān)，在植物抵御病蟲(chóng)侵害過(guò)程中起重要作用。編碼轉(zhuǎn)錄因子MYB15的基因與JA應(yīng)答松材線(xiàn)蟲(chóng)有關(guān)，MYB15通過(guò)調(diào)節(jié)木質(zhì)素生物合成來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的抗性[31]。SA和JA是植物體抗蟲(chóng)和病原菌的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[13]。植物在受到生物或非生物刺激后，體內(nèi)LOX活性劇增，JA含量也開(kāi)始增加，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)，同時(shí)誘發(fā)植物產(chǎn)生生理生化上的變化，形成防御性結(jié)構(gòu)[32-33]。JA信號(hào)在控制對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)感染的防御反應(yīng)中很重要，并且通過(guò)正調(diào)節(jié)劑和負(fù)調(diào)節(jié)劑的協(xié)調(diào)表達(dá)進(jìn)行微調(diào)[31]。SA作為JA下游信號(hào)分子，與JA協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，共同激發(fā)植物的抗性反應(yīng)[34]。也有研究表明，松材線(xiàn)蟲(chóng)感染白皮松致使SA的含量升高，并導(dǎo)致整個(gè)樹(shù)體的抗性反應(yīng)[35]。本試驗(yàn)中，油松大樹(shù)受到松材線(xiàn)蟲(chóng)感染后，針葉內(nèi)SA、JA的含量均持續(xù)性升高，這與馬尾松感病無(wú)性系接種松材線(xiàn)蟲(chóng)1～15d內(nèi)SA、JA持續(xù)上升的變化趨勢(shì)相同[36]。周文楠等[37]發(fā)現(xiàn)，JA衍生物水楊酸甲酯（MeJA）可以促進(jìn)酚類(lèi)物質(zhì)和細(xì)胞壁的合成，激活防御和編碼脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)PAL、POD和其他抗病相關(guān)酶的活性。本試驗(yàn)中，SOD、CAT、LOX、PAL活性在受害前期都表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，SOD、CAT、LOX在受害后期都表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，但PAL卻始終表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，這與馬尾松接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后PAL從植株出現(xiàn)癥狀后開(kāi)始下降的結(jié)果一致[22,24]。導(dǎo)致松樹(shù)最終死亡的原因是否與PAL活性持續(xù)下降有關(guān)，值得進(jìn)一步探討。

綜上，松材線(xiàn)蟲(chóng)侵入油松，會(huì)抑制SOD、CAT、LOX等抗氧化酶活性的表達(dá)，產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)MDA等。油松自身也通過(guò)增加可溶性蛋白、類(lèi)黃酮、甜菜堿等物質(zhì)的含量抵御松材線(xiàn)蟲(chóng)的侵染。內(nèi)源激素SA、JA持續(xù)性增加，協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，共同激發(fā)油松的抗逆反應(yīng)。在松樹(shù)抵御松材線(xiàn)蟲(chóng)失敗后，松材線(xiàn)蟲(chóng)突破寄主的防御系統(tǒng)，最終導(dǎo)致松樹(shù)整株感病死亡。目前，在遼寧省防控松材線(xiàn)蟲(chóng)的嚴(yán)峻形勢(shì)下，研究油松在感染松材線(xiàn)蟲(chóng)之后的相關(guān)抗性生理指標(biāo)變化規(guī)律可以為進(jìn)一步研究其抗病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。