過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖底泥硝化作用、氨氧化微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)的影響

趙 珍, 王寶杰, 劉 梅, 4, 蔣克勇, 王 雷, 4

過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖底泥硝化作用、氨氧化微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)的影響

趙 珍1, 3, 王寶杰1, 2, 劉 梅1, 2, 4, 蔣克勇1, 2, 王 雷1, 2, 4

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋大科學(xué)中心, 山東 青島 266071; 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 4. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237)

采用在模擬池塘中投放過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物(KMPS)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)的方法, 探究KMPS對(duì)養(yǎng)殖底質(zhì)硝化作用的影響。通過(guò)對(duì)氨氮和亞硝態(tài)氮含量的檢測(cè), 探究對(duì)不同時(shí)期氮素轉(zhuǎn)化的影響, 低頻率高劑量投放組中的氨氮和亞硝態(tài)氮含量顯著降低, 而高頻率低劑量組中氨氮和亞硝態(tài)氮的含量顯著上升。高頻率低劑量KMPS的投放使氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細(xì)菌(AOB)豐度降低, 而低頻率高劑量KMPS的投放不會(huì)造成豐度降低, 而且還表現(xiàn)出部分時(shí)期AOB豐度的上升。進(jìn)一步對(duì)群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)KMPS的投放使AOA群落中屬相對(duì)豐度降低,屬的相對(duì)豐度上升, 這種相對(duì)豐度的變化與KMPS的投放方式無(wú)關(guān); 但AOB群落受到KMPS投放方式的影響, 低頻率高劑量的KMPS投放下AOB群落優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)豐度顯著提高。以上結(jié)果均說(shuō)明低頻率高劑量KMPS的投放起到了促進(jìn)底質(zhì)硝化作用的效果。同時(shí), 可為KMPS用于對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘底質(zhì)改良開(kāi)辟一個(gè)新的途徑。

過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物; 硝化作用;基因豐度; 微生物群落結(jié)構(gòu)

對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)不僅為人類提供優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源, 而且還是全球水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)值增長(zhǎng)的主要推動(dòng)力。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的集約化發(fā)展, 越來(lái)越多的養(yǎng)殖污染問(wèn)題隨著而來(lái), 其中一個(gè)主要的問(wèn)題就是養(yǎng)殖過(guò)程中含氮化合物的積累。這些含氮化合物包括有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮(氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽), 主要來(lái)源于蝦類排泄物和未被食用的飼料[1]。在集約化養(yǎng)殖中被大量使用的肥料和補(bǔ)充飼料都是含氮量很高的有機(jī)物質(zhì), 但這些物質(zhì)中只有15%～30% 能夠被蝦吸收利用, 其余未被吸收和利用的部分會(huì)沉積在養(yǎng)殖池塘底部的水?泥界面。沉積物中過(guò)量的氮不僅會(huì)破壞水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境, 對(duì)養(yǎng)殖生物產(chǎn)生毒害, 而且排放還會(huì)影響周圍水體[2]。因此去除沉積物中多余的氮是非常重要的。

硝化作用是生態(tài)系統(tǒng)氮素循環(huán)過(guò)程中的一個(gè)重要過(guò)程, 整個(gè)過(guò)程包括兩個(gè)步驟, 氨氧化和亞硝酸鹽氧化。其中氨氧化是硝化反應(yīng)的第一步也是限速步驟, 該步驟由氨氧化微生物?氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細(xì)菌(AOB)共同介導(dǎo)進(jìn)行。該步驟中起重要作用的酶——氨單加氧酶(ammonia monooxygenase, AMO)由A、B、C三個(gè)亞基組成, 其中編碼A亞基的基因具有一定序列保守性, 為所有氨氧化微生物共有的基因, 因此常被作為分子標(biāo)記應(yīng)用于氨氧化微生物的研究[3-5]。氮素濃度、溫度、鹽度等環(huán)境因子的變化以及施肥和化學(xué)物質(zhì)干擾等都可能引起AOA和AOB的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的變化[6-8]。

長(zhǎng)期以來(lái)圍繞著氮素污染防治進(jìn)行了大量的研究, 過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物2KHSO5·KHSO4·K2SO4(KMPS)溶于水后發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng), 產(chǎn)生活性氧, 羥基自由基、硫酸自由基等多種活性成分[9], 廣泛的用作水產(chǎn)中的消毒劑使用。KMPS可以降解多種有機(jī)物, 并且可以將NH4+氧化為亞硝酸, 因此可用于降低池塘中氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有害物質(zhì)的濃度, 用于養(yǎng)殖水體的治理和底質(zhì)改造[10]。目前KMPS在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究多集中作為消毒劑對(duì)水產(chǎn)致病菌的抑菌作用[11], 而其對(duì)底質(zhì)氮素污染防治的研究有所欠缺。本研究通過(guò)對(duì)表層底泥中氨氮、亞硝態(tài)氮水平變化進(jìn)行檢測(cè), 分析KMPS對(duì)氮素含量的影響, 并通過(guò)qPCR, 16s高通量測(cè)序等分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)底泥中AOA和AOB數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析, 以期揭示KMPS對(duì)硝化作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及養(yǎng)殖管理

實(shí)驗(yàn)在中國(guó)山東省東營(yíng)市黃河三角洲海洋科技有限公司研發(fā)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行, 從8月3日至9月14日共進(jìn)行6周, 為模擬封閉池塘的養(yǎng)殖環(huán)境, 準(zhǔn)備9個(gè)柱形養(yǎng)殖桶(500 L), 桶內(nèi)鋪設(shè)10 cm新鮮底泥, 覆入鹽度為34的海水靜置24 h后使用。實(shí)驗(yàn)所用的凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖至重量0.3 g, 體長(zhǎng)1.5 cm后被隨機(jī)分配至每桶300只對(duì)蝦。暫養(yǎng)1周之后將9個(gè)養(yǎng)殖桶分成3個(gè)組, 分別為: 處理組A為高頻率低劑量組: 以5 g/m3的劑量, 每2周投放3次KMPS; 處理組B為低頻率高劑量組: 以15 g/m3的劑量, 每2周投放1次KMPS; 對(duì)照組C: 除日常養(yǎng)殖管理外不進(jìn)行其他處理。養(yǎng)殖期間, 每日按體重的8%, 分別于6: 00 am、12: 00 am、6: 00 pm、12: 00 pm投喂商品飼料。每周少量換水10 cm, 本研究使用的KMPS為片劑, 由山東嘉源環(huán)?？萍加邢薰咎峁? 純度為100%。

1.2 樣品的采集及前處理

使用自制的采集器采集0.5～2 cm的表層底泥[12], 分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集1次, 實(shí)驗(yàn)期間每周采集1次。采集的底泥樣品一部分用于氨氮、亞硝氮檢測(cè), 另一部分迅速置于液氮中保存, 之后送回實(shí)驗(yàn)室保存在?80 ℃冰箱待之后的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分析使用。

1.3 氨氮、亞硝態(tài)氮的測(cè)定

取5 g新鮮樣品置于50 mL離心管中, 加入25 mL, 2 mol/L的 KCl溶液, 25 ℃搖床浸提1 h, 之后泥漿經(jīng)3 000 r離心10 min, 取上清液測(cè)定營(yíng)養(yǎng)鹽含量。按照海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)采用次溴酸鹽氧化法、萘乙二胺分光光度法分別檢測(cè)氨氮和亞硝酸鹽濃度[13]。

1.4 DNA的提取和PCR擴(kuò)增

采用Fast DNA Spin Kit For soil(MPbio), 美國(guó)試劑盒進(jìn)行底泥樣品中微生物DNA提取, 具體操作步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。在下一步分析前將提取的基因組DNA儲(chǔ)存在?20 ℃。提取后的DNA的濃度和質(zhì)量分別使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。選用引物Arch-amoA26F (5′-GACTACATMTTCTAYACWGAYTGGGC-3′)和Arch-amoA417R(5′-GGKGTCATRTATGGWGGYAAYGTTGG-3′)擴(kuò)增AOA-基因; 引物amoA1F (5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)和amoA2R(5′- CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)擴(kuò)增AOB-基因。PCR反應(yīng)體系為: 5×反應(yīng)buffer 5 μL, 5×GC buffer 5 μL, dNTP(2.5mmol·L–1)2 μL, 上游和下游引物各(10 μmol·L–1)1 μL, DNA 模板2 μL, ddH2O 8.75 μL,Q5 DNA 聚合酶0.25 μL; 反應(yīng)程序: 98 ℃ 2 min, 98 ℃ 15 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 72 ℃ 5 min, 共進(jìn)行35個(gè)循環(huán), 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 熒光定量PCR

將上述PCR產(chǎn)物回收, 連接至pMD18-T載體, 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中, 用含有Amp+的LB瓊脂平板培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆, 并對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序分析, 分別提取含AOA-和AOB-基因的質(zhì)粒, 用NanoDrop2000(Thermo) 測(cè)定質(zhì)粒濃度, 計(jì)算AOA和AOB基因拷貝數(shù), 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行一系列10倍濃度稀釋(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒范圍AOA-102～108, AOA-10～106)用于構(gòu)建qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。各標(biāo)準(zhǔn)曲線2均超過(guò)0.99, 在本研究使用的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。使用 TransStar Top Green qRT- PCR Supermix(北京全式金生物科技有限公司)試劑盒進(jìn)行AOA 和AOB基因豐度測(cè)定, 具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 Illumina MiSeq高通量測(cè)序及分析

采用Illumina平臺(tái)對(duì)群落DNA片段進(jìn)行雙端(paired-end)測(cè)序。利用 QIIME(QIIME, v1.8.0)軟件進(jìn)行DADA2對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾、降噪和去除嵌合體獲得高質(zhì)量序列[14]。高質(zhì)量序列通過(guò)UCLUST軟件按照97%的序列同源性聚集成操作分類單元(OTUs)[15]。序列數(shù)據(jù)分析主要使用QIIME和R包(v3.2.0)基于OUT表計(jì)算alpha多樣性指數(shù), 以Chao1[16]和Observed species指數(shù)表征豐富度, 以Shannon[17]和Simpson[18]指數(shù)表征多樣性。通過(guò)OUT表計(jì)算不同樣本在各分類水平所含有的分類單元的數(shù)目, 實(shí)現(xiàn)所有樣本在各分類水平上組成分布的可視化, 以堆疊柱狀圖呈現(xiàn)分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用SPSS 25.0(IBM Corp, Armonk, NY, USA)統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素變量方差分析方法(One-Way ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以<0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 底泥中氨氮及亞硝態(tài)氮含量變化

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的氨氮及亞硝態(tài)氮變化如圖1a和圖1b所示, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間各組的氨氮和亞硝氮均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。處理組B中的氨氮和亞硝氮在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間處于較低水平并且低于其他2組。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的前2周, 對(duì)照組C中的氨氮水平高于2個(gè)處理組, 隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行, 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組B中的氨氮含量先上升后下降, 而實(shí)驗(yàn)組A中的氨氮含量持續(xù)上升。對(duì)于亞硝氮, 前2周各組的水平與氨氮相似, 在對(duì)照組中最高。從第3周開(kāi)始處理組A中的亞硝氮濃度快速上升, 迅速超過(guò)對(duì)照組C和處理組B。

圖1 不同處理組中氨氮(a)亞硝氮(b)濃度變化

注: C: 對(duì)照組; A: 高頻率低劑量組; B: 低頻率高劑量組

在實(shí)驗(yàn)剛開(kāi)始的前兩周, 與對(duì)照組相比兩個(gè)處理組的氨氮和亞硝氮的含量均下降, 證明KMPS的投放能夠降低底泥中氨氮和亞硝氮的含量, 一方面可能是因?yàn)镵MPS對(duì)含氮有機(jī)物的降解, 使進(jìn)入硝化作用的含氮有機(jī)物減少, 從而使氨氮和亞硝氮的含量降低, 另一方面KMPS的強(qiáng)氧化作用改善了底泥中的氧化還原狀態(tài), 并且還能夠釋放氧氣, 進(jìn)一步促進(jìn)了硝化作用。但是處理組A以少量多次進(jìn)行KMPS的持續(xù)性的投放, 卻沒(méi)有使氨氮和亞硝氮降低, 反而高于對(duì)照組中氨氮和亞硝氮的含量。推測(cè)持續(xù)性的KMPS的投放可能對(duì)硝化作用微生物存在持續(xù)的抑制。硝化作用無(wú)法順利進(jìn)行, 造成氨氮和亞硝氮的積累。

2.2 AOA和AOB微生物豐度變化

氨單加氧酶基因的豐度可以用來(lái)表征環(huán)境中氨氧化微生物的數(shù)量, AOA-基因拷貝數(shù)為2.3×104～3.31×105copies·g–1, AOB-基因拷貝數(shù)為1.48×103～2.68×104copies·g–1。同期的AOA-比AOB-基因拷貝數(shù)高1～2個(gè)數(shù)量級(jí), 此時(shí)環(huán)境中的AOA數(shù)量高于AOB。養(yǎng)殖的前2周處理組和對(duì)照組之間AOA-基因拷貝數(shù)沒(méi)有顯著性差異(圖2a)(>0.05), 第3周處理組B和對(duì)照組C中拷貝數(shù)上升, 顯著高于同期處理組A中該基因的拷貝數(shù)(<0.05)。之后各組的AOA-基因拷貝數(shù)均持續(xù)上升, 且處理組B和對(duì)照組C中基因拷貝數(shù)顯著高于同期處理組A中基因的拷貝數(shù)。除第4周對(duì)照組C中AOA-基因拷貝數(shù)顯著高于處理組B中外, 其余時(shí)期該基因拷貝數(shù)在2個(gè)組之間沒(méi)有顯著差異(>0.05)。各組AOB-基因拷貝數(shù)逐漸上升(圖2b), 前四周各組間沒(méi)有顯著差異(>0.05); 后兩周處理組B和對(duì)照組C中該基因的拷貝數(shù)顯著高于處理組A, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的處理組B中基因拷貝數(shù)最高, 隨后是對(duì)照組C(<0.05)。

2.3 高通量測(cè)序結(jié)果及AOA和AOB群落Alpha多樣性分析

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的3個(gè)組的9個(gè)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序分析, 平均每個(gè)樣品獲得高質(zhì)量的AOA基因序列78 344條, AOB基因序列52 568條。將以上獲得的序列按照97%的相似度進(jìn)行聚類, 分別輸出OTU代表序列。從表1的結(jié)果可以看出處理組A 的AOA和AOB的OUT數(shù)均顯著低于其他2個(gè)組(<0.05)。通過(guò)alpha多樣性指數(shù)對(duì)不同處理組的AOA和AOB微生物群落豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估。對(duì)照組C的AOA微生物群落的豐富度指數(shù)(Chao1和ACE指數(shù))顯著高于兩個(gè)處理組(<0.05), 但各組的多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson指數(shù))沒(méi)有顯著的差異(>0.05)。AOB微生物群落結(jié)果顯示處理組A的豐富度指數(shù)顯著低于對(duì)照組和處理組B, 多樣性指數(shù)各組間沒(méi)有顯著的差異(>0.05)。

注: 同一列內(nèi)標(biāo)有不同字母表示差異顯著(<0.05)

2.4 AOA和AOB群落物種組成分析

為了了解樣本中AOA和AOB群落的具體組成, 對(duì)抽平后的ASV/OTU表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算之后獲得每個(gè)樣本在屬水平組成和豐度分布表, 并以柱狀圖呈現(xiàn)分析結(jié)果。AOA群落組成如圖3a所示, 共有3個(gè)屬組成該群落, 分別為屬、屬和屬, 其中的優(yōu)勢(shì)屬(相對(duì)豐度>1%)是屬和屬, 分別占 AOA基因總序列的64.02%～91.05%和8.1%～27.4%。對(duì)照組C中s屬的相對(duì)豐度顯著高于處理組A和B (< 0.05), 在兩個(gè)處理組之間沒(méi)有顯著差異(>0.05)。而對(duì)照組C中的屬的相對(duì)豐度顯著低于處理組A和B, 同樣在2個(gè)處理組中沒(méi)有顯著差異。屬占AOA基因總序列的比例較低且在各組的相對(duì)豐度沒(méi)有顯著差異(>0.05)。AOB微生物群落共由6個(gè)屬組成(圖3b), 其中屬和屬為主要優(yōu)勢(shì)屬, 分別占 AOB基因總序列的39.5%～67.6%和10.7%～50.1%。與對(duì)照組相比處理組的屬的相對(duì)豐度顯著上升, 而處理組A中屬的相對(duì)豐度顯著下降(<0.05)。在2個(gè)處理組之間處理組B中屬和屬的相對(duì)豐度均顯著高于處理組A中(<0.05)。另外的4個(gè)屬占AOB基因總序列的比例較低且在各組的相對(duì)豐度沒(méi)有顯著差異(>0.05)。

注: MC 對(duì)照組; MA: 高頻率低劑量組; MB: 低頻率高劑量組

3 討論

養(yǎng)殖水體和底泥中的氨氮和亞硝氮是微生物利用含氮有機(jī)物進(jìn)行硝化作用過(guò)程中產(chǎn)生的重要中間產(chǎn)物, 可以作為判斷養(yǎng)殖環(huán)境好壞的重要指標(biāo)[12]。對(duì)蝦的排泄物、殘余的餌料等的腐爛性分解會(huì)沉積在水-底泥界面, 容易造成界面的缺氧狀態(tài)。硝化作用是需氧的氧化還原反應(yīng), 一定的氧含量是介導(dǎo)硝化作用的微生物進(jìn)行硝化作用所必須的[19]。沉積在水?泥界面的對(duì)蝦糞便、未利用的餌料等都是高含氮量的有機(jī)物, 致使底泥中氨氮和亞硝氮比水中高幾個(gè)數(shù)量級(jí)[20]。隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行各組的氨氮和亞硝氮含量均有不同程度的上升, 其中處理組A中氨氮和亞硝氮含量上升速度最快, 隨后是對(duì)照組C; 第3周開(kāi)始處理組A中的氨氮和亞硝氮含量持續(xù)高于對(duì)照組C和處理組B, 而且在處理組B中含量最低。這表明單次高劑量KMPS的投放, 可以有效的降低底泥中氨氮和亞硝氮的含量。這可能是因?yàn)镵MPS片劑在水?泥界面分解釋放氧氣, 促進(jìn)了硝化作用, 同理于過(guò)碳酸鈉的施用下分解釋放氧氣, 溶解氧的增加促進(jìn)氨氮的硝化作用, 進(jìn)而促進(jìn)了氮的循環(huán)[21]; 而且研究表明, KMPS可以直接與氨氮發(fā)生反應(yīng), 生成亞硝酸鹽; 另外KMPS在污泥處理中可以降解多種復(fù)雜的有機(jī)物[22], 對(duì)底泥中的有機(jī)物也可能存在同樣的作用。但是高頻率低劑量KMPS的投放反而不利于硝化作用, 可能是連續(xù)的投放對(duì)硝化作用微生物產(chǎn)生持續(xù)性的抑制作用, 導(dǎo)致中間產(chǎn)物氨氮和亞硝氮的積累。

氨氧化微生物介導(dǎo)的有機(jī)物氨氧化過(guò)程作為限速步驟, 在整個(gè)硝化作用中起到?jīng)Q定性的作用。驅(qū)動(dòng)氨氧化作用的微生物AOA和AOB廣泛分布于幾乎所有土壤、淡水、湖泊底泥和海洋環(huán)境中; 并且在許多環(huán)境中AOA比AOB更加豐富[23-26]。在我們實(shí)驗(yàn)環(huán)境中, AOA數(shù)量明顯高于AOB, 推測(cè)AOA在此環(huán)境下的硝化作用中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。隨著養(yǎng)殖地進(jìn)行, 介導(dǎo)氨氧化作用的AOA和AOB豐度均增長(zhǎng), 但同期高頻率低劑量KMPS投放組的AOA和AOB豐度顯著低于對(duì)照組, 表明高頻率低劑量KMPS的投放對(duì)二者存在部分抑制作用。養(yǎng)殖開(kāi)始的前兩周KMPS的投放沒(méi)有對(duì)AOA數(shù)量造成影響, 從第3周開(kāi)始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí), 期間處理組A中的AOA數(shù)量始終低于其他兩組, 表明高頻率低劑量的KMPS投放持續(xù)對(duì)AOA造成影響。KMPS在水中能夠在短時(shí)間內(nèi)快速分解, 對(duì)很多微生物產(chǎn)生抑制作用[11]。除第5周外, 對(duì)照組C和處理組B中AOA數(shù)量沒(méi)有顯著差異, 推測(cè)單次高劑量KMPS投放對(duì)AOA的抑制作用不持續(xù)存在, 隨著抑制的解除AOA可以恢復(fù)生長(zhǎng)和繁殖。與AOA相比AOB在養(yǎng)殖的前中期的較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)KMPS的投放并不敏感, 但從第4周開(kāi)始在投放頻率與投放量積累的雙重作用下, 處理組A中AOB數(shù)量顯著低于其余兩組。

與基因豐度檢測(cè)結(jié)果相似, alpha分析結(jié)果顯示, 處理組A中的AOA和AOB相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組C和處理組B, 表明高頻率低劑量的KMPS投放對(duì)AOA和AOB起到抑制的作用。AOA和AOB的多樣性在各組間沒(méi)有顯著差異, 表明KMPS投放與否以及投放的方式對(duì)氨氧化微生物的多樣性不產(chǎn)生影響。KMPS對(duì)不同種微生物可產(chǎn)生不同作用, 可對(duì)某些微生物產(chǎn)生抑制而對(duì)其他一些微生物無(wú)影響[27]。當(dāng)前的養(yǎng)殖環(huán)境中檢測(cè)到AOA的種類較少, 優(yōu)勢(shì)屬分別為屬、屬, 這與之前的研究中表明屬和屬是組成AOA群落主要的屬一致[28-30]。本研究結(jié)果顯示KMPS對(duì)二者的影響不同, 與對(duì)照組相比KMPS的投放降低了底泥中屬的豐度, 提升了屬的豐度; 但在2個(gè)處理組之間2個(gè)優(yōu)勢(shì)屬的相對(duì)豐度沒(méi)有顯著差異, 表明KMPS對(duì)AOA的影響與投放的方式關(guān)系不大。AOB微生物群落共由6個(gè)屬組成, 其中屬和屬為主要優(yōu)勢(shì)屬, 與之前對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘沉積物[31]和淡水湖沉積物[32]的研究類似。與對(duì)照組相比, KMPS的投放提升了屬的相對(duì)豐度, 降低了處理組A中屬的相對(duì)豐度。在2個(gè)處理組中, 處理組B中屬和屬的相對(duì)豐度均顯著高于處理組A中, 表明不僅是KMPS的投放與否, 投放的方式也會(huì)對(duì)AOB產(chǎn)生不同的影響, 低頻率高劑量KMPS投放對(duì)AOB具有促進(jìn)的作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次探究了KMPS投放對(duì)養(yǎng)殖底泥中氮素循環(huán)及氨氧化作用的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 不同的投放方式產(chǎn)生的影響有明顯的差別, 高頻率低劑量KMPS投放對(duì)底泥中AOA和AOB的生長(zhǎng)產(chǎn)生部分抑制作用, 使其不能夠滿足氮素轉(zhuǎn)化的需求, 而低頻率高劑量KMPS投放對(duì)AOA豐度沒(méi)有明顯影響, 對(duì)AOB群落生長(zhǎng)表現(xiàn)出積極的作用, 因此促進(jìn)硝化作用順利進(jìn)行。以上結(jié)果為KMPS可作用于底質(zhì)中氮素的降解提供了理論依據(jù), 同時(shí)為蝦類養(yǎng)殖環(huán)境改善提供了更多的可選擇辦法。

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Effects of potassium monopersulfate on the nitrification, abundance, and community structure of ammonia-oxidizing microorganisms in shrimp culture sediments

ZHAO Zhen1, 3, WANG Bao-jie1, 2, LIU Mei1, 2, 4, JIANG Ke-yong1, 2, WANG Lei1, 2, 4

(1. CAS Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China)

The effects of potassium monopersulfate (KMPS) on the nitrification of aquaculture substrates were investigated by adding KMPS into a simulated pond. To investigate the effects of KMPS on nitrogen conversion, ammonia nitrogen and nitrite nitrogen contents were measured. The contents of ammonia nitrogen and nitrite nitrogen in the low-frequency and high-dose groups were significantly decreased, whereas those in the high-frequency and low-dose groups were significantly increased. The application of high-frequency and low-dose KMPS reduced the abundance of ammonia-oxidizing archaea (AOA) and ammonia-oxidizing bacteria (AOB), whereas the application of low-frequency and high-dose KMPS increased the abundance of AOB in some periods. Further analysis of community structures showed that the relative abundance ofdecreased, whereas that ofincreased in AOA due to the application of KMPS; this change was independent of the application mode of KMPS. However, the AOB community was affected by the application mode of KMPS, and the relative abundance of dominant genera in AOB significantly increased under low-frequency and high-dose KMPS. These results indicate that the application of low-frequency and high-dose KMPS can promote sediment nitrification. This study can also open a new possibility for KMPS to be used for aquaculture sediment improvement.

Potassium monopersultate; nitrification;gene abundance; microbial community structure

Feb. 28, 2021

S968.22

A

1000-3096(2021)11-0054-08

10.11759/hykx20210228002

2021-02-28;

2021-03-23

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題(2019YFD0900401); 中國(guó)科學(xué)院科技支撐項(xiàng)目(2019T3035)

[Supported by National Key R&D Program of China, No. 2019YFD0900401; STS program supporting project of Chinese Aca-demy of Sciences of China, No. 2019T3035]

趙珍(1996—), 女, 黑龍江人, 碩士研究生, 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控的研究, E-mail: 15232168709@163.com; 王雷(1966—),通信作者, E-mail: leiwang@qdio.ac.cn

(本文編輯: 趙衛(wèi)紅)