乙基多殺菌素的液相色譜分析

楊寶萍，韋紅慧，韋元杰，李曉昀

(廣西速竟科技有限公司，廣西南寧 530007)

乙基多殺菌素，英文名稱：spinetoram，是放線菌刺糖多孢菌發(fā)酵產(chǎn)生的，是多殺菌素的換代產(chǎn)品，具生物農(nóng)藥的安全性和化學(xué)合成農(nóng)藥的速效性特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[1-2]。其原藥的有效成分是乙基多殺菌素-J和乙基多殺菌素-L的混合物(3∶1)，二者的殺菌生物活性無(wú)顯著差異[1]。分子式：乙基多殺菌素-J為 C42H69NO10，乙基多殺菌素-L為C43H69NO10[1]。

目前國(guó)內(nèi)有關(guān)乙基多殺菌素農(nóng)藥產(chǎn)品的分析方法尚未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道，導(dǎo)致乙基多殺菌素在農(nóng)藥監(jiān)督執(zhí)法中處于盲區(qū)?；诖?，本研究采用液相色譜技術(shù)開(kāi)展了60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑及25%水分散粒劑的分析研究以期為該藥劑產(chǎn)品質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)制定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品

60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑和25%乙基多殺菌素水分散粒劑，由美國(guó)陶氏益農(nóng)公司提供。

1.2 試劑和溶液

甲醇，色譜純；乙醇，色譜純；水，超純水；乙酸銨；乙酸銨溶液：稱取2 g的乙酸銨，溶于1 000 mL超純水中，超聲波振蕩10 min；乙基多殺菌素標(biāo)樣：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù) 97.3%，德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司提供。

1.3 儀器設(shè)備

1260高效液相色譜儀具有二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器和色譜工作站(美國(guó)安捷倫公司)；色譜柱：250 mm×4.6 mm(i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)裝 C18、5 μm填充物；低有機(jī)物型超純水機(jī)。

1.4 高效液相色譜分析條件

流動(dòng)相：ψ(甲醇∶乙腈∶乙酸銨溶液)＝45∶45∶10 (體積比)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；進(jìn)樣體積：5 μL；在此色譜條件下，乙基多殺菌素的保留時(shí)間：乙基多殺菌素-J約17.5 min，乙基多殺菌素-L約20.4 min，乙基多殺菌素標(biāo)樣及樣品典型液相色譜圖見(jiàn)圖1-3。

圖1 乙基多殺菌素標(biāo)樣的液相色譜圖

圖2 60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑的液相色譜圖

圖3 25%乙基多殺菌素水分散粒劑的液相色譜圖

1.5 測(cè)定步驟

1.5.1 標(biāo)樣溶液的制備

稱取50.0 mg (精確至0.1 mg)乙基多殺菌素標(biāo)樣于50 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫，用甲醇定容，搖勻。

1.5.2 試樣溶液的制備

稱取含50.0 mg (精確至0.1 mg)乙基多殺菌素的試樣于50 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫，用甲醇定容，搖勻，過(guò)濾。

1.5.3 測(cè)定

在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針乙基多殺菌素(J+L)峰面積相對(duì)變化小于1.2%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

1.5.4 計(jì)算

將測(cè)得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中乙基多殺菌素(J+L)峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中乙基多殺菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω(%)，按公式(1)計(jì)算：

式中：A1為標(biāo)樣溶液中乙基多殺菌素(J+L)峰面積的平均值；A2為試樣溶液中乙基多殺菌素(J+L)峰面積的平均值；m1為乙基多殺菌素標(biāo)樣的質(zhì)量，單位為克(g)；m2為試樣的質(zhì)量，單位為克(g)；ω1為標(biāo)樣中乙基多殺菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以%表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

乙基多殺菌素的紫外掃描光譜圖如圖4所示，從圖中可以看到乙基多殺菌素的最大吸收波長(zhǎng)約245 nm，在該波長(zhǎng)處?kù)`敏度較高，干擾較少，能夠滿足分析的要求，故將檢測(cè)波長(zhǎng)確定為245 nm。

圖4 乙基多殺菌素的紫外光譜圖

色譜柱選擇常用的 C18反相柱。根據(jù)乙基多殺菌素物化性質(zhì)和溶劑的紫外吸收波長(zhǎng)，選擇甲醇作為溶劑溶解樣品。先用甲醇或乙腈和水作為流動(dòng)相，未見(jiàn)有色譜峰。在以甲醇或乙腈和乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，保留時(shí)間較長(zhǎng)，且出峰效果沒(méi)有用甲醇+乙腈+乙酸銨溶液作為流動(dòng)相的好。故選擇甲醇+乙腈+乙酸銨溶液作為流動(dòng)相。先分別選用不同比例的甲醇、乙腈和2%乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)有雜質(zhì)峰干擾乙基多殺菌素，峰純度達(dá)不到試驗(yàn)要求。故再分別選用不同比例的甲醇、乙腈和0.2%乙酸銨溶液作為流動(dòng)相。將流動(dòng)相按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，隨著甲醇和乙腈比例的增加，保留時(shí)間減小，當(dāng)甲醇、乙腈與0.2%乙酸銨溶液比例達(dá)到45∶45∶10時(shí)，乙基多殺菌素色譜峰與各雜質(zhì)完全分離，峰純度達(dá)到試驗(yàn)要求，最終選擇Ψ(甲醇∶乙腈∶0.2%乙酸銨溶液)=45∶45∶10作為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min。該條件下，乙基多殺菌素色譜峰峰形較好，與雜質(zhì)能完全分離，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，并且分析時(shí)間較短，提高了工作效率。

2.2 特異性試驗(yàn)

本試驗(yàn)采用HPLC-DAD峰純度分析法來(lái)鑒別乙基多殺菌素。乙基多殺菌素標(biāo)樣、60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑和 25%乙基多殺菌素水分散粒劑中的乙基多殺菌素HPLC-DAD峰純度均大于990，有效成分處無(wú)其他物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。峰純度色譜圖見(jiàn)圖5-7。

圖5 乙基多殺菌素標(biāo)樣HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖6 乙基多殺菌素懸浮劑HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖7 乙基多殺菌素水分散粒劑HPLC-DAD峰純度色譜圖

2.3 線性關(guān)系試驗(yàn)

按1.5.1節(jié)分別配置5個(gè)不同質(zhì)量濃度的乙基多殺菌素標(biāo)樣溶液，在相應(yīng)色譜操作條件下進(jìn)行分析，以乙基多殺菌素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)。當(dāng)乙基多殺菌素質(zhì)量濃度為178.4~1 872.8 mg/L，得到線性方程為y=4.41x-52.17，線性相關(guān)系數(shù)R=1.00。

圖8 乙基多殺菌素峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系圖

2.4 方法精密度試驗(yàn)

按 1.5.2節(jié)試樣溶液的制備方法分別配制 5個(gè)60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑和5個(gè)25%水分散粒劑溶液。以線性關(guān)系試驗(yàn)中860.9 mg/L乙基多殺菌素溶液為標(biāo)樣溶液，在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1、2。可以看出懸浮劑和水分散粒劑測(cè)定結(jié)果的RSD分別為 0.19%和0.34%，分別小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=2.05和1.67，說(shuō)明分析方法精密度的結(jié)果符合質(zhì)量控制的基本要求。

表1 60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)

稱取含25.0 mg (精確至0.1 mg)乙基多殺菌素的60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑和25%水分散粒劑于50 mL容量瓶中各5份，分別加入乙基多殺菌素標(biāo)樣25.0 mg，按1.5.2節(jié)的方法配制有效成分準(zhǔn)確度溶液各5份。以線性關(guān)系試驗(yàn)中860.9 mg/L乙基多殺菌素溶液為標(biāo)樣溶液，計(jì)算乙基多殺菌素的回收率，結(jié)果見(jiàn)表3、4。懸浮劑和水分散粒劑中乙基多殺菌素平均回收率分別為 101%、100%，具有良好的準(zhǔn)確度。

表2 25乙基多殺菌素水分散粒劑精密度試驗(yàn)結(jié)果

表3 60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 25%乙基多殺菌素水分散粒劑回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

通過(guò)試驗(yàn)表明，采用本方法測(cè)定60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑和25%乙基多殺菌素水分散粒劑的有效成分，線性關(guān)系良好，精密度、準(zhǔn)確度高，分離效果好，并且操作簡(jiǎn)便、快速，是產(chǎn)品日常檢驗(yàn)較為理想的分析方法。